DE69632520T2

DE69632520T2 - Methode für die identifizierung genetischer varianten des hopfens

Info

Publication number: DE69632520T2
Application number: DE69632520T
Authority: DE
Inventors: Araki; Tsuchiya
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1996-07-26
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2016-07-27
Also published as: CN1159212A; WO1997005281A1; EP0785281A1; EP0785281B1; EP0785281A4; CA2201127A1; US5948650A; SK41797A3; DE69632520D1; AU707253B2; CA2201127C; SK284231B6; DK0785281T3; CZ296930B6; CZ98697A3; CN1152139C; JP4097288B2; AU6531796A

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Hopfensorten und insbesondere ein Identifizierungsverfahren, bei dem Methoden der Gentechnik eingesetzt werden.
Stand der Technik
Der Hopfen verleiht dem Bier sein einmaliges Aroma und seine spezielle Bitterkeit und trägt außerdem dazu bei, überschüssiges Protein zu sedimentieren und die Vermehrung von Bakterien zu unterdrücken. Da jedoch die Stärke dieser Wirkungsweise des Hopfens hauptsächlich von der Sorte abhängig ist, ist die Identifizierung von Hopfensorten erforderlich, so dass ein Bier mit gleichbleibender Qualität hergestellt werden kann und neue Biere entwickelt werden können.
Normalerweise beruhte die Identifizierung von Hopfensorten auf ihren einzelnen Bestandteilen, z. B. den Bitterstoffen (α-Säure/β-Säure-Cohumulon/Humulon, Colupulon/Lupulon) und den essentiellen Öl-Komponenten (Farnesen, Caryophyllen).
Jedoch war die Durchführung dieses auf Bitterkeit und Ölen beruhenden Identifizierungsverfahrens sehr aufwändig, da alle Komponenten gemessen werden mussten, und außerdem war es mit diesem Verfahren nicht möglich, die Sorte genau zu bestimmen, da diese Komponenten sogar bei der gleichen Sorte abhängig von der Erntestelle und dem Erntejahr stark schwanken.
Aufgrund der kürzlichen Fortschritte in der Gentechnik wurden verschiedene Versuche unternommen, Sequenzen von Chromosomen zu finden, die von den Pflanzenarten abhängig sind, und aufgrund der gefundenen Basensequenzen aus den Unterschieden in der genetischen Information, d. h. aus dem Polymorphismus von DNA-Sequenzen, zwischen verschiedenen Pflanzen oder Sorten der gleichen Pflanze Stämme zu identifizieren.
Ein auf DNA basierendes Sorten-Identifizierungsverfahren für Hopfenblattgewebe wurde beschrieben, wobei spezifische Muster von DNA- Fragmenten aus DNAs verschiedener Hopfensorten erzeugt wurden (J. Inst. Brewery, Bd. 100, S. 283–285, 1994). Außerdem sind Verfahren nach dem bisherigen Stand der Technik bekannt, die eine verschachtelte ("nested") Primer-DNA-Technologie beschreiben, in der eine verschachtelte PCR-Amplifikation eines angesteuerten Stücks der DNA zu einer spezifischen und effizienten Amplifikation eines gewünschten DNA-Stücks führt (US-Patent Nr. 5 340 728; 1994).
Eine Identifizierung einer Pflanzensorte, die auf dieser Art von Polymorphismus beruht, ist zuverlässig, da die DNA-Sequenz selbst nicht einfach durch Umwelteinflüsse beeinflusst wird, und sie ist deshalb unveränderlich.
In dieser Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung ein zuverlässiges und einfaches Verfahren zur Identifizierung von Hopfensorten bereit, bei dem die vorstehend erwähnte genetische Technik verwendet wird.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Hopfenpflanzen-Sorte durch Verwendung einer zufälligen polymorphen DNA (RAPD), umfassend:

(a) Bereitstellen einer Hopfenpflanzen-Sorte und eines ersten Primers (erster Primer) zum Amplifizieren einer Region, welche für Polymorphismus in der DNA der Hopfenpflanzen-Sorte charakteristisch ist, wobei der erste Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10 bis SEQ ID NO: 14 besteht, oder der Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, welche das Komplement der zuvor ausgewählten Nucleotidsequenz umfasst;
(b) Isolieren der DNA aus der Sorte;
(c) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der DNA und des ersten Primers (der ersten Primer), wodurch ein DNA-Molekül produziert wird;
(d) Bestimmen der Sequenz des DNA-Moleküls;
(e) Konstruieren von zweiten Primern, welche eine Sequenz umfassen, die in dem DNA-Molekül enthalten ist, wobei der zweite Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 15 bis SEQ ID NO: 38 besteht, oder wobei der Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, welche das Komplement der zuvor ausgewählten Nucleotidsequenz umfasst;
(f) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung des DNA-Moleküls und der zweiten Primer;
(g) Bestimmen, ob die Polymerase-Kettenreaktion zur Produktion eines DNA-Moleküls (von DNA-Molekülen) führt oder nicht; und
(h) Identifizieren der Sorte, falls das DNA-Molekül (die DNA-Moleküle) produziert wurde(n), oder Identifizieren der Sorte, falls das DNA-Molekül (die DNA-Moleküle) nicht produziert wurde(n).

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird eine Vielzahl der ersten Primer bereitgestellt, und die Polymerase-Kettenreaktion wird unter Verwendung der Vielzahl der ersten Primer durchgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist der Primer ein synthetisches Oligonucleotid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfassen die zweiten Primer Nucleotidsequenzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Kombinationen der SEQ ID NOs: 15 und 16, SEQ ID NOs: 17 und 18, SEQ ID NOs: 19 und 20, SEQ ID NOs: 21 und 22, SEQ ID NOs: 23 und 24, SEQ ID NOs: 25 und 26, SEQ ID NOs: 27 und 28, SEQ ID NOs: 29 und 30, SEQ ID NOs: 31 und 32, SEQ ID NOs: 33 und 34, SEQ ID NOs: 35 und 36 und SEQ ID NOs: 37 und 38 besteht.
Das Verfahren zur Identifizierung von Hopfensorten gemäß der vorliegenden Erfindung weist diesen Polymorphismus nach, der genetisch auf Unterschieden in DNA-Sequenzen zwischen Sorten beruht. Insbesondere werden Teile der DNA-Sequenz von Hopfen, die einen Polymorphismus zeigen, durch eine Polymerase-Kettenreaktion (hier nachstehend als PCR bezeichnet) unter Verwendung eines Identifizierungsprimers amplifiziert, und anschließend werden die Sorten identifiziert, indem diese amplifizierte DNA analysiert wird.
Um das vorstehende Verfahren anzuwenden, ist es erforderlich, den Polymorphismus von DNA zwischen Hopfensorten aufzuklären.
Der Begriff Polymorphismus deckt spezifisch Unterschiede in der genetischen Sequenz ab, die auf Insertionen, Deletionen oder Substitutionen beruhen. Die Länge der beteiligten Sequenz kann 1 bp oder mehreren zehn bp oder mehr ausmachen, sie liegt jedoch vorzugsweise in einem Bereich von mehreren bp bis mehreren zehn bp.
Dieser Sequenz-Polymorphismus zwischen Sorten kann nachgewiesen werden, indem Sequenzen von Teilen bestimmt werden, die der Chromosomen-DNA der jeweiligen Sorte entsprechen, und indem anschließend eine Vergleichsanalyse mit den Sequenzen durchgeführt wird. Ein einfacheres Verfahren besteht jedoch darin, die RAPD-Technik (Random Amplified Polymorphic DNA) zu verwenden, die von Williams et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 18, S. 6531, 1990) entwickelt wurde.
Diese RAPD-Technik weist einen Polymorphismus zwischen unbekannten DNA-Sequenzen unter Verwendung der PCR nach. Insbesondere Primer mit einer niedrigen Spezifität, die ein relativ kurzes synthetisches Oligonucleotid von etwa zehn Basen umfassen, werden mit einer Vielzahl von DNA-Typen gemischt, und anschließend wird eine PCR durchgeführt.
Wenn die DNA-Sequenz des Hopfens eine Sequenz umfasst, die vollständig oder teilweise komplementär zu den Primern ist, anelieren sich die Primer an die vollständig oder teilweise komplementäre Sequenz, und der zwischen den Primern eingeschlossene Teil wird synthetisiert und amplifiziert. Wenn in der DNA innerhalb des zwischen den Primern eingeschlossenen Teils in der Sequenz Unterschiede, z. B. Insertionen oder Deletionen, vorliegen, werden abhängig von der Sorte PCR amplifizierte Fragmente unterschiedlicher Größe erhalten. Wenn weiterhin eine bestimmte Sorte eine Sequenz umfasst, mit der ein Primer aneliert, und eine andere Sorte nicht, werden nur für die erste Sorte PCR-amplifizierte Fragmente erhalten. Danach kann der Polymorphismus durch Fraktionierung, z. B. durch Elektrophorese, nachgewiesen werden.
Das RAPD-Verfahren kann nicht nur eingesetzt werden, um einen Polymorphismus gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend beschrieben, nachzuweisen, sondern auch um Primer zu selektieren, die einen Polymorphismus durch die PCR nachweisen können, d. h. als ein Verfahren zum Entwerten eines Primers.
Alle polymorphen Regionen in der DNA von Hopfensorten, die durch das RAPD-Verfahren, wie durch die beigefügten Ansprüche angegeben, nachgewiesen werden, werden durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung angesprochen. Die Primer, wie durch die beigefügten Ansprüche angegeben, welche die durch das RAPD-Verfahren nachgewiesenen polymorphen Regionen amplifizieren können, können als Identifizierungsprimer gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Der Identifizierungsprimer der vorliegenden Erfindung, der durch das vorstehende Verfahren entwickelt wurde, kann ein bestimmter Typ eines synthetischen Oligonucleotids oder zwei oder mehr Typen eines synthetischen Oligonucleotids sein.
Die Länge dieses synthetischen Oligonucleotids liegt im Bereich von 6 bis 40 und vorzugsweise 10 bis 21. Insbesondere ist es günstig, ein Oligonucleotid zu verwenden, das die Basensequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 8 und 10 bis 14 im Sequenzprotokoll dargestellt ist.
Ein zweites Verfahren zum Entwerfen eines Identifizierungsprimers gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte.
Dieses Verfahren bestimmt zuerst die Basensequenz des amplifizierten Fragments, das durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Identifizierungsprimers erhalten wurde (z. B. eines Primers, der die polymorphe Region amplifizieren kann, die durch das vorstehende RAPD-Verfahren nachgewiesen wurde, hier nachstehend als ein erster Primer bezeichnet). Schließlich werden zwei Identifizierungsprimer synthetisiert, die jeweils zu Positionen komplementär sind, welche in dem vorstehenden polymorphen Sequenzfragment mit einem vorher festgelegten Intervall vorliegen, so dass ein amplifiziertes Fragment erzeugt wird, das es möglich macht, dass die polymorphe Sequenz durch einen ersten Primer mit einer hohen Reproduzierbarkeit und sehr einfach identifiziert wird.
Mit anderen Worten kann der Identifizierungsprimer gemäß dem vorstehenden Verfahren basierend auf der polymorphen Sequenz und den umgebenden Sequenzen selektiv entworfen werden.
Der vorstehend erwähnte erste Primer kann ein Oligonucleotid sein, umfassend eine Basensequenz, die in den SEQ ID NOs: 8 und 10 bis 14 des Sequenzprotokolls beschrieben ist.
Z. B. kann die Sequenz des ersten Identifizierungsprimers so entworfen werden, dass entweder einer oder beide Primer die gesamte vorstehend erwähnte polymorphe Sequenz oder einen Teil davon umfassen.
Wenn die Identifizierung eines Stamms durch die vorstehend erwähnten Primer erfolgt und ein Stamm verwendet wird, der die ausgewählte polymorphe Sequenz umfasst, findet die DNA-Amplifikation aufgrund der PCR statt, da der Stamm die komplementäre Sequenz umfasst, und eine spezifische amplifizierte DNA wird erhalten. Wenn andererseits ein Stamm verwendet wird, der die polymorphe Sequenz nicht umfasst, wird keine amplifizierte DNA erzeugt, auch wenn eine PCR durchgeführt wird, da der Stamm die komplementäre Sequenz nicht enthält. Deshalb ist es in diesem Fall möglich, den Stamm durch das Vorliegen oder die Abwesenheit des amplifizierten Fragments zu identifizieren.
Die Sequenz des zweiten Identifizierungsprimers kann so entworfen werden, dass die zwei Typen von Primern stromaufwärts bzw. stromabwärts der polymorphen Sequenz liegen.
Wenn die Identifizierung eines Stamms unter Verwendung der vorstehenden Identifizierungsprimer durchgeführt wird; wird durch die PCR eine amplifizierte DNA erzeugt, die abhängig vom Stamm eine unterschiedliche innere Basensequenz und in einigen Fällen eine unterschiedliche Größe aufweist. Danach kann der Stamm aus dem Wanderungsmuster identifiziert werden, das durch Fraktionierung der amplifizierten DNA unter Verwendung einer Elektrophorese, einer Elektrophorese, falls erforderlich, nach Spalten mit einem Restriktionsenzym, einer Elektrophorese auf einem denaturierenden Gradienten-Gel oder einer Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese erhalten wurde.
Ein dritter Identifizierungsprimer kann entworfen werden, der eine erste Primersequenz am 5'-Ende enthält, wobei die Basensequenz in einem polymorphen Bereich, der mit dieser Sequenz verbunden ist, 5 bis 20 miteinander gekoppelte Basen umfasst. Die Identifizierung eines Stamms unter Verwendung dieses Identifizierungsprimers kann eingesetzt werden, wenn z. B. eine polymorphe Sequenz an einer Position vorliegt, zu der der erste Primer komplementär ist. Mit anderen Worten kann die polymorphe Sequenz mit einer größeren Spezifität als durch den ersten Primer alleine nachgewiesen werden, indem die Sequenz von 5 bis 20 Basen an ihn angehängt wird.
Insbesondere kann der Identifizierungsprimer, der gemäß dem vorstehenden Verfahren entworfen und durch die beigefügten Patentansprüche angegeben ist, ein synthetisches Oligonucleotid, das eine in den SEQ ID NOs: 15 bis 38 des Sequenzprotokolls beschriebene Basensequenz umfasst, oder eine geeignete Kombination aus zwei synthetischen Oligonucleotiden sein, die jeweils einen Teil dieser Basensequenz umfassen, wie es geeignet ist.
Andererseits kann der Identifizierungsprimer ein synthetisches Oligonucleotid sein, das einen Teil der Basensequenz der Genom-DNA zwischen einer Position, an der die Basensequenz der SEQ ID NO: 15 (17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37) an die Genom-DNA aneliert ist, und einer Position umfasst, an der die Basensequenz von SEQ ID NO: 16 (18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38) an die Genom-DNA aneliert ist.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren zum Entwerfen des zweiten Identifizierungsprimers (d. h. zusammen mit dieser Zusammensetzung) ist es möglich, die Basensequenz einer Region zu bestimmen, die einen Polymorphismus zeigt, und somit stellt das Verfahren einen Primer bereit, der Stämme zuverlässiger identifizieren kann.
Indem eine Vergleichsanalyse der DNA zwischen Stämmen basierend auf genetischen Verfahren gemäß dem Stamm-Identifizierungsverfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, können auf diese Weise Hopfenstämme zuverlässig identifiziert werden, ohne dass die Umgebung eine Rolle spielt, in der sie geerntet wurden.
Die Erfindung wird mit Bezug auf spezifische Beispiele noch ausführlicher beschrieben, wobei diese Beispiele jedoch in keiner Weise die Erfindung einschränken sollen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist den Foto, das ein Wanderungsmuster zeigt, welches erhalten wird, wenn ein Teil der DNA von Hallertauer Tradition (HT) bzw. Shinshu Wase (SW) unter Verwendung eines ersten Primers (ein Primertyp: B72) amplifiziert wurde und die amplifizierten Fragmente einer Elektrophorese gemäß dem Verfahren zum Entwerfen des zweiten Identifizierungsprimers unterworfen wurden.
2 ist ein Diagramm, das eine Basensequenz von amplifizierten Fragmenten zeigt, die einer Elektrophorese unterworfen wurden und in der Nähe von 600 bp liegen, wie durch den Pfeil in 1 bezeichnet; die obere Gruppe zeigt die Basensequenz von HT und die untere Gruppe die Basensequenz von SW. Identische Basen an Positionen, die dem HT in der oberen Gruppe entsprechen, sind durch einen schwarzen Punkt (•) gekennzeichnet, und wenn an den beiden entsprechenden Positionen eine Basensubstitution vorliegt, ist die Base angegeben. Positionen, an denen bei einem der beiden Typen keine Basen vorliegen, d. h. fehlende Positionen, sind durch ein Minuszeichen (–) angegeben.
Der durch einen Rahmen eingegrenzte Bereich mit der Bezeichnung B72WF2 enthält eine Basensequenz, die in SEQ ID NO: 27 des Sequenzprotokolls angegeben ist und die als ein Identifizierungsprimer ausgewählt wurde. Der durch einen Rahmen eingegrenzte Bereich B72WR2 enthält eine Basensequenz, die in SEQ ID NO: 28 des Sequenzprotokolls beschrieben ist und die eine komplementäre Sequenz eines Identifizierungsprimers darstellt.
3 ist ein Foto, das die Ergebnisse der Elektrophorese zur Fraktionierung amplifizierter Fragmente zeigt, wenn eine PCR unter Verwendung eines Identifizierungsprimers durchgeführt wird, umfassend B72WF2 (SEQ ID NO: 27) und die komplementäre Sequenz von B72WR2 (SEQ ID NO: 28), wie in 2 dargestellt.
4 zeigt eine Basensequenz eines anderen polymorphen amplifizierten Fragments (RAPD-Marker).
5 zeigt noch eine Basensequenz eines weiteren polymorphen amplifizierten Fragments (RAPD-Marker).
Genaue Beschreibung einer Ausführungsform
Im Verfahren zur Identifizierung von Hopfenstämmen gemäß der vorliegenden Erfindung werden polymorphe Regionen, d. h. Teile der DNA, in denen die DNA-Sequenz sich bei den verschiedenen Hopfensorten unterscheidet, durch eine PCR unter Verwendung eines Identifizierungsprimers, wie durch die beigefügten Patentansprüche angegeben, amplifiziert und die Stämme identifiziert, indem der Unterschied zwischen den amplifizierten Fragmenten analysiert wird.
Gewinnung der Hopfen-DNA
Die Hopfen-DNA für die Untersuchung kann aus winzigen Mengen von Hopfen-Blättern, Zapfen und Pellets gewonnen werden.
Die Hopfen-DNA kann durch ein beliebiges Verfahren gewonnen werden, das im Allgemeinen zur Gewinnung von DNA aus Pflanzenproben verwendet wird, z. B. durch das typische DNA-Extraktionsverfahren, das in Nucleic Acids Res. 8: 4321 (1980) beschrieben ist, oder die Extraktion kann einfacher durchgeführt werden, indem ein kommerzieller „BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT" (QIAGEN Inc.) verwendet wird. Wenn der Kit verwendet wird, wird die DNA in einer Säule mit einem negativen Ionenaustauscher-Harz absorbiert und gewonnen, wodurch Probleme umgangen werden, die auf der Beimischung von Substanzen beruhen könnten, welche möglicherweise die Reaktionen stören.
Nachstehend werden einige Verfahren zum Entwerfen eines Identifizierungsprimers beschrieben, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Verfahren zum Entwerfen eines ersten Identifizierungsprimers
Zum Entwerfen des Primers kann ein beliebiges Verfahren verwendet werden, das nach Oligonucleotiden sucht, die polymorphe Regionen oder Sequenzen in verschiedenen Sorten durch eine PCR nachweisen, wobei jedoch das RAPD-Verfahren besonders gut geeignet ist.
Das RAPD-Verfahren wird durchgeführt, indem zuerst eine Gruppe von Primern, wie durch die beigefügten Patentansprüche angegeben, zubereitet wird.
Die im normalen RAPD-Verfahren eingesetzten Primer können mit einem automatischen DNA-Synthese-Kit unter Verwendung z. B. der Phosphoramidit-Technik hergestellt werden. Sie haben zufällige Sequenzen, und ihre Länge beträgt 6 bis 40 Nucleotide oder stärker bevorzugt 10 bis 21 Nucleotide.
Außerdem kann die von Williams et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 18, S. 6531, 1990) beschriebene Basensequenz, gemeiner Beck-Primer oder ein kommerzielles Oligonucleotid aus den „Operon 10-mer Kits", hergestellt von der OPERON Co., eingesetzt werden. Danach wird eine PCR mit den verschiedenen Typen von Hopfen-DNA durchgeführt, wobei ein oder mehrere Primer aus der vorstehend zubereiteten Gruppe unter den gleichen Bedingungen, wie nachstehend für die „PCR-Reaktion" beschrieben, verwendet werden.
Anschließend werden die durch PCR amplifizierten Fragmente auf einem geeigneten Elektrophorese-Gel fraktioniert und das Ausmaß der Wanderung der amplifizierten Fragmente zwischen den Stämmen wird verglichen.
Als Ergebnis des vorstehenden Vergleichs werden diejenigen amplifizierten Fragmente, für die gefunden wurde, dass sie zwischen den Stämmen verschieden sind oder dass sie zwischen den Stämmen einen Größenunterschied aufweisen, als Polymorphismus-Amplifizierungsfragmente (RAPD-Marker) genommen, und ein oder zwei Primer, die diese Fragmente produzieren, werden aus der vorstehenden Gruppe von Primern selektiert, um dann als Identifizierungsprimer verwendet zu werden.
Beispiele eines solchen Identifizierungsprimers, der auf diese Weise selektiert wurde, ist ein synthetisches Oligonucleotid, das eine Basensequenz umfasst, die in den SEQ ID NOs: 8 und 10 bis 14 des Sequenzprotokolls beschrieben ist, und diese Sequenzen können natürlich auch als komplementäre Sequenzen verwendet werden.
Ein Oligonucleotid, das einen Teil der Basensequenz umfasst, die durch die SEQ ID NOs: 8 und 10 bis 14 des Sequenzprotokolls dargestellt ist, kann in der PCR-Reaktion als ein Identifizierungsprimer eingesetzt werden, mit der Maßgabe, dass es eine beliebige gewünschte polymorphe Sequenz der Hopfen-DNA amplifizieren kann.
Weiterhin kann abhängig von den PCR-Reaktionsbedingungen auch ein beliebiges Nucleotid verwendet werden, das eine Basensequenz umfasst, die zu der des vorstehend erwähnten synthetischen Oligonucleotids ähnlich ist.
Mit dem ersten Entwurfverfahren ist es einfach, einen Identifizierungsprimer zu entwerten, der einen Polymorphismus bei Hopfensorten nachweisen kann, die unbekannte Sequenzen enthalten.
Außerdem erfüllt der durch dieses Verfahren entworfene Identifizierungsprimer seine Funktion sehr gut, wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird.
Verfahren zum Entwerfen eines zweiten Identifizierungsprimers
Im zweiten Verfahren zum Entwerfen eines Identifizierungsprimers wird die Basensequenz von polymorphen amplifizierten Fragmenten (RAPD-Marker) bestimmt, die im Verfahren zum Entwerfen eines ersten Identifizierungsprimers nachgewiesen wurden, und polymorphe Sequenzen werden nachgewiesen.
Sodann werden Sequenzen, die amplifizierte Fragmente erzeugen können, welche eine polymorphe Sequenz enthalten, aus den Sequenzen in den polymorphen amplifizierten Fragmenten, die hier bestimmt wurden, als Identifizierungsprimer selektiert.
Ein Primer des Typs kann entworfen werden, wie in „PCR Technology", Hrsg. Henry A. Erlich, Takara Shuzo Co., Ltd., angegeben und häufig bei der PCR eingesetzt.
Insbesondere wenn eine Primersequenz aus dem DNA-Amplifizierungsfragment als RAPD-Marker selektiert wird, das Größenunterschiede zeigt, wird ein Oligonucleotid ausgewählt; das Sequenzen enthält, die auf einer der Seiten einer Insertion oder Deletion in der Basensequenz des RAPD-Markers liegen.
Ein Beispiel eines solchen Identifizierungsprimers ist eine Oligonucleotid-Kombination, umfassend die in den SEQ ID NOs: 27 und 28 des Sequenzprotokolls beschriebenen Basensequenzen.
Der Größenunterschied der RAPD-Marker beträgt 1 bp bis mehrere hundert bp, wobei jedoch ein Bereich von 10 bp bis mehreren zehn bp für die Identifizierung besser geeignet ist. Außerdem können Basensubstitutionen vorliegen, die durch Restriktionsenzyme oder dergleichen identifiziert werden können, auch wenn kein Größenunterschied vorliegt.
Der Größenunterschied, der einfach durch Elektrophorese unterschieden werden kann, hängt vom Typ und der Konzentration des verwendeten Gels ab, wobei er jedoch in der Regel 1/10 oder mehr der gesamten Länge ausmacht. Z. B. wird der Primer so entworfen, dass, wenn die Insertionssequenz 20 bp beträgt, die vollständige Länge des amplifizierten Produkts 200 bp oder weniger ausmacht. Deshalb werden unter Verwendung einer PCR mit diesem Typ von Identifizierungsprimer amplifizierte Fragmente erhalten, die aufgrund eines Polymorphismus Größenunterschiede zeigen, die einfach zu unterscheiden sind.
Wenn andererseits die amplifizierten Fragmente bei den verschiedenen Sorten Größenunterschiede zeigen, kann ein Oligonucleotid ausgewählt werden, das innere Sequenzen an Insertionsstellen und Sequenzen an Brückenstellen-Positionen aufweist, an denen Deletionen vorliegen. Deshalb werden bei Verwendung einer PCR mit diesem Typ von Identifizierungsprimer amplifizierte Fragmente für solche Sorten erhalten, die Insertionen und/oder Deletionen aufweisen.
Wenn der RAPD-Marker das Vorliegen oder die Abwesenheit spezifischer DNA-Amplifikationsbanden identifizieren kann, die vom jeweiligen Stamm abhängig sind, wird ein Oligonucleotid, das eine optimale Sequenz für die Polymerase-Kettenreaktion umfasst, aus der inneren Basensequenz des RAPD-Markers als Primer selektiert. Ein Beispiel eines solchen Primers sind Oligonucleotide, umfassend Basensequenzen, die in den SEQ ID NOs: 35 und 36 des Sequenzprotokolls beschrieben sind.
Wenn weiterhin der Fall auftritt, dass ein Polymorphismus nur an der Position vorliegt, an welche sich der erste Primer anlagert, kann ein synthetisches Oligonucleotid selektiert werden, das eine erste Primersequenz am 5'-Ende und 5 bis 20 der RAPD-Marker-Basensequenzen umfasst.
Wenn z. B. ein Primer verwendet wird, der innere Basensequenzen des RAPD-Markers enthält, und für alle Sorten PCR amplifizierte Produkte der gleichen Größe erzeugt werden, kann die Spezifität gesteigert werden, indem der Primer auf diese Weise entworfen wird. Als spezifisches Beispiel kann ein Primer, der die in den SEQ ID NOs: 15 und 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen Basensequenzen umfasst, außerdem die in SEQ ID NO: 12 des Sequenzprotokolls beschriebene Basensequenz am 5'-Terminus enthalten, wobei die Basensequenzen damit verbunden sind (5). Wenn jedoch die Basensequenz im RAPD-Marker, die gekoppelt werden soll, zu kurz ist, nehmen die unspezifischen Amplifikationsbanden in der PCR zu, wodurch der Nachweis eines Polymorphismus unmöglich wird. Wenn sie andererseits zu lang ist, lagern sich die Primer an jeden Stamm unabhängig vom Vorliegen oder der Abwesenheit eines Polymorphismus an, so dass PCR-Produkte erzeugt werden und der Nachweis eines Polymorphismus wieder unmöglich ist.
Wenn in der Basensequenz des RAPD-Markers Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme vorliegen, durch die eine Identifizierung von Sorten möglich wäre, kann der Primer so entworfen werden, dass PCR amplifizierte Produkte erhalten werden, die diese Enzym-Erkennungsstellen beibehalten. Ein Beispiel eines solchen Primers sind Oligonucleotide, die die in den SEQ ID NOs: 33 und 34 des Sequenzprotokolls beschriebenen Basensequenzen umfassen.
Wenn der Primer auf diese Weise entworfen wird, kann die Anelierungstemperatur beim Durchführen der PCR so eingestellt werden, dass nur das Zielfragment (RAPD-Marker) amplifiziert wird. Die Identifizierung von DNA-Amplifikationsbanden ist somit einfach, und sehr zuverlässige Ergebnisse werden erhalten.
Ein synthetisches Oligonucleotid stellt ein einfaches Mittel bereit, mit dem die in der vorstehend beschriebenen Art und Weise entworfenen Primer hergestellt werden können. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete synthetische Oligonucleotid kann unter Verwendung einer kommerziellen DNA-Autosynthese-Apparatur mit z. B. dem Phosphoramidit-Verfahren erhalten werden.
Die Kettenlänge dieses Oligonucleotids beträgt 15 bis 40, stärker bevorzugt 20 bis 30. Es ist günstig, ein Oligonucleotid zu verwenden, das eine der in den SEQ ID NOs: 8 und 10 bis 38 des Sequenzprotokolls beschriebenen Basensequenzen umfasst.
Zusätzlich zu dem Vorstehenden kann auch ein synthetisches Oligonucleotid eingesetzt werden, das einen Teil der Hopfen-DNA-Basensequenz zwischen Positionen umfasst, zu denen ein anderes synthetisches Oligonucleotid komplementär ist, umfassend zwei Typen von Basensequenzen von den Basensequenzen, die in den SEQ ID NOs: 15 bis 38 des Sequenzprotokolls beschrieben sind (z. B. 15 und 16, 17 und 18, ... 35 und 36, 37 und 38).
Die Identifizierungsprimer gemäß dem vorstehenden zweiten Verfahren zum Entwerfen und wie in den beigefügten Patentansprüchen angegeben amplifizieren die polymorphe Region, so dass eine geeignete Identifizierung möglich wird, die auf polymorphen amplifizierten Fragmenten beruht, d. h. Sequenzen, welche die polymorphen Sequenzen umgeben, und umfassen auch Sequenzen, die für eine PCR geeignet sind. Somit kann unter Verwendung dieser Primer eine genaue Identifizierung eines Stamms erfolgen.
PCR-Reaktion
Als nächstes wird die polymorphe Region in der Hopfen-DNA durch eine PCR amplifiziert, wobei Identifizierungsprimer verwendet werden, die gemäß dem vorstehenden ersten oder zweiten Verfahren zum Entwerfen eines Identifizierungsprimers entworfen wurden.
Die PCR-Reaktion wird z. B. von Saiki et al., Science, Bd. 230, S. 1350–1354, beschrieben. Insbesondere umfasst die Reaktion die folgenden Schritte: einen Schritt zum Denaturieren der Matrizen-DNA, einen Schritt zum Anelieren eines Primers mit der Matrizen-DNA und einen Schritt zum Durchführen eines DNA-Replikationszyklus, umfassend einen Verlängerungsschritt durch eine DNA-Polymerase mit dem Primer als Startpunkt.
Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, indem jeder Stamm in einem getrennten Reaktionsröhrchen behandelt wurde. Die Reaktionslösung wurde hergestellt, indem ein oder zwei Typen eines synthetischen Oligonucleotids, eine DNA-Polymerase, vier Arten von Desoxyribonucleotiden (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), DNA von der jeweiligen Hopfensorte als Matrizen-DNA und eine Amplifikations-Pufferlösung zugegeben wurden (umfassend etwa 1,0 μM bis etwa 4,0 μM, jedoch vorzugsweise etwa 1,5 μM bis etwa 3,0 μM Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Gelatine, Rinderserumalbumin, ein grenzflächenaktives Mittel (z. B. Tween 20, NP-40, Triton X-100 (alle Handelsnamen)) und Dimethylsulfoxid). Das Reaktionsröhrchen, das diese Reaktionslösung enthielt, wurde in einen Thermal-Cycler oder dergleichen gestellt und der vorstehend erwähnte DNA-Replikationszyklus eine geeignete Zahl von Zyklen durchgeführt, z. B. etwa 20 Zyklen bis etwa 50 Zyklen, jedoch vorzugsweise etwa 25 Zyklen bis etwa 40 Zyklen.
Die PCR-Reaktionsschritte können z. B. unter den folgenden Bedingungen durchgeführt werden.
Der Denaturierungsschritt wird normalerweise durch Erhitzen von 90 bis 95°C, jedoch vorzugsweise von 94 bis 95°C, etwa eine Minute bis etwa drei Minuten, jedoch vorzugsweise etwa eine Minute bis etwa zwei Minuten durchgeführt.
Der Primer-Anelierungsschritt wird normalerweise durchgeführt, indem eine Inkubation mit dem Primer bei 30 bis 50°C, vorzugsweise bei etwa 35 bis etwa 42°C etwa eine Minute bis etwa drei Minuten, jedoch vorzugsweise etwa eine Minute bis etwa zwei Minuten erfolgt. Der Identifizierungsprimer kann ein Typ oder eine Kombination von zwei oder mehr Typen sein, wie es gewünscht ist.
Der DNA-Polymerase-Verlängerungsschritt wird in Gegenwart einer thermostabilen DNA-Polymerase normalerweise bei etwa 70 bis etwa 73°C, jedoch vorzugsweise bei etwa 72 bis etwa 73°C und etwa eine Minute bis etwa vier Minuten jedoch vorzugsweise etwa zwei Minuten bis etwa drei Minuten, durchgeführt. Diese thermostabile DNA-Polymerase kann eine kommerzielle thermostabile DNA-Polymerase sein, die von PERKIN ELMER Ltd. hergestellt wird.
Die gewünschte amplifizierte DNA kann hergestellt werden, indem die vorstehenden Schritte wiederholt werden.
Analyse der amplifizierten Fragmente
Die amplifizierte DNA, die durch die PCR-Reaktion unter Verwendung der vorstehenden Identifizierungsprimer hergestellt wurde, wird durch eine Elektrophorese fraktioniert, wobei es sich um das übliche Verfahren zum Fraktionieren von DNA handelt. Danach können die Stämme anhand des erhaltenen Wanderungsmusters identifiziert werden.
Bei der Elektrophorese kann ein geeignetes Wanderungsmuster erhalten werden, indem für DNA-Fragmente mit 1000 Desoxyribonucleotid-Paaren oder weniger ein etwa 3% bis etwa 20% Polyacrylamid-Gel und für längere DNA-Fragmente ein etwa 0,2% bis etwa 2% Agarose-Gel verwendet wird.
Die Pufferlösung, die für die Elektrophorese verwendet wird, kann ein Tris-Phosphorsäure-System (pH 7,5 bis 8,0), Tris-Essigsäure-System (pH 7,5 bis 8,0), oder Tris-Borsäure-System (pH 7,5 bis 8,3) sein, wobei jedoch ein Tris-Phosphorsäure-System bevorzugt ist. Außerdem kann, falls erforderlich, EDTA zugegeben werden.
Die Elektrophoresebedingungen sind unterschiedlich, abhängig von der Größe der Elektrophoreseapparatur, z. B. 50 bis 300 V, 10 bis 120 Minuten und vorzugsweise 150 V, 30 Minuten. Als Größenmarker, welcher der Elektrophorese zum Vergleich gleichzeitig unterworfen wird, kann ein kommerzieller Marker dienen, z. B. 100 Base-Pair Ladder (Pharmacia Inc.).
Die amplifizierte DNA kann durch eine Substanz visuell nachgewiesen werden, etwa durch einen Phenanthridin-Farbstoff, z. B. Ethidiumbromid, der auch mit Nucleinsäuren interagiert. Die Färbetechnik besteht entweder darin, zuerst eine Substanz, z. B. Ethidiumbromid, zuzugeben, so dass eine Endkonzentration von etwa 0,5 mg/ml erhalten wird, oder sie besteht darin, das Gel nach der Elektrophorese in eine wässrigen Lösung von Ethidiumbromid, die etwa 0,5 mg/ml enthält, etwa 10 bis 60 Minuten einzulegen. Wenn das gefärbte Gel sodann in einer Dunkelkammer mit UV-Licht bei 254 nm oder 366 nm bestrahlt wird, kann das Wanderungsmuster nachgewiesen werden, da rote Banden an den Stellen vorliegen, an denen die DNA mit dem Ethidiumbromid gekoppelt ist. Es ist so zu verstehen, dass, wenn die Färbelösung direkt zur Elektrophoreseapparatur zugefügt wird, dann kann dieses Wanderungsmuster sogar schon während der Elektrophorese visuell ermittelt werden.
Zusätzlich zu diesem Elektrophoreseverfahren kann die amplifizierte DNA auch durch ein beliebiges Verfahren nachgewiesen werden, mit dem ihr Vorliegen oder ihre Abwesenheit oder ihre Größe nachgewiesen werden kann.
Identifizierung von Stämmen
Stämme werden durch eine Vergleichsanalyse der Wanderungsmuster identifiziert, die, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurden. Die Vergleichsanalyse kann z. B. anhand von Unterschieden im Vorliegen oder der Abwesenheit oder von Unterschieden in der Größe einer vorher festgelegten amplifizierten DNA zwischen den Sorten durchgeführt werden.
Das Vorliegen oder die Abwesenheit einer amplifizierten DNA in einer spezifischen Sorte zeigt, ob der für die PCR verwendete Primer eine anelierte Sequenz (d. h. eine komplementäre Sequenz) enthält, und Größenunterschiede einer amplifizierten DNA zeigen, dass in der durch die PCR amplifizierten Region polymorphe Sequenzen, z. B. Deletionen oder Insertionen, vorliegen, die von der Sorte abhängen.
Um eine genauere Identifizierung von Stämmen zu erhalten, sollte man sich bevorzugt nicht auf das Ergebnis von nur einer PCR verlassen, sondern Wanderungsmuster von amplifizierten Fragmenten vergleichen, wobei ein oder zwei verschiedene Oligonucleotide als Identifizierungsprimer verwendet werden.
Außerdem können die Genauigkeit, mit der Sorten identifiziert werden können, und die Fähigkeit, zwischen ihnen zu unterscheiden, noch verbessert werden, indem die Ergebnisse berücksichtigt werden, die erhalten werden, wenn die Bedingungen der PCR variiert werden, z. B. die Anelierungstemperatur, Magnesiumkonzentration in der Reaktionspufferlösung usw..
Das Verfahren zur Identifizierung eines Hopfenstamms gemäß der vorliegenden Erfindung, bei dem die vorstehende Folge von Arbeitsabläufen durchgeführt wird, kann deutlich zwischen verschiedenen Sorten unterscheiden.
Anwendungen
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung einer Sorte kann angewendet werden, um die Reinheit von Hopfensorten zu bestätigen, die für Hopfenprodukte, z. B. Hopfenpellets, verwendet werden.
Z. B. wird eine Studie des Unterschieds zwischen der amplifizierten DNA, die aus Standardhopfensorten erhalten wurde, und der aus Hopfenpellets erhaltenen amplifizierten DNA durchgeführt. Wenn eine andere amplifizierte DNA als bei den Standardhopfensorten nachgewiesen wird, kann auf diese Weise festgestellt werden, dass in den Pellets andere Sorten oder Arten mit den Standardhopfensorten gemischt sind.
Wenn man davon ausgehen kann, dass andere Sorten oder Arten vorliegen, kann anhand der Menge der amplifizierten DNA das Ausmaß, in dem diese anderen Sorten oder Arten vorliegen, d. h. die Reinheit, gemessen werden, indem z. B. die Intensität der Färbung festgestellt wird, die, wie vorstehend beschrieben, auf Ethidiumbromid beruht.
In diesem Fall kann die Genauigkeit der Bestimmung der Reinheit auch verbessert werden, indem zwei oder mehr der synthetischen Oligonucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung gemeinsam eingesetzt werden.
Man kann davon ausgehen, dass das Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung auch für die Identifizierung von Arten anderer Pflanzen als Hopfen verwendet werden kann (z. B. Maulbeeren, Erdbeeren, Kirschen usw.). Positionen, an denen die Desoxyribonucleotidsequenz bei nahen Arten verschieden ist, sind Positionen, an denen leicht DNA-Mutationen auftreten, weshalb sie begrenzt sind. Z. B. wird berichtet, dass die Position für die Codierung von rDNA dafür verwendet werden kann, Arten von Bakterien (E. coli, Milchsäurebakterien) oder Pflanzen (Reis-Keimpflanzen, Orangen) zu identifizieren. Somit können Positionen, an denen ein Unterschied zwischen nahen Arten gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, möglicherweise auch bei einer anderen Pflanze zur Identifizierung von Stämmen eingesetzt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung einer Sorte wird eine Analyse durchgeführt, die auf einem Polymorphismus von Sequenzen zwischen Sorten beruht, und hiermit kann also eine genaue Unterscheidung zwischen Hopfensorten erfolgen, die durch Umweltfaktoren nicht beeinflusst wird. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung einer Sorte nicht nur zur Identifizierung von Sorten eingesetzt werden, sondern auch, um die Reinheit verschiedener Hopfensorten in Hopfenprodukten zu messen.
Ausführungsform
1 bis 12 zeigen eine Hopfenstamm-Identifizierung unter Verwendung eines Identifizierungsprimers, der durch das Verfahren zum Entwerfen eines ersten Identifizierungsprimers entworfen wurde.
Beispiel 1
Extraktion von Genom-DNA
Die verwendeten Hopfen waren Brewer's Gold (nachstehend als Stamm Nr. 1 bezeichnet), Northern Brewer (nachstehend als Stamm Nr. 2 bezeichnet), Tettnanger (nachstehend als Stamm Nr. 3 bezeichnet), Saazer (nachstehend als Stamm Nr. 4 bezeichnet), Hersbrucker Spaet (nachstehend als Stamm Nr. 5 bezeichnet), Spalter Select (nachstehend als Stamm Nr. 6 bezeichnet), Hallertauer Tradition (nachstehend als Stamm Nr. 7 bezeichnet), Shinshu Wase (nachstehend als Stamm Nr. 8 bezeichnet) und Furano Ace (nachstehend als Stamm Nr. 9 bezeichnet).
Grünes Blattgewebe (Rohgewicht 1 g) aus den vorstehenden Sorten wurde fein zerkleinert und die Gewebefragmente durch Einlegen in flüssigen Stickstoff eingefroren. Nachdem die gefrorene Substanz im flüssigen Stickstoff unter Verwendung eines Polytrons zu einem Pulver verarbeitet worden war, wurde die Genom-DNA aus 50 mg des Pulvers extrahiert, wobei ein BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT (QIAGEN Inc.) verwendet wurde. Schließlich wurden für jede Sorte 10 bis 20 mg Genom-DNA erhalten.
Beispiel 2
Die Klassifizierung von Hopfensorten erfolgte durch eine PCR mit dem in den SEQ ID NOs: 1 und 2 beschriebenen Oligonucleotid als Primer. Eine Polymerase-Kettenreaktion wurde in Mikroröhrchen durchgeführt, enthaltend 50 μM KCl, 1,5 μM MgCl₂ und 10 μM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,8), enthaltend 0,1% Triton X-100. Zu dem Röhrchen wurden eine Einheit einer thermostabilen DNA-Polymerase (Wako Pure Chemicals), 20 Nanomol der vier Basen (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) und 0,1 mg Genom-DNA von jeder Hopfensorte, wie in Beispiel 1 zubereitet, 33 Picomol des in den SEQ ID NOs: 1 und 2 beschriebenen Oligonucleotids als Primer zugegeben. Die endgültige Menge der Reaktionslösung betrug 30 ml, und etwa 20 ml Mineralöl wurden zu dem Röhrchen zugegeben, um ein Verdampfen der Reaktionslösung zu verhindern.
Die vorstehende Polymerase-Kettenreaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Zuerst, nachdem die Temperatur drei Minuten bei 94°C gehalten wurde, wurde ein Denaturierungsschritt durchgeführt, indem eine Minute bei 94°C erhitzt wurde, und ein Primer-Anelierungsschritt wurde durchgeführt, indem eine Minute bei 35°C inkubiert wurde. Ein DNA-Polymerase-Verlängerungsschritt wurde durchgeführt, indem 35 Behandlungszyklen mit einer thermostabilen DNA-Polymerase jeweils zwei Minuten bei 72°C erfolgten und dann die Temperatur 10 Minuten bei 72°C gehalten wurde. Das Produkt wurde bei 4°C gelagert.
Die durch die vorstehende Polymerase-Kettenreaktion erhaltene amplifiziert DNA wurde durch eine Elektrophorese bei 150 V 30 Minuten in 100 μM Tris-Borsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 2 μM EDTA, unter Verwendung eines 5% Polyacrylamid-Gels aufgetrennt. 100 Base-Pair Ladder (Pharmacia Inc.) wurde als Größenmarker eingesetzt.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel zehn Minuten in eine wässrige Lösung von 0,5 mg/ml Ethidiumbromid eingelegt und in einer Dunkelkammer mit UV bei 254 nm bestrahlt. Eine rote Bande wurde nachgewiesen, die einer Verbindung aus DNA und Ethidiumbromid entsprach. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, wurden zwei amplifizierte Genombanden bei etwa 520 bp und etwa 530 bp nachgewiesen, wenn synthetische Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, welche die in den SEQ ID NOs: 1 und 2 beschriebenen Desoxyribonucleotidsequenzen enthielten. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden neun Hopfensorten in zwei Kategorien klassifiziert.
Tabelle 1
Beispiel 3
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 3 und 4 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden und der Primer-Anelierungsschritt in der Polymerase-Kettenreaktion bei 40°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 3 und 4 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurden zwei amplifizierte Genombanden bei etwa 750 bp und etwa 850 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden neun Hopfensorten in vier Kategorien eingeteilt.
Beispiel 4
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 5 und 6 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden und der Primer-Anelierungsschritt in der Polymerase-Kettenreaktion bei 40°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 5 und 6 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 270 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden neun Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 5
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 7 und 8 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 7 und 8 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 370 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden neun Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Bezugsbeispiel 1
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass ein in SEQ ID NO: 9 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde und der Primer-Anelierungsschritt in der Polymerase-Kettenreaktion bei 40°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Wenn ein in SEQ ID NO: 9 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde, wurden zwei amplifizierte Genombanden bei etwa 950 bp und etwa 1200 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden neun Hopfensorten in drei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 6
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass ein in SEQ ID NO: 10 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde und der Primer-Anelierungsschritt in der Polymerase-Kettenreaktion bei 38°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Wenn ein in SEQ ID NO: 10 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde, wurden drei amplifizierte Genombanden bei etwa 650 bp, etwa 700 bp und etwa 1200 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden neun Hopfensorten in vier Kategorien eingeteilt.
Tabelle 2
Beispiel 7
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass ein in SEQ ID NO: 11 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde und der Primer-Anelierungsschritt in der Polymerase-Kettenreaktion bei 38°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Wenn ein in SEQ ID NO: 11 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 1400 bp und etwa 1200 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden neun Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 8
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass ein in SEQ ID NO: 12 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde und der Primer-Anelierungsschritt in der Polymerase-Kettenreaktion bei 38°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Wenn ein in SEQ ID NO: 12 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde, wurden zwei amplifizierte Genombanden bei etwa 550 bp und etwa 800 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden neun Hopfensorten in vier Kategorien eingeteilt.
Beispiel 9
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass ein in SEQ ID NO: 13 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde und der Primer-Anelierungsschritt in der Polymerase-Kettenreaktion bei 38°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Wenn ein in SEQ ID NO: 13 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde, wurden vier amplifizierte Genombanden bei etwa 500 bp, 640 bp, 650 bp und 140 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden neun Hopfensorten in fünf Kategorien eingeteilt.
Tabelle 3
Beispiel 10
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 2 identisch, mit der Ausnahme, dass ein in SEQ ID NO: 14 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde und der Primer-Anelierungsschritt in der Polymerase-Kettenreaktion bei 38°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Wenn ein in SEQ ID NO: 14 beschriebenes synthetisches Oligonucleotid als Primer verwendet wurde, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 540 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden neun Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 11
Hopfenpellets, die als Stamm Nr. 8 verkauft werden (hergestellt von Northern Hop Agricultural Cooperative, Iwate-ken unter Lizenz von Sopporo Breweries Ltd.), wurden in einem Mörser zu einem Pulver zerstoßen, und aus 20 mg des Pulvers wurden etwa 5 mg Genom-DNA extrahiert, wobei ein BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT (QIAGEN Inc.) verwendet wurde. Mit dieser DNA wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 durchgeführt, wobei synthetisches Oligonucleotid, umfassend die in den SEQ ID NOs: 1 und 2 beschriebenen Desoxyribonucleotidsequenzen, als Primer verwendet wurde.
Der Unterschied zwischen der nachgewiesenen amplifizierten Genom-DNA und der amplifizierten Genom-DNA, die aus Standardhopfen der Sorte Nr. 8 erhalten wurde, wurde untersucht, um die Reinheit zu bestätigen.
Als nächstes wird in den Beispielen 13 bis 30 eine Hopfenstamm-Identifizierung beschrieben, wobei ein Identifizierungsprimer verwendet wird, der gemäß dem Verfahren zum zweiten Entwerfen eines Identifizierungsprimers entworfen wurde.
Beispiel 12
Extraktion von Genom-DNA
Grünes Blattgewebe (Rohgewicht 1 g) aus den vorstehenden Sorten wurde fein zerkleinert und die Gewebefragmente wurden durch Einlegen in flüssigen Stickstoff eingefroren. Nachdem die gefrorene Substanz im flüssigen Stickstoff unter Verwendung eines Polytrons zu einem Pulver verarbeitet worden war, wurde die Genom-DNA aus 50 mg des Pulvers extrahiert, wobei ein BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT (QIAGEN Inc.) verwendet wurde. Schließlich wurden 10 bis 20 mg Genom-DNA für jede Sorte erhalten.
Beispiel 13
Selektion eines RAPD-Markers
Um einen RAPD-Marker zu isolieren, wurde eine PCR mit 0,34 μM des Primers B72 (2) als Primer durchgeführt.
Eine Polymerase-Kettenreaktion wurde in einem Mikroröhrchen durchgeführt, enthaltend 50 μM KCl, 1,5 μM MgCl₂ und 10 μM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,8), enthaltend 0,1% Triton X-100. Zu dem Mikroröhrchen wurden 0,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Nippon Gene K. K.), jeweils 200 μM der vier Basen (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) und 17,5 ng der jeweiligen in Beispiel 12 hergestellten Hopfensorten-Genom-DNA zugefügt. Das endgültige Volumen der Reaktionslösung betrug 10 ml.
Die vorstehende Polymerase-Kettenreaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Zuerst, nachdem die Temperatur eine Minute bei 94°C gehalten wurde, wurde ein Denaturierungsschritt durchgeführt, indem 30 Sekunden bei 94°C erhitzt wurde, und ein Primer-Anelierungsschritt wurde durchgeführt, indem eine Minute bei 33°C inkubiert wurde. Ein DNA-Polymerase-Extensionsschritt erfolgte, indem 35 Behandlungszyklen mit einer thermostabilen DNA-Polymerase jeweils 30 Sekunden bei 72°C durchgeführt wurden und dann die Temperatur eine Minute bei 72°C gehalten wurde.
Die durch die vorstehende Polymerase-Kettenreaktion erhaltene amplifizierte DNA wurde durch eine Elektrophorese bei 150 V in 30 Minuten in 100 μM Tris-Borsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 2 μM EDTA, unter Verwendung eines 5% Polyacrylamid-Gels aufgetrennt. Marker 9 (Nippon Gene) wurde als Größenmarker eingesetzt.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel in eine wässrige Lösung von 0,5 mg/ml Ethidiumbromid zehn Minuten eingelegt und in einer Dunkelkammer mit UV-Licht bei 254 nm bestrahlt. Eine rote Bande wurde nachgewiesen, die einer Verbindung aus DNA und Ethidiumbromid entsprach. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Aus 1 ist ersichtlich, dass die Größe der Banden in den durch den Pfeil gezeigten Positionen bei HT und SW verschieden ist. Die Position der durch den Pfeil gezeigten Bande entspricht dem RAPD-Marker.
Beispiel 14
Der in Beispiel 13 hergestellte RAPD-Marker wurde aus dem Elektrophorese-Gel ausgeschnitten, in einen Dialyseschlauch eingeführt, einer Spannung unterworfen und aus dem Gel eluiert.
Erkennungssequenzen des Restriktionsenzyms BglII oder PstI wurden zu dem erhaltenen RAPD-Marker zugefügt, wobei das in „PCR Technology" (Hrsg., Henry A. Erlich, Verlag, Takara Shuzo Co., Ltd.) beschriebene Verfahren verwendet wurde. Nach der Subclonierung mit dem pUC-Plasmid unter Verwendung dieser Restriktionsenzym-Erkennungssequenz wurde die Desoxyribonucleotidsequenz durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt und ist in 2 dargestellt. In der Figur stellt das Punkt-Symbol (•) die gleichen Desoxyribonucleotide wie in der oberen Reihe dar, und der Strich (–) zeigt eine fehlende Base. Der unterstrichene Teil ist die Desoxyribonucleotidsequenz des Primers B72, und die durch das Rechteck eingeschlossene Desoxyribonucleotidsequenz ist eine Desoxyribonucleotidsequenz, die in Beispiel 15 nachstehend beschrieben wird.
Wenn für jede Bande eine Sequenzierung durchgeführt wurde, wurde in SW eine Insertion einer Desoxyribonucleotidsequenz von 32 bp festgestellt, wie in 2 dargestellt.
Beispiel 15
Aus den RAPD-Markern, die in Beispiel 14 erhalten wurden, wurden ein in SEQ ID NO: 27 des Sequenzprotokolls beschriebenes synthetisches Oligonucleotid, erhalten durch Bezug auf die Desoxyribonucleotidsequenz B72WF2, die in 2 durch ein Rechteck umgeben ist, und die in SEQ ID NO: 28 des Sequenzprotokolls beschriebene Desoxyribonucleotidsequenz, erhalten aus der komplementären Sequenz B72WR2, entworfen (Produktion übertragen durch Nebenvertrag an Sawaddy Technology).
Diese synthetischen Oligonucleotide wurden in der folgenden PCR-Reaktion als Primer-Satz eingesetzt. Die PCR wurde in 10 ml Reaktionslösung durchgeführt, enthaltend 50 μM MgCl₂ und 10 μM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,8), enthaltend 0,1% Triton X-100, 0,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Nippon Gene Inc.), 200 mM der vier Basen (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 17,5 ng der Genom-DNA des jeweiligen Hopfenstamms, wie in Beispiel 13 zubereitet, und 34 μM der synthetischen Oligonucleotide.
Die Schritte der vorstehenden PCR wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Zuerst, nachdem die Temperatur eine Minute bei 94°C gehalten wurde, wurde ein Denaturierungsschritt durchgeführt, indem eine Minute bei 94°C erhitzt wurde, und ein Primer-Anelierungsschritt wurde durchgeführt, indem eine Minute bei 60°C inkubiert wurde. Ein DNA-Polymerase-Extensionsschritt wurde durchgeführt, indem 35 Behandlungszyklen mit einer thermostabilen DNA-Polymerase jeweils 30 Sekunden bei 72°C erfolgten.
Die durch die vorstehende Polymerase-Kettenreaktion erhaltene amplifiziert DNA wurde durch eine Elektrophorese bei 150 V 30 Minuten in 100 μM Tris-Borsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 2 μM EDTA, unter Verwendung eines 5% Polyacrylamid-Gels aufgetrennt. Marker 9 (Nippon Gene) wurde als Größenmarker eingesetzt.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel zehn Minuten in eine wässrige Lösung von 0,5 mg/ml Ethidiumbromid eingelegt und in einer Dunkelkammer mit UV-Licht bei 254 nm bestrahlt. Eine rote Bande wurde nachgewiesen, die einer Verbindung aus DNA und Ethidiumbromid entsprach. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Das gleiche Verfahren wurde mit anderen Sorten durchgeführt, wobei die Ergebnisse in 3 dargestellt sind. Die anderen verwendeten Stämme waren Fuggle (FU), Cascade (CC), Brewer's Gold (BG), Northern Brewer (NB), Tettnanger (TE), Saazer (SA), Hersbrucker Spaet (HE), Perle (PE), Spatter Select (SS) und Furano Ace (FA).
Wie aus der Figur zu ersehen ist, wurde die Amplifikation eines 329 bp großen Fragments (Pfeil), umfassend die Insertionsposition, für BG, NB, TE, SW und FA festgestellt. In allen Stämmen wurde ein 299-bp-Fragment festgestellt, das die Insertionsposition nicht enthielt. Außerdem wurden die stammspezifischen Fragmente 600 bp, 700 bp, 710 bp festgestellt. Diese Fragmente waren einfach zu identifizieren und wurden mit hoher Reproduzierbarkeit festgestellt.
Beispiel 16
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 15 und 16 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass bei Verwendung der in den SEQ ID NOs: 15 und 16 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer eine amplifizierte Genombande bei etwa 500 bp nachgewiesen wurde. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 17
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 17 und 18 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden und der Primer-Anelierungsschritt in der PCR bei 62°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 17 und 18 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 260 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 18
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 19 und 20 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden und der Primer-Anelierungsschritt in der PCR bei 65°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 19 und 20 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurden zwei amplifizierte Genombanden bei etwa 500 bp und etwa 550 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 19
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 21 und 22 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 21 und 22 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 710 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 20
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 23 und 24 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 23 und 24 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 330 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 21
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 25 und 26 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden und nach Durchführen der PCR 20 PCR-Zyklen unter den gleichen Bedingungen wie bei der vorherigen PCR durchgeführt wurden, wobei 1 ml Reaktionslösung als Matrizen-DNA verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 25 und 26 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurden zwei amplifizierte Genombanden bei etwa 160 bp und etwa 200 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 22
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 29 und 30 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden und der Primer-Anelierungsschritt in der PCR bei 57°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 29 und 30 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 350 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 23
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 21 identisch, mit der Ausnahme, dass synthetische Oligonucleotide, umfassend die in den SEQ ID NOs: 30 und 31 beschriebenen Desoxyribonucleotidsequenzen, als Primer verwendet wurden, die PCR zweimal durchgeführt wurde und die Reaktionslösung mit dem Restriktionsenzym NlaIII (Daiichi Pure Chemicals) behandelt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn synthetische Oligonucleotide, umfassend die in den SEQ ID NOs: 31 und 32 beschriebenen Desoxyribonucleotidsequenzen, als Primer verwendet wurden, wurden zwei amplifizierte Genombanden bei etwa 220 bp und etwa 360 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden zwölf Hopfensorten in vier Kategorien eingeteilt.
Beispiel 24
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 33 und 34 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, der Primer-Anelierungsschritt in der PCR bei 67°C durchgeführt wurde und die Reaktionslösung mit dem Restriktionsenzym TaqI (Boehringer Mannheim) behandelt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 33 und 34 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurden zwei amplifizierte Genombanden bei etwa 220 bp und etwa 270 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden zwölf Hopfensorten in drei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 25
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass die in den SEQ ID NOs: 35 und 36 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden und der Primer-Anelierungsschritt in der PCR bei 58°C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wenn die in den SEQ ID NOs: 35 und 36 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide als Primer verwendet wurden, wurde eine amplifizierte Genombande bei etwa 400 bp nachgewiesen. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Bande wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien eingeteilt.
Beispiel 26
Die PCR und die Elektrophorese wurden genauso wie im Beispiel 13 unter Verwendung von 33 Picomol gemeinem Beck-Primer (A25, 5'-GGTCAGGCACCA-3') durchgeführt. Als Ergebnis wurden mehr als zehn amplifizierte Genombanden von etwa 200 bis 2000 bp festgestellt, und die Bande bei etwa 500 bp, die abhängig vom jeweiligen Stamm vorlag oder fehlte, wurde als ein RAPD-Marker verwendet. Wenn die Desoxyribonucleotidsequenz dieses Markers untersucht wurde, wurden die in 4 dargestellten Ergebnisse erhalten.
Die in den SEQ ID NOs: 19 und 20 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide entsprachen den Sequenzen, die durch die in 4 von Rechtecken umschlossenen Bereiche A und B bezeichnet sind. Die in den SEQ ID NOs: 37 und 38 beschriebenen Oligonucleotide wurden gemäß den Sequenzen entworfen, die durch die Bereiche C und D bezeichnet sind, die in 4 unterstrichen sind. Diese in den SEQ ID NOs: 37 und 38 beschriebenen Oligonucleotide umfassen Teile des RAPD-Markers. Diese in den SEQ ID NOs: 19 und 20 beschriebenen Oligonucleotide enthalten primäre Sequenzen am 5'-Terminus.
Das Verfahren war mit dem von Beispiel 15 identisch, mit der Ausnahme, dass bei Verwendung der SEQ ID NOs: 19 und 20 als Primer 35 Anelierungsschritt-Zyklen bei 65°C durchgeführt wurden und dass bei Verwendung der SEQ ID NOs: 37 und 38 als Primer 30 Anelierungsschritt-Zyklen bei 60°C durchgeführt wurden. Als Ergebnis wurden bei Verwendung der SEQ ID NOs: 19 und 20 als Primer Banden bei 500 bp und 550 bp festgestellt, wie in Tabelle 4 gezeigt, und bei Verwendung der SEQ ID NOs: 37 und 38 als Primer wurde eine Bande bei 459 bp festgestellt. Aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden zwölf Hopfensorten in zwei Kategorien klassifiziert.
Beispiel 27
Die PCR und die Elektrophorese wurden genauso wie in Beispiel 13 unter Verwendung von 33 Picomol von gemeinem Beck-Primer (C16, 5'-CGCCCTGCAGTA-3') durchgeführt. Als Ergebnis wurden mehr als zehn amplifizierte Genombanden von etwa 200 bis 2000 bp festgestellt, und die Bande bei etwa 500 bp, die abhängig von der jeweiligen Sorte vorlag oder fehlte, wurde als ein RAPD-Marker verwendet. Wenn die Desoxyribonucleotidsequenz dieses Markers untersucht wurde, wurden die in 5 dargestellten Ergebnisse erhalten.
Die in den SEQ ID NOs: 15 und 16 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide basierten auf den Sequenzen, die durch die in 4 von Rechtecken umschlossenen Bereiche A und B bezeichnet sind. Die in den SEQ ID NOs: 39 und 40 beschriebenen Oligonucleotide beruhten auf den Sequenzen C und D, die in 5 unterstrichen sind.
Die SEQ ID NOs: 39 und 40 wurden als Primer verwendet und der Anelierungsschritt wurde 30 Zyklen bei 60°C durchgeführt. Eine amplifizierte Genombande bei 500 bp wurde bei allen Sorten festgestellt, jedoch konnten die Sorten nicht identifiziert werden. Andererseits wurden bei Durchführung eines identischen Verfahrens unter Verwendung von 15 und 16 die in Tabelle 4 dargestellten amplifizierten Genombanden erhalten, und aus dem Vorliegen oder der Abwesenheit dieser Banden wurden zwölf Hopfenstämme in zwei Kategorien klassifiziert.
Beispiel 28
Aus der allgemeinen Übersicht von Tabelle 4, in welcher die Typen der Beispiele 15 bis 27 zusammenfasst sind, ist ersichtlich, dass es möglich ist, jede von zwölf Hopfensorten zu unterscheiden.
Beispiele, bei denen die Fragmentgröße angegeben ist, wurden als Referenz für die Sortenidentifizierung genommen, und Beispiele, bei denen eine Behandlung mit Restriktionsenzymen erfolgte, sind in Klammern () gesetzt.
Tabelle 4
Beispiel 29
Hopfenpellets von Shinshu Wase (hergestellt von Northern Hop Agricultural Cooperative, Iwate-ken unter Lizenz von Sapporo K. K.) wurden in einem Mörser zerstoßen, und etwa 5 mg Genom-DNA wurden aus 20 mg des Pulvers extrahiert, wobei ein BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT (QIAGEN Inc.) verwendet wurde. Die Reinheit der erhaltenen DNA wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 28 untersucht, wobei synthetische Oligonucleotide, umfassend die in den SEQ ID NOs: 15 bis 38 beschriebenen Desoxyribonucleotidsequenzen, als Primer verwendet wurden.
Wenige unspezifische amplifizierte Banden traten auf, und der gewünschte Marker konnte einfach verifiziert werden. In wiederholten Reinheitstests wurden hoch-reproduzierbare Ergebnisse erhalten.
Anwendungsgebiet
Gemäß dem genetischen Identifizierungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann eine genaue und einfache Identifizierung von Hopfensorten durchgeführt werden, die nicht durch Umwelt- oder andere Bedingungen beeinflusst wird. Das genetische Identifizierungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann auch wirksam eingesetzt werden, um die Reinheit von Produkten zu untersuchen, in denen Hopfen ein Rohmaterial darstellt.
Somit kann durch Identifizierung von Hopfensorten das genetische Identifizierungsverfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um die Qualität von Produkten, die Hopfen enthalten, auf einem konstanten Niveau zu halten oder um diese Qualität zu verbessern.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer Hopfenpflanzen-Sorte unter Verwendung von zufälliger polymorpher DNA (RAPD) umfassend: (a) Bereitstellen einer Hopfenpflanzen-Sorte und eines ersten Primers/erster Primer zur Amplifikation einer Region, welche charakteristisch für Polymorphismus in der DNA der Hopfenpflanzen-Sorte ist, wobei der erste Primer eine Nucleotidsequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1 bis SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 10 bis SEQ ID NR: 14, oder der Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, welche das Komplement der zuvor ausgewählten Nucleotidsequenz umfasst; (b) Isolieren der DNA aus der Pflanzensorte; (c) Ausführen einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der DNA und des/der ersten Primer(s), wobei ein DNA-Molekül produziert wird; (d) Bestimmen der Sequenz des DNA-Moleküls; (e) Konstruktion zweiter Primer umfassend eine Sequenz, die in dem DNA-Molekül enthalten ist, wobei der zweite Primer eine Nucleotidsequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 15 bis SEQ ID NR: 38, oder der Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, welche das Komplement der zuvor ausgewählten Nucleotidsequenz umfasst; (f) Ausführen einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung des DNA-Moleküls und der zweiten Primer; (g) Bestimmen, ob die Polymerase-Kettenreaktion in der Produktion eines/von DNA-Molekül/Molekülen resultiert oder ob nicht; und (h) Identifizieren der Pflanzensorte falls das/die DNA-Molekül/Moleküle produziert wurde/wurden oder Identifizieren der Pflanzensorte falls das/die DNA-Molekül/Moleküle nicht produziert wurde/wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Vielzahl der ersten Primer bereitgestellt wird und die Polymerase-Kettenreaktion ausgeführt wird unter Verwendung der Vielzahl der ersten Primer.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Primer ein synthetisches Oligonucleotid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die zweiten Primer Nucleotidsequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kombinationen von SEQ ID NR: 15 und 16, SEQ ID NR: 17 und 18, SEQ ID NR: 19 und 20, SEQ ID NR: 21 und 22, SEQ ID NR: 23 und 24, SEQ ID NR: 25 und 26, SEQ ID NR: 27 und 28, SEQ ID NR: 29 und 30, SEQ ID NR: 31 und 32, SEQ ID NR: 33 und 34, SEQ ID NR: 35 und 36 und SEQ ID NR: 37 und 38.