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Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle bzw.
Nukleinsäuremolekülkombinationen
sowie Verfahren zum Nachweis von Pflanzenmaterial in einer Probe,
bei denen besagte Nukleinsäuremoleküle als Sonden
mit Pflanzen-DNA hybridisieren. Ferner betrifft die vorliegende
Erfindung einen die besagten Sonden enthaltenden Nachweis-Kit und
die Verwendung dieser Sonden zum Nachweis von Pflanzenmaterial oder
pflanzlichen Bestandteilen in Proben.
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Der Analytik von Pflanzenmaterial
kommt im Zeitalter der Biotechnologie eine wachsende Bedeutung zu.
Dies ist auf das neu entstandene Spannungsfeld zwischen den nahezu
unbegrenzten Möglichkeiten
zur Erzeugung gentechnisch veränderter
Pflanzen und den Ängsten
sowie dem wachsendem Informationsbedarf der Bevölkerung zurückzuführen.
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Obwohl der Verbraucher die Inhaltsstoffe
den Verpackungen vieler Lebensmittel vermeintlich entnehmen kann,
besteht ein wachsendes Bedürfnis,
diese Angaben im Sinne des Verbraucherschutzes und des Informationsbedürfnisses
des kritischen Konsumenten, bezüglich
der Inhaltsstoffe von Produkten durch unabhängige Institutionen und mit
größter Genauigkeit
zu überprüfen. Auch
für die
Hersteller von Lebensmitteln ist die Überprüfung der Rohmaterialien zur
Qualitätssicherung
und zur Sicherung des Vertrauens der Verbraucher unabdingbar. Die
Notwendigkeit einer unabhängigen
Lebensmittelanalytik spiegelt sich in den Gesetzen und Verordnungen
vieler Länder
sowie in den Qualitätssicherungslaboren
der Hersteller wieder.
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Angesichts der Vielzahl von Lebensmittelkomponenten
ist es jedoch problematisch, die geeigneten analytischen Verfahren
auszuwählen.
Klassische Verfahren wie z.B. das Wägen kommen nur bei Lebensmitteln
in Betracht, die aus leicht trennbaren pflanzlichen Bestandteilen
zusammengemischt wurden. Bei stark durchmengten Proben, wie z.B.
Breien, Suspensionen oder vielen Fertiggerichten bedarf es der Molekularanalytik,
um die Identität
der Komponenten zu ermitteln.
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Eine solche anforderungsgerechte
Molekularanalytik sollte sensitiv, spezifisch, praktikabel und in
der routinemässigen
Durchführung
preisgünstig
sein. Diese Kriterien werden letztendlich nur durch die genetische Analyse
von Lebensmitteln erfüllt.
Als besonders gut geeignet für
eine universelle Analyse von phylogenetischen Pflanzeneinheiten
sowie von natürlichen
Mutationen oder rekombinant eingeführten Veränderungen hat sich die Polymerase-Ketten-Reaktion
(PCR)herausgestellt.
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Die Polymerase-Kettenreaktion ("polymerase chain
reaction", PCR;
Mullis et al.,
US 4 683 195 ,
US 4 683 202 ,
US 4 965 188 ) ist eine schnelle und
effektive Methode, Pflanzen spezifisch nachzuweisen. Es sind eine
Reihe Nukleinsäuremoleküle bekannt,
durch deren Verwendung als Primen und/oder Sonden der spezifische
Nachweis von Pflanzen möglich
ist. Nachteilig ist jedoch, daß bei
Einsatz dieser Nukleinsäuremoleküle in einer
Amplifikations- bzw. Detektionsreaktion immer nur ein Bruchteil
aller möglichen
Pflanzen nachgewiesen werden kann. Diese PCR Systeme dienen zum
spezifischen Nachweis jeweils nur einzelner Arten und Gattungen
in einer Amplifikationsreaktion.
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PCR-Nachweissysteme dienen auch dem
Nachweis bestimmter genetischer Variationen eines Lebensmittelbestandteiles,
z.B. dem Nachweis von Mais Bt176 oder Round-up-Ready-Soja. Andere PCR-Systeme sind
zur Erkennung von einzelnen Pflanzenarten oder Pflanzenvarianten
ausgelegt.
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Der Nachweis einer spezifische Mutation
oder eines bestimmten Allels durch PCR bedarf jedoch immer einer
Kontrolle. Eine solche weist die Funktionsfähigkeit des Nachweisverfahrens
nach, das beispielsweise durch eventuell in der Probe vorhandene
Inhibitoren beeinträchtigt
werden kann. Im Idealfall ermöglicht
die Kontrollreaktion nicht nur eine Aussage über das Funktionieren der Nachweisreaktion,
sondern auch eine Quantifizierung des Pflanzenmaterials.
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Es ist insbesondere unter ökonomischen
wie auch Verfahrensgesichtspunkten vorteilhaft, dass ein solches
Kontrollverfahren für
eine Vielzahl spezifischer PCR-Nachweissysteme
einsetzbar ist.
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Gerade für den Nachweis von pflanzlichen
Bestandteilen ist eine möglichst
universelle Spezifität
auf Pflanzen erwünscht,
die möglichst
keinerlei Einschränkungen
auf spezifische Arten oder Gattungen erfährt.
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Es war daher die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, Nachweisverfahren zur Verfügung zu stellen, die Pflanzenmaterial
größerer taxonomischer
Einheiten aus dem Reich der Pflanzen, insbesondere phylogenetische
Gruppen wie Familien, Ordnungen, Klassen oder z.B. nahezu alle Pflanzen
in beliebigen biologischen Proben detektieren.
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Diese Aufgabe wurde mittels mehrerer
Nukleinsäuremoleküle gelöst, die
vom Chloroplastengenom, insbesondere vom tRNA-Leucin-Gen des Chloroplastengenoms,
abgeleitet sind.
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Bevorzugte Nukleinsäuren der
vorliegenden Erfindung sind solche, die ausgewählt sind aus:
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- (i) einer Nukleinsäure mit mindestens einer der
in SEQ ID NO 3-6 angegebenen Sequenzen;
- (ii) einer Nukleinsäure
mit einer Sequenz, die mindestens 80% Identität, vorzugsweise mindestestens
90% Identität,
besonders bevorzugt mindestens 95% Identität, am meisten bevorzugt mindestens
98% Identität mit
einer der in (i) angegebenen Nukleinsäuren aufweist;
- (iii) einer Nukleinsäure,
die mit einer der in (i) oder (ii) angegebenen Nukleinsäuren hybridisiert;
- (iv) einem durch Substitution, Addition und/oder Deletion einer
oder mehrerer Basen erhaltenes Derivat einer der in (i), (ii) oder
(iii) angegebenen Nukleinsäuren;
- (v) einem Fragment einer der in (i) bis (iv) angegebenen Nukleinsäuren, das
mit dem gleichen Genabschnitt der Chloroplasten-DNA wie die unter
(i) angegebenen Nukleinsäuren
hybridisiert;
- (vi) einer Kombination mehrerer der in (i) bis (v) angegebenen
Nukleinsäuren,
wobei die Nukleinsäuren gleich
oder verschieden sein können.
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Vorzugsweise sind solche Nukleinsäuremoleküle eine
DNA oder eine RNA, besonders bevorzugt eine PNA.
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Das Merkmal „Nukleinsäure" oder „Fragment einer Nukleinsäure", die mit einer der
anderen Nukleinsäure,
beispielsweise mit einer der in SEQ ID NOs 3-6 oder den unter (i)
bis (v) angegebenen Nukleinsäuren hybridisiert,
weist auf eine Nukleinsäuresequenz
hin, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang einer
Nukleinsäure
mit den in (i) bis (vi) angegebenen Merkmalen hybridisiert. Beispielsweise
können
die Hybridisierungen bei 68°C
in 2 × SSC
oder nach dem Protokoll des Dioxygenin-Labelling-Kits der Firma Boehringer (Mannheim)
durchgeführt
werden. Ein weiteres Beispiel für
stringente Hybridisierungsbedingungen sind z.B. Inkubation bei 65°C über Nacht
in 7% SDS, 1% BSA, 1 mM EDTA, 250 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2)
und nachfolgendes Waschen bei 65°C
mit 2 × SSC;
0,1% SDS.
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Die Sequenzen der bevorzugten Nukleinsäuren sind
die folgenden
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Der dem Fachmann bekannte Ausdruck „% Identität" bezeichnet den Grad
der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuremolekülen, der
durch die Übereinstimmung
zwischen den Sequenzen bestimmt wird. Der Prozentsatz der „Identität" ergibt sich aus
dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen
unter Berücksichtigung
von Lücken
oder anderen Sequenzbesonderheiten.
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Die Identität miteinander verwandter Nukleinsäuremoleküle kann
mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden. In der Regel werden
spezielle Computerprogramme mit den besonderen Anforderungen Rechnung
tragenden Algorithmen eingesetzt. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung
der Identität
erzeugen zunächst
die größte Übereinstimmung
zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung
der Identität
zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
das GCG-Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et
al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer
Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN und
FASTA (Altschul, 5. et al, J. Molec Biol 215: 403/410 (1990)). Das
BLAST X Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information
(NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLÄST Handbuch,
Altschul 5., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, 5.,
et al., J. Mol. 215: 403/410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus
kann zur Bestimmung von Identität
verwendet werden.
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Bevorzugte Parameter für den Sequenz-Vergleich
umfassen die nachstehenden:
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Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung
mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter
sind die Standardparameter (default parameters) für Nukleinsäuresequenz-Vergleiche.
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Weitere beispielhafte Algorithmen,
Lücken-Offnungs-Werte
(gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte
(gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der
im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997,
genannten können
verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden
Vergleich abhängen
und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei
GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und
einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt
sind, durchgeführt
wird.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Moleküle werden
vorzugsweise nach gängigen
Verfahren synthetisch hergestellt, können aber auch aus geeigneten
DNA-Bibliotheken oder anderen öffentlich
zugänglichen Quellen
von Nukleinsäuren
isoliert und ggf. anschließend
mutiert werden. Die Herstellung solcher Bibliotheken bzw. Mutationen
ist dem Fachmann ebenfalls bekannt.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle sind
als Sonden für
den Nachweis von pflanzlichen Bestandteilen in Proben und als Kontrolle
für den
PCR-Nachweis von spezifischen Pflanzenarten und Gattungen sowie
spezifischen genetischen Abwandlungen davon geeignet. Besagte Nukleinsäuren haben
sich als außerordentlich
praxistauglich und universell einsetzbar erwiesen. Ihre Sequenzen
bzw. Gegenstränge
sind in Pflanzen derart konserviert, daß sie im Vergleich zu herkömmlichen
Sonden für
Pflanzen den gleichzeitigen Nachweis aller oder der meisten Mitglieder
einer höheren
taxonomischen Einheit ermöglichen.
Dabei sind sie jedoch so spezifisch, dass die ggf. im Überschuss
vorliegende Fremd-DNA die Nachweisreaktion nicht beeinträchtigt.
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Zudem ermöglichen diese einen so sensitiven
PCR-Nachweis, dass es machbar ist, auch unter den erschwerten Bedingungen
von komplex zusammengesetzten (heterogenen) Proben, wie sie bei
Lebensmitteln oder Umweltproben vorliegen, wenige Moleküle nachzuweisen.
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Durch das Vorhandensein von Nukleasen
sowie durch Verluste bei der Nukleinsäureisolierung und/oder Aufreinigung
gehen viele der zu untersuchenden Probe vorhandenen Nukleinsäurezielmoleküle für die Analyse
verloren. Vorteilhafterweise kommen das Chloroplastengenom, bzw.
dessen Transkripte in mehreren Kopienzahlen vor.
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Überraschender
Weise lassen sich Chloroplasten mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren äußerst sensitiv
nachweisen. Aus diesem Grunde sind Primer in Kombination mit den
erfindungsgemäßen Sonden,
die von der Chloroplasten-DNA abgeleitet sind, insbesondere den
in SEQ ID No 1-6 angegebenen Sonden und Primen, sehr gut geeignet,
Pflanzen in Lebensmitteln nachzuweisen.
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Zusammenfassend kann somit festgestellt
werden, daß mit
den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beliebiges
Pflanzenmaterial nahezu universell über die Amplifikation mit geeigneten
Primern sensitiv nachgewiesen werden kann.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren werden
bevorzugt in Kombination eingesetzt. Besonders bevorzugte Kombinationen
enthalten mindestens zwei Nukleinsäuremolekülen, ausgewählt aus:
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- (1) einer Kombination aus mindestens zwei Nukleinsäuremolekülen der
oben genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle.
- (2) einer Kombination der Nukleinsäuren mit den in SEQ ID NO 3
und 4 oder den in SEQ ID NO 5 und 6 oder den in SEQ ID NO 3, 4,
5 und 6 angegebenen Sequenzen;
- (3) einer Kombination von Nukleinsäuren, die mit den in SEQ ID
NO 3 und 4 oder den in SEQ ID NO 5 und 6 oder den in SEQ ID NO 3,
4, 5 und 6 angegebenen Sequenzen hybridisiert.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
sind die als Sonden verwendbaren erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur
Erzeugung eines nachweisbaren Signals modifiziert bzw. markiert
ist, wobei die Modifikation bzw. Markierung ausgewählt ist
aus:
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- (i) radioaktiven Gruppen,
- (ii) farbigen Gruppen,
- (iii) fluoreszierenden Gruppen,
- (iv) Gruppen zur Immobilisierung an einer festen Phase und
- (v) Gruppen, die eine indirekte oder direkte Reaktion, vorzugsweise
mit Antikörpern,
Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen
oder Enzymkomplexen eingehen können.
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Bevorzugte radioaktive Gruppen als
nachweisbares Signal sind 14C, 3H 355, 32P 33P.
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Des weiteren bevorzugt sind farbige
Gruppen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, wobei die Fluoreszenzfarbstoffe
Light Cycler Red 640°,
Light Cycler Red 720° oder
Fluoreszein am meisten bevorzugt sind.
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Beispielhafte sowie bevorzugte farbig
modifizierte Nukleinsäuren
sind
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LC Red640 = Fluoreszenzfarbstoff
LightCycler Red 640, X = Fluoreszein, p = Phosphat-Rest.
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Die erfindungsgemäße Nukleinsäuren können unterschiedliche Längen aufweisen.
Mit der Länge steigt
normalerweise die Spezifität
der Sonden, jedoch sind längere
Sequenzen aufwendiger in der Herstellung. Es hat sich jedoch in
Bezug auf die Spezifität
und die Wirtschaftlichkeit als vorteilhaft erwiesen, dass die Nukleinsäuren mindestens
10, vorzugsweise 15-30 Nukleotide aufweisen.
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In einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Pflanzenmaterial
in einer Probe, bei dem die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eingesetzt
werden.
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Vorzugsweise umfasst ein solches
Verfahren die folgenden Schritte.
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- (a) Inkontaktbringen der Probe mit einer Kombination
aus mindestens zwei ersten Nukleinsäuremolekülen (Primern), die mit einem
in Pflanzen konservierten Bereich des tRNA-Leucin-Gens der Chloroplasten
DNA hybridisieren,
- (b) Amplifizieren der pflanzlichen Nukleinsäure oder eines Teils derselben
zur Erzeugung von nndestens einem Amplifikationsfragment;
- (c) Inkontaktbringen der in Schritt (b) erhaltenen Amplifikationsfragmente
mit mindestens einem zweiten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül (Sonde),
welches mit mindestens einem Amplifikationsfragment des Schritts
(b) spezifisch hybridisiert; und
- (d) Nachweis von mindestens einer Hybridnukleinsäure, die
aus einem Amplifikationsfragment und einem im Schritt (c) eingebrachten
zweiten Nukleinsäuremolekül besteht.
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Vorzugsweise wird in dem oben genannten
Verfahren in Schritt (c) eine erfindungsgemäße Kombination aus Nukleinsäuremolekülen verwendet
wird.
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In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die zu untersuchende Probe mit einer Kombination aus mindestens
zwei ersten Nukleinsäuremolekülen (Primern)
in Kontakt gebracht. Diese Nukleinsäuremoleküle hybridisieren vorzugsweise
mit einem Bereich einer pflanzlichen Nukleinsäure, der im Chloroplastengenom,
insbesondere in dem tRNA-Leucin-Gen des Chloroplastengenoms konserviert
ist. Die Hybridisierung erfolgt durch Paarung der Primen mit Bereichen
der pflanzlichen Nukleinsäure,
die eine zumindest teilweise komplementäre Basensequenz aufweisen.
Durch den Begriff "konserviert" wird die evolutionäre Variabilität von Nukleotidsequenzen
für Spezies
verschiedener taxonomischer Einheiten charakterisiert. Vergleicht
man entsprechende Sequenzabschnitte von mindestens zwei beliebigen
Pflanzen, so kann die Sequenz als variabel oder als konserviert
angesehen werden.
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Die im ersten Schrέtt (a)
des erfindungsgemäßen Verfahrens
eingesetzte Kombination aus mindestens zwei ersten Nukleinsäuremolekülen wird
so gewählt,
daß sie
als Primer in einer Amplifikationsreaktion einsetzbar sind, d.h.
ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert
an einen ersten konservierten Bereich des ersten Stranges der Ziel-DNA
und das andere Nukleinsäuremolekül an einen
zweiten konservierten Bereich des zum ersten komplementären DNA-Stranges,
wobei der gewünschte
Zielbereich der DNA eingeschlossen wird. Beide Nukleinsäuremoleküle weisen
eine Länge
von vorzugsweise mindestens 10 bp, besonders bevorzugt 15-30 bp
auf.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird eine Kombination aus mindestens zwei Nukleinsäuremolekülen gemäß dieser
Erfindung eingesetzt.
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Bezüglich der zu verwendenden Primen
müssen
nicht ganz so hohe Masstäbe
angelegt werden wie bei den Sonden, da auch bei einem oder zwei
Nukleotiden Abweichungen („mismatch") in der Zielsequenz
die Amplifikation meist noch erfolgreich verläuft. Deshalb können eventuell
auch andere vor dem 5"-Ende
gelegene Hin-, bzw. hinter dem 3'-Ende
gelegene Rückwärts-Primen
verwendet werden. Besonders bevorzugte Primen sind in SEQ ID 1 & 2 dargestellt.
Alternative bevorzugte Primen sind die in SEQ ID 7-10 (Vorwärtsprimen) und
die in SEQ ID 11-27 (Rückwärtsprimer)
dargestellten.
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Die bevorzugten Primen amplifizieren
PCR-Produkte für
den Nachweis durch die erfindungsgemäßen Sonden in optimaler Länge. Ein
weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Sonden und Primen liegt
in deren wechselseitiger „Kompatibilität". Dies bedeutet,
dass diese untereinander keine Oligonukleotid-Dimere bilden, die
die Sensitivität,
oder überhaupt
das Funktionieren der PCR beeinträchtigen.
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Darüber hinaus wurde überraschender
Weise festgestellt, dass Oligonukleotidkombinationen der SEQ ID
1-6 auch in komplexen PCR-Reaktionen, die eine Vielzahl weiterer
Primen und/oder Sonden enthalten, sehr gut pflanzliche Bestandteile
nachweisen, ohne dass störende
Nukleotid-Dimere gebildet werden.
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Beispielsweise lassen sich die Primen
und Sonden der SEQ ID 1-6 mit PCR- Nachweissystemen für gentechnisch veränderten
Mals (bt176) oder gentechnisch veränderte Soja kombinieren.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
wird in Schritt (a) mindestens ein Nukleinsäuremolekül verwendet wird, das ausgewählt ist
aus:
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- (i) einer Nukleinsäure mit mindestens einer der
in SEQ ID NO 1, 2, 7-27 angegebenen Sequenzen;
- (ii) einer Nukleinsäure
mit einer Sequenz, die mindestens 80% Identität, vorzugsweise mindestestens
90% Identität,
besonders bevorzugt mindestens 95 Identität, am meisten bevorzugt mindestens
98% Identität
mit einer der in (i) angegebenen Nukleinsäuren aufweist;
- (iii) einer Nukleinsäure,
die mit einer der in (i) oder (ii) angegebenen Nukleinsäuren hybridisiert;
- (iv) einem durch Substitution, Addition und/oder Deletion einer
oder mehrerer Basen erhaltenes Derivat einer der in (i), (ii) oder
(iii) angegebenen Nukleinsäuren;
- (v) einem Fragment einer der in (i) bis (iv) angegebenen Nukleinsäuren, das
mit dem gleichen Genabschnitt der Chloroplasten-DNA wie die unter
(i) angegebenen Nukleinsäuren
hybridisiert;
- (vi) eine Kombination mehrerer der in (i) bis (v) angegebenen
Nukleinsäuren,
wobei die Nukleinsäuren gleich
oder verschieden sein können.
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Die Sequenzen der bevorzugten Nukleinsäuren zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens sind
die folgenden:
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Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, kann
es sich als vorteilhaft erweisen, je nach vorliegendem Pflanzenmaterial
diese wie folgt zu ergänzen:
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N = optionales zusätzliches
Nukleotid G, A, T, C, U oder I (Inosin) Zudem ist es vorteilhaft
die Primen jeweils so auszuwählen,
dass die in der PCR entstehenden Amplifikate möglichst kleiner als 1000 bp
sind. Besonders vorteilhaft sind Amplifikate von unter 400 bp Länge, denn
in diesem Fall ist die Amplifikation von Oligonukleotiden unter „erschwerten
Bedingungen", die
bei unreinen Proben, wie Lebensmitelproben, Fleisch-, Blut-, Pflanzen-Extrakten
etc. vorliegen, besonders zuverlässig.
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Die SEQ IDs 7-10 können als
Vorwärtsprimen
und die SEQ IDs 11-27 als Rückwärtsprimer
eingesetzt werden.
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Zudem kann es vorteilhaft sein, Fragmente
der SEQ IDs 7-27 in einer Grösse
von 14-19 Nukleotiden Länge
zu verwenden.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform
haben die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Primen eine Länge
von 15-40 bp.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird in Schritt (a) mindestens ein Nukleinsäuremolekül verwendet wird, das ausgewählt ist
aus:
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- (a) einer Nukleinsäure mit mindestens einer der
in SEQ ID NO 1 oder 2 angegebenen Sequenzen; oder
- (b) einer nach Anspruch 10 (ii) bis (vi) abgeleiteten Nukleinsäure einer
der in SEQ ID NO 1 oder 2 angegebenen Sequenzen.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren
in Schritt (a) die Nukleinsäuren
mit den in SEQ ID NO 1 und/oder 2 angegebenen Sequenzen und im Schritt
(b) mindestens zwei der Nukleinsäuren
mit den in SEQ ID NO 3-6 angegebenen Sequenzen verwendet werden.
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Solche Oligonukleotide hybridisieren
besonders put unter PCR-Bedingungen mit dem Transfer-RNA-Gen für Leucin
(tRNA-Leu oder trnL) mit dem Anticodon UAA.
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In einem zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die pflanzliche Nukleinsäure
oder ein Teil derselben amplifiziert, wodurch mindestens ein Amplifikationsfragment
erzeugt wird. Unter Amplifikation wird die Erhöhung der Konzentration einer
in einem Reaktionsgemisch vorliegenden Nukleinsäure oder eines Teils derselben
verstanden. Eingesetzte Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren sind
z.B. die PCR (
US 4 683 195 ,
US 4 683 202 ,
US 4 965 188 ), die "self-sustalned sequence
replication" (
EP 329 822 ), das "transcription based
amplification system" (
EP 310 229 ) und das "β-RNA-Replicase-System" (
US 4 957 858 ).
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfaßt
das Amplifizieren eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfaßt
das Amplifizieren eine Ligasen-Kettenreaktion oder eine isotherme
Nukleinsäureamplifikation.
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In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt der Amplifikationsschritt (b) mittels einer Polymerasekettenreaktion
(PCR), bei der
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- (a) maximal 4 Temperaturschritte verwendet
werden,
- (b) keine Temperaturrampe länger
als 45 s dauert,
- (c) kein Temperaturschritt länger
als 30 s dauert,
- (d) ein PCR-Zyklus kürzer
als 60 s ist,
- (e) und/oder die gesamte Polymerasekettenreaktion, die alle
notwendigen PCR-Zyklen
umfasst, kürzer
als 80 min ist.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
der Amplifikationsschritt (b) mittels einer Hot-Start-Polymerasekettenreaktion
(PCR). Bei einer solchen Hot Start PCR wird die hitzebeständige DNA-Polymerase
oder reverse Transkriptase vor dem Start der Polymerase-Reaktion
durch Antikörper
oder inhibierende Substrate gehemmt wird und durch Erhitzen, vorzugsweise
auf über 60°C; aktiviert.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch zum quantitativen
Nachweis von pflanzlichen Materialien geeignet. Solche quantitativ
durchgeführten
Verfahren sind eine bevorzugte Ausführungsform.
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Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Verfahren,
bei denen der quantitative Nachweis als Echtzeit oder online-PCR
durchgeführt
wird. Hierbei ist es vorteilhaft zur Online-Detektion Fluoreszenz-markierte
Sonden zu verwenden. Beispielsweise können diese zwei benachbarte
LightCycler-Sonden sein, TagMan-Sonden oder eine andere mit einem
Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonde. Auch ist es möglich interkalierende
Fluoreszenzfarbstoffe zur Detektion zu verwenden.
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Eine quantitative PCR ist eine Polymerase-Kettenreaktion,
die eine Aussage über
die Menge der in einer Probe vorhandenen Nukleinsäure-Zielmoleküle erlaubt.
Ausserdem kann über
die so ermittelte Nukleinsäuremenge
in bestimmten Fällen
auf die Menge an ursprünglich
vorhandenem Zellmaterial, wie Pflanzenmaterial, Fleisch, Blut etc.
zurückgeschlossen
werden.
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Insbesondere beim quantitiven Nachweis
von Pflanzenmaterial, und optional beim qualitativen Nachweis, kann
die PCR als Echtzeit oder online-PCR durchgeführt werden. Bei einer solchen
experimentellen Durchführung
wird der Ablauf der Amplifikationsreaktion in Echtzeit verfolgt.
Dabei werden bei positiven Testbefunden sigMolde Signalkurven gemessen,
beispielsweise solche wie in den 1 und 2. Einige charakterische
Punkte solcher Kurven, wie z.B. der Wendepunkt oder die Eintritts-
oder Austrittsphase in den exponentiellen Verlauf, weisen eine sehr
gute Korrelation zur ursprünglichen
Kopienzahl der Proben-Nukleinsäure (Template)
auf.
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In einem dritten Schritt des Verfahrens
(c) gemäß der vorliegenden
Erfindung werden die erhaltenen Amplifikationsfragmente mit mindestens
einem zweiten Nukleinsäuremolekül (Sonde)
in Kontakt gebracht. Dieses Nukleinsäuremolekül bzw. diese Nukleinsäure moleküle hybridisieren
spezifisch mit mindestens einem Ampliflkationsfragment, das eine
Sequenz des Pflanzenmaterials umfaßt, die für viele oder die meisten Pflanzen
oder für
eine oder mehrere Familien, Gttungen oder Arten von Pflanzen spezifisch
ist, d.h. in Mitgliedern dieser Familien oder Gattungen bzw. in
diesen Arten vorkommt.
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Als Hybridiserung wird die Doppelstrangbildung
zweier identischer oder ähnlicher
Nukleotidfragmente (DNA, RNA, PNA) bezeichnet. Von spezifischer
Hybridisierung spricht man, wenn eine stabile Hybridnukleinsäure zwischen
dem Oligonukleotid und der entsprechenden Ziel-DNA des Oligonukleotides
besteht, nicht jedoch zu anderer DNA als der Ziel-DNA. Im Sinne
dieser Erfindung weist das Merkmal "Sequenz, die mit einer Sequenz nach
(i) spezifisch hybridisiert" auf
eine Sequenz hin, die unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz
nach (i) hybridisiert. Beispielsweise können die Hybridisierungen bei
50°C mit
einer Hybridisierungslösung
bestehend aus 2,5 × SSC,
2 × Denhardts
Lösung,
10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,5 durchgeführt werden. Als Waschbedingungen
eignen sich z.B. viermal wiederholte 1minütige Waschungen in 0,1 × SSC bis
1,0 × SSC,
2 × Denhardts,
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6 bei 20-50°C.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird als zweites Nukleinsäuremolekül (Sonde) ein oder mehrere
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle eingesetzt.
Als Consensus-Sonde wird ein Nukleinsäuremolekül verstanden, das mit hochkonservierten
Bereichen einer pflanzlichen Nukleinsäure hybridisiert und mit den
Amplifikaten sämtlicher
Pflanzenbestandteile reagiert. Erfindungsgemäße, als Consensus-Sonden verwendbare
Nukleinsäuremoleküle, weisen
eine Sequenz nach einer der SEQ ID NO 3 – 6 auf.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das zweite Nukleinsäuremolekül (Sonde) so modifiziert bzw.
markiert, daß es
ein nachweisbares Signal erzeugen kann. Die Modifikation bzw. Markierung wird
ausgewählt
aus (i) radioaktiven Gruppen (ii) farbigen Gruppen, (iii) fluoreszierenden
Gruppen, (iv) Gruppen zur Immobilisierung an einer festen Phase
und (v) Gruppen, die eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere
mit Hilfe von Antikörpern,
Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen
oder Enzymkomplexen erlauben.
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Als Markierung werden im Sinne dieser
Erfindung direkt oder indirekt nachweisbare Gruppen oder Gruppen
zur Immobilisierung an eine feste Phase bezeichnet, die an das Nukleinsäuremolekül angehängt sind.
Direkt nachweisbar sind Metallatome, radioaktive, farbige oder fluoreszierende
Gruppen. Indirekt nachweisbar sind immunologisch oder enzymatisch
nachweisbare Gruppen, wie z.B. Antigene und Antikörper, Haptene
oder Enzyme oder enzymatisch wirkende Teile von Enzymen. Diese indirekten
Gruppen werden in nachfolgenden Reaktionen nachgewiesen. Bevorzugt
sind Haptene, die an ein Oligonukleotid gekoppelt sind und die man
in einer anschließenden
Antikörperreaktion
nachweist.
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Zudem gibt es viele andere Möglichkeiten
der Signalerzeugung, wie z.B. interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe
oder TagMan-Sonden, das Messen von elektrischen Feldern von Homo-
oder Hetero DNA/DNA bzw. DNA/RNA Duplexmolekülen in der Oberflächenresonanzspektroskopie
(SPR) oder verwandte Verfahren.
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Durch die Koppelung von zwei benachbarten
Sonden mit Fluoreszenzfarbstoften kann ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
(FRET) erreicht werden. Die erfindungsgemäßen Sonden können beispielsweise
so mit Fluoreszenzfarbstoften gekoppelt worden, dass ein FRET zwischen
zwei benachbarten Sonden möglich
ist. Das entstehende Fluoreszenzsignal verhält sich in seiner Intensität während eines
Teils der Amplifikationsphase proportional zur Kopienzahl der Amplifikate.
Bei der Entwicklung einer Realtime-PCR kommt den Sonden insofern
eine herausragende Bedeutung zu, als dass ihre zuverlässige Bindung
an die Zielsequenz die Stärke
und Zuverlässigkeit
des Signals bestimmt. Demzufolge wurde auch ein hoher Entwicklungsaufwand
betrieben, um Sonden zu finden, deren Sequenzen besonders gut zu
den Zielmolekülen
von lebensmittelrelevanten Pflanzen passen. Insbesondere bei Lightcycler-Sonden,
bzw. bei Sondenpaaren zwischen denen ein Fluoreszenz-Resonanz-Emissions-Tranfer
(FRET) stattfindet, muss sichergestellt werden, dass beide Sonden
an die Zielsequenz binden, da mit der Dissoziation nur einer Sonde
das Signal verloren geht. Die erfindungsgemäßen Sonden sind besonders gut
zur FRET- Analyse geeignet.
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Daher umfasst in einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei dem der Nachweis der
Hybridnukleinsäure
in Schritt (d) durch die Bestimmung des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers
(FRET) von zwei mit Fluoreszenzfarbstoft gekoppelten Sonden erfolgt.
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Des weiteren sind Verfahren bevorzugt,
bei denen die zu untersuchende Probe mindestens eine Nukleinsäure enthält, die
mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) extrahiert wurde.
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In einem weiteren Aspekt betrifft
die vorliegende Erfindung einen Kit zum Nachweis von Pflanzenmaterial
in einer Probe, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder eine
Nukleinsäuremolekülkombination
nd optional weitere Reagenzien, Hilfsstoffe und Hilfsmittel, vorzugsweise
ausgewählt
aus einer für
PCR geeigneten Pufferlösung,
Gebrauchsanleitung, Nukleotidgemisch, MgCl2,
BSA, TAQ-DNA-Polymerase,
reverse Transkriptase, Antikörper
für „Hotstart-PCR".
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung
betrifft die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder
einer Nukleinsäuremolekülkombination
zum Nachweis von Pflanzenmaterial oder pflanzlichen Bestandteilen
in Proben, vorzugsweise zum Nachweis von Material lebensmittelrelevanter
Pflanzen, mehr bevorzugt zum Nachweis von Material aus Getreide,
Kohl, Früchten,
Gemüse
und/oder Nachtschattengewächsen.
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Vorzugsweise wird mindestens ein
erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder eine
erfindungsgemäße Nukleinsäuremotekülkombination
und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahrens
zum Nachweis von Pflanzenmaterial oder pflanzlichen Bestandteilen
als Kontrolle in pflanzenspezifischen Nachweisverfahren verwendet,
besonders bevorzugt als Kontrolle in pflanzenspezifischen Nachweisverfahren
von gentechnisch veränderten
Pflanzen, ganz besonders bevorzugt als Kontrolle in Nachweisverfahren
zur Bestimmung von gentechnisch verändertem Mals, Soya, Tomaten,
Getreide, Raps, Kartoffeln oder Soya.
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In einer bevorzugten Auführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülkombination
für den
quantitativen Nachweis von Amplifikationsfragmenten, vorzugsweise
durch Echtzeit oder online-PCR.
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In einer weiteren bevorzugten Auführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülkombination
zusammen mit LightCycler®-Sonden, TagMan®-Sonden
oder anderen Sonden, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt wurden.
LightCycler-, Taqman- und andere Sonden sind beispielsweise von
TIB MOLBIOL, Tempelhofer Weg 11-12, 10829 Berlin verfügbar.
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Besonders bevorzugt ist die Verwendung
mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülkombination,
bei der mindestens eine dieser Nukleinsäuren auf einem festen Träger, vorzugsweise
einem Biochip fixiert ist.
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Beschreibung er Figuren:
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1 zeigt
den Nachweis von gentechnisch verändertem Mals bt176 und Soja
in verschiedenen Lebensmitteln. Der Nachweis wurde in einem LightCycler
mit LightCycler-Sonden durchgeführt.
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2 zeigt
die Untersuchung von Lebensmittel auf das Vorhandensein von Mals
bt-176 und Soja. Die Ergebnisse können auf Grund fehlender Signalamplituden
als negativ oder zumindest unklar angesehen werden. Aus diesem Grunde
ist es besonders sinnvoll, in einer Kontrollreaktion zu überprüfen, ob
die PCR funktioniert und ob Pflanzenmaterial nachgewiesen werden
kann. Dies erfolgte mit Sonden und Primern gemäss der vorliegenden Erfindung.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
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Das nachstehende Beispiel erläutert die
Erfindung
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Beispiel 1: Verwendung
eines Nachweissystems als Positivkontrolle für pflanzliche Materialien
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Die Bestimmung gentechnisch veränderter
pflanzlicher Bestandteile in einem Lebensmittel erfolgt mittels
eines PCR-Nachweissystems, welches spezifisch die möglichen
Sequenzveränderungen
im Genom von Mals und Soja nachweist.
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In einem ersten Schritt wird die
DNA (oder bei einer RT-PCR die RNA) aus einer zu untersuchenden Lebensmittelprobe
nach bekannten Verfahren, beispielsweise mit wässrigen Lösungen von Cetyltrimethylammonium-Bromid
(CTAB) (Murray M.G. and Thompson W.F. (1980), Rapid isolation of
high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Research 8, no. 19,
4321-4325.) isoliert und ggf. aufgereinigt.
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Im Fall des positiven Nachweises
von gentechnisch verändertem
Mals und Soja ist die Analyse als abgeschlossen zu betrachten. Im
Fall eines negativen Ergebnisses muss jedoch ausgeschlossen werden,
dass die Amplifikationsreaktion durch Inhibitoren aus dem Lebensmittelextrakt
unterdrückt
wurde.
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Dies wird durch einen positiven PCR-Nachweis,
der auch auf nicht-gentechnisch veränderte Pflanzen gerichtet ist,
nachgewiesen. Diese Kontrollreaktion wird in einer separaten Reaktion
oder in einer Multiplex-PCR zusammen mit dem spezifischen Nachweissystem
für gentechnisch
veränderte
Pflanzen, wie z.B. Mals und Soja durchgeführt werden. Im zuletzt genannten
Fall besteht der Vorteil einer verkürzten Arbeitszeit.
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Eine solche Pflanzen-PCR wird erfindungsgemäß mit mehreren
der folgenden Oligonukleotide durchgeführt:
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LG Red640 steht für den Fluoreszenzfarbstoff
LightCycler Red 640, X für
Fluoreszein und p für
einen Phosphatrest steht.
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Die Oligonukleotide der SEQ IDs 1
und 2 werden als Primen und als Sonde die Oligonukleotide der SEQ
ID 3-6 verwendet. Die Sonden sind in der gekennzeichneten Weise
mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Mit diesen Modifikationen
sind sie besonders gut für
eine online-PCR im LightCycler geeignet.
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Die Oligonukleotide der SEQ ID 1-6
binden an eine Konsensussequenz des Chloroplasten-Genoms.
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Die PCR-Reaktion wurde wie folgt
durchgeführt:
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Nach dem Abfüllen in eine LightCycler-Kapillare
wurden 2,5 μl
DNA-Extrakt hinzugefügt.
Anschliessend wurde der LightCycler mit folgendem Profil gestartet:
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Zyklusprotokoll
5 min 37°C
45 × 0s 97°C (nach Erreichen
von 97°C
wird sofort 15 s auf 60°C
abgekühlt)
10
s 72°C
Gesamtdauer
ca. 30 – 45
min
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Das PCR-System wurde in der oben
angegebenen Weise mit Primern und Sonden, die das Chloropasten-Genom
nachweisen, durchgeführt.
Da das Chloroplasten-Genom in vielen Kopien vorliegt, ist dieser Nachweis
besonders sensitiv und robust.
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In 1 ist
das Ergebnis einer Gruppe von Lebensmittelproben dargestellt, in
denen in jedem Fall gentechnisch veränderter Mals und Soja nachgewiesen
wurde. Dies ist an den deutlich positiven PCR-Signalen zu erkennen.
Der Negativ-Kontrolle wurde lediglich Wasser als Probe hinzugegeben.
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In 2 hingegen
sind Ergebnisse dargestellt, in denen kein Anteil oder nur ein unklarer
Anteil von gentechnisch verändertem
Mals und Soja gefunden wurde.
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Es wurde als Kontrolle eine pflanzenspezifische
PCR durchgeführt.
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt, dass Pflanzenmaterial in jedem
Fall nachgewiesen wurde. Aus diesem Grunde sind die fehlenden PCR-Signale
für gentechnisch
veränderten
Mals also korrekt und nicht z.B. auf das Vorhandensein von PCR-Inhibitoren zurückzuführen.
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Tabelle
1: Nachweis von Pflanzenmaterial in Lebensmittelproben
