WO2013183779A1 - ホップ品種の識別方法 - Google Patents

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WO2013183779A1
WO2013183779A1 PCT/JP2013/065895 JP2013065895W WO2013183779A1 WO 2013183779 A1 WO2013183779 A1 WO 2013183779A1 JP 2013065895 W JP2013065895 W JP 2013065895W WO 2013183779 A1 WO2013183779 A1 WO 2013183779A1
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region
seq
identification
single nucleotide
hop
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PCT/JP2013/065895
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啓正 山内
進 古久保
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サントリーホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying a variety of hops using an identification marker composed of at least one single nucleotide polymorphism that differs between varieties, and a method for producing the identification marker.
  • Hop (scientific name: Humulus lupulus) is a hermaphroditic vine plant belonging to the hemp family. The female strain is attached to a flower similar to a pinecone called “Rika”, which is the raw material for beer. Unfertilized camellia has yellow grains called lupulin, which has a unique beer aroma and a refreshing bitterness. Hops are one of the indispensable ingredients for beer brewing, with the role of adding bitterness and refreshing fragrance, improving foam retention, improving the beer's terry, and controlling the growth of various germs. .
  • Hops are cultivated in Germany, the United States, the Czech Republic, the United Kingdom, France, China, Slovenia, South Africa, Australia, New Zealand, Japan, and so on. Hop varieties include aroma hops and bitter hops. Aroma hop is a hop that gives a gorgeous fragrance and a mild bitter taste, and bitter hop is a hop that gives a tight bitter taste. As described above, hops have different fragrances and tastes for each variety. Therefore, in order to brew high quality beer, it is important to select a hop variety suitable for the purpose. And in order to maintain the quality stably, it is important to accurately check whether the ordered raw material hop is delivered correctly.
  • hop spikelets are generally dried, crushed, compressed and shaped into pellets and used for beer brewing. Therefore, it is very difficult to distinguish varieties from the appearance features of spikelets.
  • chemical components such as bitterness components and essential oil components obtained from spikelets are also easily affected by environmental factors, and some varieties show similar values. There was a limit.
  • a variety identification method applying genetic engineering has been developed. In these methods, a variety is identified by detecting a difference in base sequence between varieties, that is, a polymorphism.
  • a polymorphism In Hop, in the International Publication (WO1997 / 005281), DNA regions that differ between varieties are found by the RAPD method, primers that can amplify the regions are designed, and polymorphic regions are amplified by PCR using the primers.
  • PCR is performed on the genomic DNA using primers such as random primers and STS primers to amplify DNA that can identify hop varieties.
  • primers such as random primers and STS primers to amplify DNA that can identify hop varieties.
  • a method for discriminating hop varieties based on the By performing PCR on microsatellite regions containing polymorphism using primers designed to amplify the region, by amplifying microsatellite DNA and analyzing the difference in length of amplified DNA fragments A method for identifying a variety is disclosed.
  • the above method for identifying hop varieties by using polymorphisms on the hop genome is an effective means for accurately identifying hop varieties without being affected by the hop cultivation environment, harvest time, or preservation method.
  • each method is discriminated based on the presence or absence of amplification by PCR or the difference in size, so that it is susceptible to variations in conditions such as enzyme reaction, electrophoresis, and gel staining, and there is a problem in reproducibility. That is, since it is difficult to distinguish whether a band does not appear due to PCR or staining defects, or whether the band is not originally amplified, there is a risk of mistaking the result.
  • the above method includes detection of DNA fragments by capillary electrophoresis and laser, and detection by staining of gel electrophoresis samples, it is possible to specify the type of hop that is the subject and to estimate the presence or absence of mixing of different types. Even if possible, it is difficult to estimate or specify the mixed varieties and to analyze the mixing ratio of the mixed varieties. In addition, when DNA is fragmented due to deterioration or damage of the specimen, the accuracy of analysis is lowered and there is a risk of mistaking the result.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • hops are diploid, have 20 chromosomes (10 pairs of double strands), have a huge genome size of about 2.7 to 3 billion base pairs (2.7 to 3 GB), and are related to structural genes. Also not clarified. Therefore, from the results of genome analysis, it has not been carried out to find SNPs between hop varieties in a sufficient number that can identify multiple varieties, and a method for identifying hop varieties using SNP as a polymorphic marker is not yet known. It is not done.
  • the present invention provides a method for identifying a variety of hops using an identification marker comprising a single nucleotide polymorphism between varieties, and a method for producing the identification marker.
  • the ordered raw material hop when confirming whether the ordered raw material hop is the cultivar according to the order and whether or not different varieties are mixed, it is affected by variations in conditions such as enzyme reaction, electrophoresis, and gel staining.
  • variations in conditions such as enzyme reaction, electrophoresis, and gel staining.
  • hop varieties that can estimate or identify the mixed varieties and analyze the mixing ratio Development of an identification method has been strongly desired.
  • the present invention may be as follows.
  • a method for identifying a hop variety which includes the following steps: (I) A step of amplifying a DNA fragment containing a variety identification region for DNA derived from a hop of a subject, wherein the variety identification region is composed of at least one single nucleotide polymorphism (SNP) that differs among hop varieties.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Said step comprising an identification marker (Ii) identifying a single nucleotide polymorphism genotype of the DNA fragment amplified in the above step (i); (Iii) Single nucleotide polymorphism genotype in the variety identification region for the hop DNA of the subject identified in the step (ii) and single nucleotide polymorphism in the corresponding region for the DNA of the known hop variety Comparing the genotypes of the types, and analyzing the match or mismatch between the hop of the subject and the known hop variety for the genotype of a single nucleotide polymorphism in the region; (Iv) a step of identifying the hop variety of the subject based on the analysis result of the step (iii); Said method.
  • step (ii) is performed by identifying the base sequence of the variety identification region for the DNA fragment amplified in step (i), and step (iii) is the analyte identified in step (ii)
  • the base sequence of the cultivar identification region for the hop DNA and the base sequence of the corresponding region for the DNA of the known hop variety are compared, and the hop of the subject and the known hop variety of the identification marker in the region are compared.
  • the method according to (1) which is performed by analyzing a match or mismatch between the two.
  • step (ii) the DNA fragment amplified in step (i) is brought into contact with a probe and / or primer for detecting a single nucleotide polymorphism that differs between hop varieties, thereby producing a single nucleotide polymorphism gene.
  • the method according to (1) which is a step of identifying a mold.
  • the product identification area has the following steps: (A) performing transcriptome analysis using hops of two or more different varieties; (B) a step of assembling each product type based on the base sequence of the DNA fragment obtained as a result of the step (a); (C) comparing the contigs and / or singlets obtained as a result of the step (b) between varieties, and searching for single nucleotide polymorphisms (SNPs) that differ between varieties; (D) a step of selecting a region containing the SNP as a result of the SNP search in the step (c) and designing a primer for amplifying the region; (E) Confirming that the region selected in the above step (d) can be amplified using the primer designed in the above step (d) and using the DNA extracted from hops as a template, and determining its base sequence Determining an identification region and a primer capable of amplifying it; (F) using the primer determined in the step (e) above, amplifying the identification region using the DNA extracted from the hop
  • the product identification region includes a region containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, a region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, a region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 From the region containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, the region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, and the region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • the product identification area is as follows: In addition to the following three regions: a region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, a region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, and a region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11; : A part or all of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 and / or SEQ ID NO: 14, and a region
  • Step (i) comprises a combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, a combination of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, a combination of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and a combination of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • Step (i) is as follows: In addition to the three primer sets of a combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, a combination of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and a combination of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, The method according to any one of (1) to (3), wherein the method is performed by a PCR reaction using a primer set of a combination.
  • a method for producing an identification marker comprising a combination of single nucleotide polymorphisms that differ between hop varieties, and the following steps: (A) performing transcriptome analysis using hops of two or more different varieties; (B) a step of assembling each product type based on the base sequence of the DNA fragment obtained as a result of the step (a); (C) comparing the contigs and / or singlets obtained as a result of the step (b) between varieties, and searching for single nucleotide polymorphisms (SNPs) that differ between varieties; (D) a step of selecting a region containing the SNP as a result of the SNP search in the step (c) and designing a primer for amplifying the region; (E) Confirming that the region selected in the above step (d) can be amplified using the primer designed in the above step (d) and using the DNA extracted from hops as a template, and determining its base sequence Determining an identification region and a primer capable of amplifying it; (F
  • the nucleic acid comprising at least one.
  • a primer comprising the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, wherein the primer is used for hop variety identification.
  • (16) In one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 15, which is a probe, At least one single nucleotide polymorphism or insertion deletion site at the position specified in FIG. 1, FIG. 2, FIG. 3, FIG. 4 or FIG.
  • a method for detecting mixing of different varieties in a hop sample the following steps: (I) A step of amplifying a DNA fragment containing a variety identification region for DNA extracted from a hop sample of a subject, wherein the variety identification region differs between hop varieties.
  • Comprising the identification marker comprising: (Ii) analyzing the base sequence of the variety identification region for the DNA fragment amplified in the step (i) to obtain sequence data; (Iii) comparing the information on the single nucleotide polymorphism site constituting the identification marker with the information on the corresponding single nucleotide polymorphism site of the normal product in the sequence data obtained in the step (ii); and (Iv) A step of determining the presence or absence of mixing of different varieties in the hop sample, wherein the single nucleotide polymorphism site information of the sequence data obtained in the step (ii) is a single nucleotide polymorphism corresponding to a normal product If it matches the information on the part, it is judged that there is no mixing of different varieties, or the information on the single nucleotide polymorphism part of the sequence data obtained in the above step (ii) is the single nucleotide polymorphism corresponding to the normal product.
  • step (iv) when the information on the single nucleotide polymorphism site of the sequence data obtained in the above step (ii) does not match the information on the corresponding single nucleotide polymorphism site of the normal product, A step of identifying the base from information derived from a non-normal product appearing at the single nucleotide polymorphic site of the sequence data obtained in step (ii); and (vi) identified in step (v) above.
  • a step of collating a base different from a normal product at a single nucleotide polymorphism site with an identification marker and estimating or specifying a mixed variety The method according to (17), further comprising: (19) Following the step (iv), the following steps: (V) In the above step (iv), when the information on the single nucleotide polymorphism site of the sequence data obtained in the above step (ii) does not match the information on the corresponding single nucleotide polymorphism site of the normal product, A step of identifying the base from information derived from other than the normal product appearing at the single nucleotide polymorphism site of the sequence data obtained in the step (ii), and obtaining a mixing ratio; and (vi) the step (v) A step of collating a base different from a normal product of the single nucleotide polymorphism site specified in (1) with an identification marker, and estimating or specifying a mixed cultivar and a mixing ratio thereof; The method according to (17), further comprising: (20
  • hop varieties By using a single nucleotide polymorphism identification marker between varieties, it is now possible to identify hop varieties, whether the ordered raw material hops are the varieties as ordered or whether different varieties are mixed When confirming whether it is possible, it is possible to accurately identify the type of hop that is the subject and to detect the presence or absence of mixing of different types. Furthermore, when different varieties are mixed, not only the presence / absence of mixing but also the mixed varieties can be estimated or specified, and the mixing ratio can be analyzed.
  • FIG. 1 is a diagram showing a SNP analysis result in the A1 region of 14 hops and a base code table.
  • the position of the SNP indicates the position of the SNP counted from the 5 'side of the consensus sequence (SEQ ID NO: 9) of the A1 region.
  • the analyzed SNPs are 24 places.
  • the 14 hops subjected to the analysis were classified into 9 types of diplotypes.
  • FIG. 2 is a diagram showing the SNP analysis results in the B1 region of 14 types of hops.
  • the position of the SNP indicates the position of the SNP counted from the 5 'side of the B1 region consensus sequence (SEQ ID NO: 10). There are 10 SNPs analyzed.
  • FIG. 3 is a diagram showing SNP analysis results in the C1 region of 14 types of hops.
  • the position of the SNP indicates the position of the SNP counted from the 5 'side of the consensus sequence (SEQ ID NO: 11) of the C1 region.
  • the analyzed SNPs are 29 positions, of which the 129th to 134th bases of SEQ ID NO: 11 are the insertion deletion (indel) part.
  • the 14 hops subjected to the analysis were classified into 3 types of diplotypes.
  • FIG. 4 is a diagram showing SNP analysis results in the A1-2-L region and the A1-2-R region of Perle and Northern Brewer.
  • the position of the SNP is the SNP counted from the 5 ′ side for each of the two-variety consensus sequence (SEQ ID NO: 12) of the A1-2-L region and the two-variety consensus sequence (SEQ ID NO: 14) of the A1-2-R region. Indicates the position.
  • SEQ ID NO: 12 two-variety consensus sequence
  • SEQ ID NO: 14 two-variety consensus sequence
  • FIG. 5 is a table summarizing hop varieties and diplotypes for identification markers used for variety identification.
  • FIG. 6 is a diagram showing SNP analysis results in the A1-2-L region and the A1-2-R region of Sladeck, Spalter, Perle, Tettnang, and Northern Brewer.
  • the positions of the SNPs are the SNPs counted from the 5 ′ side for each of the 5 types consensus sequence (SEQ ID NO: 13) of the A1-2-L region and the 5 types consensus sequence (SEQ ID NO: 15) of the A1-2-R region. Indicates the position. There were 23 SNPs analyzed for the A1-2-L region, of which the 12, 183 to 191st and 396th bases of SEQ ID NO: 13 were indel portions. There were 28 SNPs analyzed for the A1-2-R region, of which the 437th base of SEQ ID NO: 15 was the indel portion.
  • FIG. 7 is a table summarizing the diplotypes of identification markers in the A1-2-L region (SEQ ID NO: 13) for Sladeck, Spalter, Perle, Tettnang, and Northern Brewer.
  • FIG. 8 is an electropherogram showing the result of analyzing the base sequence of the A1 region for a mixed sample of Saaz and Premier. The base number of the A1 region follows the base number in SEQ ID NO: 9.
  • the present invention relates to a method for identifying a variety of hops using an identification marker composed of at least one single nucleotide polymorphism (SNP) that differs between varieties, a method for producing the identification marker, and the identification marker.
  • the present invention relates to a method for detecting contamination of different varieties in a hop sample, the identification marker, a variety identification primer designed to amplify a region having the identification marker, and a variety identification probe for detecting the identification marker .
  • the present application relates to an invention characterized in that a variety of hops is identified using an identification marker composed of at least one SNP that differs between the varieties. Specifically, the DNA of the hop of the subject is extracted, and the base of the site corresponding to the identification marker in the base sequence corresponding to the base sequence of the region having the identification marker made of SNP is the base of the identification marker. If they match, and if they match, the hop type of the subject is specified as the type of the identification marker.
  • the “identification marker” refers to an index for identifying hop varieties, and is composed of one or more single nucleotide polymorphisms that differ between varieties.
  • the identification marker of the present invention is determined so that there is a one-to-one correspondence between the variety and the identification marker so that there is no overlap between the identification target varieties. You may change the single nucleotide polymorphism to comprise. For example, when there are only two varieties to be identified, it is sufficient to use an identification marker composed of one single nucleotide polymorphism. When there are many varieties to be identified, a combination of a plurality of single nucleotide polymorphisms is used.
  • the identification marker is determined so that there is no overlap by (in some cases a combination of a plurality of single nucleotide polymorphisms of a plurality of identification regions).
  • the identification markers are basically determined so that there is no duplication.
  • a plurality of varieties with overlapping identification markers that is, a plurality of varieties having the same identification marker
  • the “identification region” means a region containing an identification marker in hop-derived DNA.
  • the identification area is not limited to one area, and may be a plurality of areas.
  • the nucleic acid region that amplifies the DNA fragment of the subject for the identification of the variety may be described as a “variety identification region”.
  • the type identification area may be the same area as the identification area, or may be set separately according to the purpose of type identification.
  • the product type identification area is not limited to one area, and may be a plurality of areas.
  • the present application provides a method of creating an identification marker for identifying a variety of hops.
  • the identification marker of the present invention performs transcriptome analysis using hops of two or more different varieties, selects a region where a relatively large number of single nucleotide polymorphisms (SNPs) are present, and designs a primer Then, the identification region and the primer capable of amplifying it are determined. Next, DNA is extracted from the cultivar to be discriminated, amplified by the discriminating region using the primers, determined in base sequence, and compared between the varieties, thereby comprising at least one SNP necessary for discrimination of the cultivar to be discriminated By determining the identification marker to be made.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a method for producing an identification marker for identifying a variety of hops includes the following steps: (A) performing transcriptome analysis using hops of two or more different varieties; (B) a step of assembling for each type based on the base sequence of the DNA fragment obtained as a result of the step (a); (C) comparing the contigs and / or singlets obtained as a result of the step (b) between varieties, and searching for single nucleotide polymorphisms (SNPs) that differ between varieties; (D) a step of selecting a region containing the SNP as a result of the SNP search in the step (c) and designing a primer for amplifying the region; (E) Confirming that the region selected in the above step (d) can be amplified using the primer designed in the above step (d) and using the DNA extracted from hops as a template, and determining its base sequence Determining an identification region and a primer capable of amplifying it; (F) using the primer determined in the step (e) above
  • a transcriptome is the total of all mRNAs (or primary transcripts, transcripts) present in a tissue or cell in a specific state.
  • RNA is roughly extracted from each tissue of multiple hops, and total mRNA (poly (A) + RNA) is purified from total RNA, and cDNA is synthesized using this mRNA as a template. Since the obtained cDNA library has both a high expression level and a low expression level, the difference in expression level is corrected (homogenized), and further purification based on the size is performed. Subsequently, cDNA sequence analysis is performed using an ultrahigh-speed DNA base sequence analyzer.
  • the hop tissue from which the total RNA is extracted various tissues constituting buds, leaves, stems, and spikelets are preferably used, but are not particularly limited thereto.
  • strain, its growth stage, etc. are not specifically limited.
  • the hop structure may be raw or dried, or may be processed into a pellet, for example.
  • RNA is easily degraded, it is preferable to quickly use a fresh tissue collected from a hop strain, and it is preferable to use young leaves as a tissue containing a large amount of RNA.
  • the hop varieties used for transcriptome analysis may be two or more different varieties, and the varieties and number to be used can be selected according to the purpose. In order to detect a larger amount of SNP, it is preferable to use three or more different varieties. It is also preferable to select and use from among the identification target varieties.
  • Each step of transcriptome analysis, from extraction of total RNA from hop tissue to sequence analysis of cDNA, can be performed using a generally adopted method.
  • sequence assembling is performed for each type based on the base sequence of the DNA fragment (cDNA) revealed by the transcriptome analysis for each type as described above. Sequence assembly is said to reconstruct the original long base sequence from short DNA fragments. For example, clustering is performed based on the base sequences of DNA fragments obtained as a result of step (a) based on whether or not they have base sequences that overlap each other, and overlapping portions of clustered DNA fragments are found and connected. (Assemble) to obtain a single sequence. Sequences assembled in this way are collectively referred to as “contigs”, and single reads that have not participated in contig formation are collectively referred to as “singlets”. The contig can be produced by array assembling by a generally adopted method.
  • a contig and / or a singlet (preferably a contig, more preferably a contig and a singlet) of a selected variety is designated as a reference sequence, and whether or not a single lead of another variety has a common part based on this To map each.
  • the contig consisting of the mapped single read is determined from the assembly information developed on the analysis software. Alignment is performed for contigs and / or singlets of the reference and other varieties obtained in this manner, and SNP is detected.
  • SNP is detected by mapping and aligning the other kinds as a reference in the same manner as described above, and combining these results into SNP data. Is preferred.
  • SNPs is detected by mapping and aligning the other kinds as a reference in the same manner as described above, and combining these results into SNP data. Is preferred.
  • Step D Step of selecting a region containing SNP and designing a primer
  • a region where there is a SNP that can be used for identification exists. select.
  • the purpose is to identify a large number of varieties, it is desirable to select a region where a large number of SNPs exist. More specifically, for ease of analysis, priority is given to a region in which a SNP exists in a homozygote (the base sequences of each diploid are identical), and SNP per contig
  • a region having a large number is selected, there is no particular limitation.
  • Primer design can be performed by a generally employed method.
  • the primer designed as described above is designed based on a contig sequence or a singlet sequence prepared from a cDNA library. I don't know if it will successfully amplify in genomic DNA including regions and introns. For this reason, it is necessary to confirm amplification using genomic DNA extracted from hops. Even when amplified, it is necessary to confirm the nucleotide sequence by the Sanger method or the like in order to confirm the presence or absence of insertion deletion (indel) or microsatellite and the presence of the target SNP.
  • indel insertion deletion
  • a region containing SNP using as a template genomic DNA extracted from pellets of hop varieties (preferably hop varieties used in step (a)), dried spikelets, etc. Amplify and sequence. As a result, it can be amplified at an appropriate size and compared with the base sequence based on the transcriptome analysis to confirm that it can be applied to variety identification, and a region that can be used for identification (identification region) and amplify it. Determine possible primers. If amplification is not possible due to the presence of an intron, etc., or if the amplification size or base sequence is inconvenient or defective, reexamine the selected region and redesign the primer.
  • the identification region for producing the identification marker is not limited to one region, and a plurality of regions can be selected. By selecting a plurality of areas, it becomes possible to identify more types.
  • the identification region may include an insertion deletion (indel) portion.
  • indel insertion deletion
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • indels insertion deletions
  • insertion deletion (indel) parts can also be used as SNPs constituting identification markers.
  • step (F) The step of determining the base sequence of the identification region, and (g) The step of determining the identification marker of the identification target variety
  • step (e) is used to determine the identification region from the identification target variety.
  • Each identification region is amplified using the extracted genomic DNA as a template.
  • the identification target variety means a hop variety selected as an identification target, and includes two or more different varieties.
  • the hop is not particularly limited as long as it is a plant classified as the scientific name Humulus lupulus. For example, hops originating from Germany, the United States, the Czech Republic, the United Kingdom, France, China, Slovenia, South Africa, Australia, New Zealand, Japan, etc. can be mentioned.
  • Examples of European hops include Saaz, Sladeck, Premiant, tradition, Spalter, Spalter Select, Perle, Tettnang, Brewer's Gold, Northern Brewer, Magnum, Herkules, German Nugget, Taurus, Admiral, Aurora, Hersbrucker, HallertauertMeur, Examples include, but are not limited to, Mittelfrueh, Target, and the like.
  • Examples of American hops include Amarillo, Cascade, Centennial, Chinook, Cluster, Columbus, Crystal, Fuggle, Galena, Golding, Horizon, Liberty, Mount Hood, Nugget, Santiam, Sterling, Summit, Super Galena, Tettnanger, Tomahawk, Examples include, but are not limited to, Ultra, Willamette, Zeus, and the like.
  • the type and number of target varieties can be freely set according to the purpose of identification.
  • the target variety can be selected according to the purpose at that time, such as selecting a variety in which the cultivation area is nearby.
  • the identification target varieties are 14 types of hops originating in Germany and the Czech Republic shown in Table 4 of Example 1.
  • the amplified DNA fragment is sequenced and the base sequence is determined for the identification target variety selected according to the purpose.
  • Alignment is performed on the base sequence of the identification region of each identification target product type determined in step (f), and the SNP portion is extracted.
  • the identification markers are determined by combining the extracted SNPs so that the varieties and the identification markers correspond one-to-one so as not to overlap between the identification target varieties.
  • steps (f) and (g) may be performed according to the procedures shown in the following (1) to (11).
  • Obtaining Hops “DNA” used in the present invention can be obtained by extracting DNA from hop tissue.
  • tissue of hops various tissues constituting buds, leaves, stems, and spikelets are preferably used, but are not particularly limited thereto.
  • strain the cultivation method of a hop stock
  • the hop structure may be raw or dried, or may be processed into a pellet, for example.
  • the DNA extracted as described above is amplified by PCR.
  • the PCR method used in the present invention is not particularly limited, and includes various improved methods in addition to known PCR methods. The following is an example. That is, in addition to the primer set and template DNA, reagents such as Tris-HCl, KCl, MgCl 2 , each dNTP, and Taq DNA polymerase are mixed to obtain a PCR reaction solution.
  • One cycle of PCR consists of three steps: heat denaturation, annealing, and DNA strand elongation (synthesis) reaction by DNA polymerase. Each step is different, and sometimes requires the same reaction temperature and reaction time, and these are appropriately determined depending on the base sequence of the DNA region to be amplified, its length, and the like. Such an operation can be performed using a commercially available thermal cycler.
  • a primer pair capable of amplifying the identification region determined in the step (e) is used.
  • the primer set (A1-3L / A1-3R (SEQ ID NOs: 1 and 2)), the primer set (B1-1L / B1-1R (SEQ ID NOs: 3 and 4)), the primer set (C1- 1L / C1-1R (SEQ ID NOs: 5 and 6)) and / or primer sets (A1-2-1L / A1-2-1R (SEQ ID NOs: 7 and 8)) can be used.
  • PCR product As a method for evaluating the result of PCR (PCR product), an arbitrary method capable of identifying a specific DNA fragment, for example, electrophoresis, gel filtration, or hybridization, is used. Confirm that the DNA fragment is amplified.
  • the size is 651 bases long; the primer set (B1-1L / B1-1R (SEQ ID NOs: 3 and 4)) ) Is used, the size is 729 bases long; when the primer set (C1-1L / C1-1R (SEQ ID NOs: 5 and 6)) is used, the size is 646 bases long; the primer set (A1- When 2-1L / A1-2-1R (SEQ ID NOs: 7 and 8)) is used, it is confirmed that each size is amplified by about 1500 bases.
  • PCR product is separated from components used in the reaction such as surplus primers for use as a template for the cycle sequencing reaction. This purification can be performed, for example, using a commercially available QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) according to the protocol attached to the product.
  • Qiagen QIAquick PCR Purification Kit
  • Cycle sequence reaction and purification of sequence product In order to sequence the PCR product purified as described above, a cycle sequence reaction is performed using it as a template. This method is similar to the PCR method, and uses a thermal cycler to repeatedly perform the three steps of thermal denaturation, annealing, and DNA strand extension reaction with DNA polymerase. In this method, various single-stranded DNAs having different lengths are synthesized in the presence of a terminator labeled with four different fluorescent dyes. For example, a commercially available BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies) may be used as the cycle sequencing method.
  • the Japanese version protocol of the kit (p.22 “Single-stranded DNA and double-stranded DNA cycle sequence”, p.25 “GeneAmpPCR System 9700, 9600, 2700, 2400 cycle sequence” and p. 38-40 “Purification by spin column (or spin plate)”).
  • the base sequence of the primer used may be the same as that used for amplification of the target DNA fragment by PCR. That is, if necessary, a predetermined substance is added to a PCR product purified solution diluted with sterilized distilled water to prepare a cycle sequence reaction solution.
  • a sequencing product that is, a mixed solution of single-stranded DNA is purified from the reaction solution obtained above, and a sample to be used for the subsequent sequencer is prepared.
  • An example of this method is a method using CENTRISEP Spin Column (Life Technologies), which is operated according to the attached protocol to obtain a target sample.
  • Sequence of DNA fragment The sequence product obtained by the above dye terminator method is sequenced.
  • electrophoresis is generally used.
  • electrophoresis is performed using ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, and the fluorescent substance used for labeling is different for each base.
  • One example is to sequentially determine the base sequence using a detector.
  • Bases are stored means that the columns of the alignment data obtained are all the same bases in the base sequences of all the identification target varieties. Exclude all extracted sites. The reason for excluding all stored sites is as follows.
  • the present invention is characterized by focusing on a single nucleotide polymorphism portion excluding a portion common to all identification target varieties, and the single nucleotide polymorphism has a correlation with the variety, so that the identification is performed. This is because a marker is produced.
  • the extraction method may be any method such as visual inspection or machine operation as long as it can extract the bases stored in the base sequences of all the identification target varieties.
  • the identification marker is determined using the SNP remaining after the above exclusion. As described above, the identification marker according to the present invention is determined so that there is a one-to-one correspondence between the product type and the identification marker so that there is no overlap between the product types to be identified. The identification marker is determined each time the SNP that constitutes the identification marker according to the purpose of use, that is, the number and type of varieties to be identified. For example, when only two specific varieties are identified, one SNP that can identify the two varieties can be selected as an identification marker.
  • a plurality of SNPs are combined to determine identification markers so that there is no overlap between the varieties. be able to.
  • the 14 types are classified into 9 types from 24 SNPs present in the A1 region (SEQ ID NO: 9).
  • any one SNP in the A1-2-L region and the A1-2-R region can be determined as the identification marker.
  • A1-2-2 Twenty-three SNPs (11 of which are insertion-deletion portions) present in the L region can be determined as identification markers.
  • Example 5 for the aspect of identifying various types.
  • 22 bases base numbers 64-85
  • Zeus has no insertion sequence.
  • the length of the inserted sequence is not particularly limited, but is, for example, 19 to 25 bases.
  • SNPs are also observed in this insertion sequence (base numbers 64th, 67th, 75th), and SNPs in the insertion sequence can be used as identification markers.
  • the length of the repeated sequence (CA) or (TA) reaching base number 141 following this insertion sequence is also an identification element.
  • Summit is 12 bases longer than Premier and Zeus.
  • hops as shown in Table 4 when 14 types of hops as shown in Table 4 are to be identified, they can be classified into 3 types from 29 SNPs present in the C1 region (SEQ ID NO: 11). If the country of origin (for example, Galena) is included, the 76th to 80th, 93th, 136th, 138th, 163rd, 165th, 245th, 313th, 321st, 373th, 376th, 435th, 438th, 438th bases are also SNPs and are identified become a marker.
  • country of origin for example, Galena
  • the identification marker of the present invention may be prepared using genomic DNA, mitochondrial DNA, or chloroplast DNA derived from hops of two or more different varieties.
  • genomic DNA derived from hops of two or more different varieties may be used.
  • the method for producing the identification marker includes the following steps: (A-1) extracting genomic DNA, mitochondrial DNA, or chloroplast DNA from hop tissues of two or more different varieties; (A-2) a step of randomly cutting the DNA obtained as a result of the step (a-1) and selecting a fragment of an appropriate size; (A-3) determining the base sequence of the DNA fragment obtained in the above step (a-2); (B) Assembling for each product type based on the base sequence of the DNA fragment obtained as a result of the above step (a-3); (C) comparing the contigs and / or singlets obtained as a result of the step (b) between varieties, and searching for single nucleotide polymorphisms (SNPs) that differ between varieties; (D) a step of selecting an identification region containing SNP as a result of the SNP search in the step (c) and designing a primer for amplifying the region; (A-1) extracting genomic DNA, mitochondrial DNA, or chloroplast DNA from hop tissues of two or more different varieties;
  • Steps (a-1) to (a-3) can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • an ultrafast DNA base sequence analyzer when determining the base sequence of a DNA fragment.
  • Steps (b) to (d) and (f) to (g) can be performed by the method described in the method according to the transcriptome analysis which is the aspect described above.
  • SNPs in the translation region or 5 ′ or 3 ′ untranslated region are searched based on mRNA not containing introns, whereas genomic DNA, mitochondrial DNA, or chloroplasts are searched.
  • SNP search is performed for the entire DNA region including introns. From this, when genomic DNA, mitochondrial DNA, or chloroplast DNA is used, amplification confirmation of the region by a primer designed to amplify the region containing SNP in the method for producing an identification marker by transcriptome analysis The step (e) corresponding to can be omitted.
  • the identification markers are prepared by a two-step method of comparing the nucleotide sequences of the identification regions using all the identification target varieties and determining the SNP suitable for the identification marker.
  • the SNP suitable for the identification marker can be determined by comparing the base sequences of the identification region. That is, in the two modes described above, when all the identification target varieties are used from the beginning, the step (f) of determining the base sequence of the identification region of the identification target varieties becomes unnecessary.
  • Hop variety identification method includes the following steps: (I) A step of amplifying a DNA fragment containing a variety identification region for DNA derived from a hop of a subject, wherein the variety identification region is composed of at least one single nucleotide polymorphism (SNP) that differs among hop varieties.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Said step comprising an identification marker (Ii) identifying a single nucleotide polymorphism genotype of the DNA fragment amplified in the above step (i); (Iii) Single nucleotide polymorphism genotype in the variety identification region for the hop DNA of the subject identified in the step (ii) and single nucleotide polymorphism in the corresponding region for the DNA of the known hop variety Comparing the genotypes of the types, and analyzing the match or mismatch between the hop of the subject and the known hop variety for the genotype of a single nucleotide polymorphism in the region; (Iv) a step of identifying the hop variety of the subject based on the analysis result of the step (iii); May be included.
  • the hop of the subject is not particularly limited as long as it is a plant classified as the scientific name Humulus lupulus. Examples thereof include, but are not limited to, European-origin hops and American-origin hops listed in the item of the method for producing an identification marker.
  • the subject's hops are 14 types of hops shown in Table 4 of Example 1.
  • a process of amplifying a DNA fragment including a variety identification region A DNA fragment including a variety identification region is obtained by extracting genomic DNA from a hop of a subject whose species is to be identified, and using this as a template as an identification marker A DNA fragment containing a variety identification region is amplified using a variety identification primer capable of amplifying a region having a. Extraction of genomic DNA and amplification of DNA fragments are performed by, for example, “(f) determining the nucleotide sequence of the identification region” and “(g) determining the identification marker of the identification target variety” in the above-mentioned ⁇ Method for producing identification marker>. In the item of “Step”, the procedure may be performed according to or in accordance with the method described in (1) Obtaining hops to (3) Amplifying DNA fragments.
  • the type identification area is an area including the identification marker produced by the above-described identification marker production method.
  • the variety identification region may be the plurality of regions.
  • the variety identification region is a single region where all of these exist, or a plurality of regions where at least one single nucleotide polymorphism exists. There may be.
  • the variety identification region may be a region that is part or all of the base sequence of SEQ ID NO: 9 (A1 region) and includes at least one single nucleotide polymorphism indicated by the symbol n
  • the product type identification region may be a region including the base sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the variety identification region may be a region that is part or all of the base sequence of SEQ ID NO: 10 (B1 region) and includes at least one single nucleotide polymorphism indicated by the symbol n.
  • the region may be a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the variety identification region may be a part of or all of the base sequence of SEQ ID NO: 11 (C1 region) and a region including at least one single nucleotide polymorphism or indel portion indicated by the symbol n.
  • the variety identification region may be a region including the base sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the variety identification region is a part or all of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 or 13 (A1-2-L region) and comprises at least one of the single nucleotide polymorphism or indel portion indicated by the symbol n.
  • the product identification region may be a region including the base sequence of SEQ ID NO: 12 or 13.
  • the variety identification region includes at least one of the single nucleotide polymorphism or indel portion indicated by the symbol n, which is part or all of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 or 15 (A1-2-R region).
  • the region may be a region, and the type identification region may be a region including the base sequence of SEQ ID NO: 14 or 15.
  • the cultivar identification region is a part or all of the base sequence of SEQ ID NO: 9 (A1 region) and includes at least one of the single nucleotide polymorphisms represented by n;
  • SEQ ID NO: 10 (B1 A region that includes at least one of the single nucleotide polymorphisms indicated by n; a part or all of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 (C1 region) A region containing at least one of the indicated single nucleotide polymorphisms or indel portions; a single nucleotide polymorphism indicated by n, which is part or all of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 or 13 (A1-2-L region) A region comprising at least one of a type or an indel portion; and a single nucleotide polymorphism or indel portion represented by n, which is a part or all of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 or 15 (A1-2-
  • the variety identification region is a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 (A1 region), a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 (B1 region), a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 (C1 region), a sequence Two or more regions selected from the group consisting of a region containing the base sequence of No. 12 or 13 (A1-2-L region) and a region containing the base sequence of SEQ ID No. 14 or 15 (A1-2-R region) There may be 3 or more, 4 or more, or all 5 regions.
  • the variety identification region is a part or all of the base sequence of SEQ ID NO: 9 (A1 region), and includes at least one single nucleotide polymorphism represented by n, SEQ ID NO: 10 ( A part or all of the base sequence of B1 region), including at least one of the single nucleotide polymorphisms indicated by n, and part or all of the base sequence of SEQ ID NO: 11 (C1 region),
  • SEQ ID NO: 12 or 13 A part or all of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 or 15 (A1-2-R region) or a part of the nucleotide sequence comprising at least one of the single nucleotide polymorphisms or indel part indicated by n Or all and indicated by n Region comprising at least one nucle
  • the variety identification region is a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 (A1 region), a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 (B1 region), and a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 (C1 region), In addition to one or more, preferably two or more, more preferably all three, selected from the group consisting of: a part or all of the base sequence of SEQ ID NO: 12 or 13 (A1-2-L region) A part or all of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 or 15 (A1-2-R region) or a region containing at least one of the single nucleotide polymorphisms or indel moieties represented by n and represented by n Or a region containing at least one of the single nucleotide polymorphism or indel portion.
  • the variety identification region is a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 (A1 region), a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 (B1 region), and a region containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 (C1 region),
  • Variety identification primer is a primer designed to amplify the identification region, which was determined when producing the identification marker, or a primer designed separately to amplify the region containing the identification marker (variety identification region) It may be.
  • the variety identification primer may be a primer that can amplify each region.
  • the variety identification primer may be a primer capable of amplifying one region where all of these are present, and at least one single nucleotide polymorphism is present.
  • a plurality of primers each capable of amplifying a plurality of existing regions may be used.
  • Primers that can be used as breed identification primers include primers having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-8.
  • Examples of primer sets used for DNA fragment amplification in step (i) include a primer combination comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, a primer combination comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, and SEQ ID NO: 5 And a primer set of one or more combinations selected from the group consisting of a combination of primers consisting of the nucleotide sequences of No. 6 and 6 and a combination of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8.
  • the step (i) comprises a combination of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, a combination of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, and the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6. It is carried out by a PCR reaction using one or more, preferably 2 or more, more preferably all three primer sets selected from the group consisting of the primer combinations.
  • the step (i) comprises a combination of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, a combination of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, and the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6.
  • a PCR reaction using the primer set of the primer combination consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 is performed.
  • step (Ii) Step of identifying genotype of single nucleotide polymorphism The genotype of single nucleotide polymorphism is identified for the DNA fragment amplified in step (i).
  • the genotype of a single nucleotide polymorphism is identified by identifying the nucleotide sequence of a DNA fragment containing a variety identification region.
  • the analysis of the base sequence is performed, for example, in the items of “(f) determining the base sequence of the identification region and (g) determining the identification marker of the identification target variety” in the above-mentioned ⁇ Method for producing identification marker>.
  • the method described in (5) Purification of PCR product to (8) Analysis of base sequence may be performed according to or in accordance with the method described above.
  • the genotype identification of the single nucleotide polymorphism is performed by contacting the amplified DNA fragment with a probe and / or primer that constitutes an identification marker and detects a single nucleotide polymorphism that differs among hop varieties. May be performed.
  • Probes and / or primers that detect single nucleotide polymorphisms can be designed and prepared according to techniques known to those skilled in the art. Identification of a genotype of a single nucleotide polymorphism using the probe thus obtained can be performed using a technique known to those skilled in the art, such as a DNA microarray method.
  • the identification of single nucleotide polymorphism genotypes using primers is not only based on sequence analysis, but also the SNaPshot (registered trademark) method (Life Technologies) and other amplifications with different lengths depending on the single nucleotide polymorphism to be detected. Identification methods using primers designed to produce products can be used. In addition, the identification of single nucleotide polymorphism genotypes using probes and primers can use real-time PCR methods using MGB (Minor Groove Binder) probes (Life Technologies) and primers designed to sandwich them. .
  • MGB Minor Groove Binder
  • step (Iii) of comparing and analyzing genotypes of single nucleotide polymorphisms in the variety identification region single nucleotide polymorphisms constituting identification markers in the variety identification region for the hop DNA of the subject And the genotype of a single nucleotide polymorphism in the corresponding region for DNA of known hop varieties.
  • the genotype of the single nucleotide polymorphism constituting the identification marker is analyzed for coincidence or disagreement between the subject hop and the known hop variety.
  • Comparison can be done by visual inspection or mathematical calculation. Alternatively, a computer program can be used. Further, the comparison may be performed by comparing the base sequence of the DNA fragment including the variety identification region with the base sequence of the corresponding region for the DNA of the known hop variety. The comparison can be performed by a method generally employed in a single nucleotide polymorphism test (SNP typing) on a gene of a subject.
  • SNP typing single nucleotide polymorphism test
  • an identification marker table including data representing a base of the identification marker obtained by the above-described identification marker production method and data representing the base sequence position of the base is preliminarily stored in an analysis computer such as SeqScape (Life Technologies). Store on the computer where the program is running. One or a plurality of identification marker tables may be stored. Then, a list of subject base sequences including data representing bases obtained from the subject hop is stored in the computer.
  • the computer compares the data representing the base at the corresponding base sequence position between the subject base sequence list and the identification marker table. Let The comparison can be performed by aligning both base sequences using the computer program for analysis.
  • step (Iv) of identifying the hop variety of the subject the hop variety of the subject is identified based on the analysis result of the step (iii).
  • the identification marker of the present invention it is possible to identify the type of hop as the subject.
  • the above-described comparison can be easily performed by coloring a specific base determined as an identification marker. That is, first, after aligning the base sequence having a colored control base (identification marker) and the base sequence of the subject, only the colored base is extracted and a table comparing both is created. As a result, it becomes easy to identify whether or not the type of base matches all existing positions, and it is possible to easily determine whether or not the hop that is the subject is the type of the identification marker. This method is preferable because a plurality of subjects can be analyzed simultaneously.
  • nucleic acid containing identification marker > The present invention also provides a nucleic acid comprising at least a part of the identification marker produced by the method for producing the identification marker.
  • nucleic acid means deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) composed of two or more nucleotides. It will be understood by those skilled in the art that when RNA is intended for a nucleic acid described by a DNA base sequence, thymine in the DNA base sequence should be replaced with uracil. The nucleic acid may be single-stranded or double-stranded hybridized with a complementary strand.
  • the nucleic acid containing at least a part of the identification marker is SEQ ID NO: 9 (A1 region), SEQ ID NO: 10 (B1 region), SEQ ID NO: 11 (C1 region), SEQ ID NO: 12 or 13 (A1-2-2- L region), SEQ ID NO: 14 or 15 (A1-2-R region), and includes a part of a base sequence selected from the group consisting of, and a single nucleotide polymorphism or indel indicated by symbol n in the base sequence It may be a nucleic acid containing at least one of the portions.
  • the nucleic acid containing at least a part of the identification marker is SEQ ID NO: 9 (A1 region), SEQ ID NO: 10 (B1 region), SEQ ID NO: 11 (C1 region), SEQ ID NO: 12 or 13 (A1-2-L region).
  • the present invention also provides a primer capable of amplifying a nucleic acid containing at least a part of the identification marker.
  • the primer is not particularly limited as long as it is a primer designed to amplify a nucleic acid containing at least a part of the identification marker.
  • the present invention also provides a probe for detecting a single nucleotide polymorphism constituting an identification marker.
  • Probes include, for example, SEQ ID NO: 9 (A1 region), SEQ ID NO: 10 (B1 region), SEQ ID NO: 11 (C1 region), SEQ ID NO: 12 or 13 (A1-2-L region), and SEQ ID NO: 14 or 15 In the base sequence selected from the group consisting of (A1-2-R region), it is possible to detect at least one of the single nucleotide polymorphism indicated by n or the indel portion.
  • a method for detecting contamination of different varieties in a hop sample the following steps: (I) A step of amplifying a DNA fragment containing a variety identification region for DNA extracted from a hop sample of a subject, wherein the variety identification region differs between hop varieties.
  • the identification marker comprising: (Ii) analyzing the base sequence of the variety identification region for the DNA fragment amplified in the step (i) to obtain sequence data; (Iii) comparing the information on the single nucleotide polymorphism site constituting the identification marker with the information on the corresponding single nucleotide polymorphism site of the normal product in the sequence data obtained in the step (ii); and (Iv) A step of determining the presence or absence of mixing of different varieties in the hop sample, wherein the single nucleotide polymorphism site information of the sequence data obtained in the step (ii) is a single nucleotide polymorphism corresponding to a normal product If it matches the information on the part, it is judged that there is no mixing of different varieties, or the information on the single nucleotide polymorphism part of the sequence data obtained in the above step (ii) is the single nucleotide polymorphism corresponding to the normal product. If it does not match the information on the mold part,
  • step (V) when the information on the single nucleotide polymorphism site of the sequence data obtained in the above step (ii) does not match the information on the corresponding single nucleotide polymorphism site of the normal product, A step of identifying the base from information derived from a non-normal product appearing at the single nucleotide polymorphic site of the sequence data obtained in step (ii); and (vi) identified in step (v) above.
  • the mixing ratio can be analyzed by performing the following steps following (iv). That is, (V) In the above step (iv), when the information on the single nucleotide polymorphism site of the sequence data obtained in the above step (ii) does not match the information on the corresponding single nucleotide polymorphism site of the normal product, A step of identifying the base from information derived from other than the normal product appearing at the single nucleotide polymorphism site of the sequence data obtained in the step (ii), and obtaining a mixing ratio; and (vi) the step (v) A step of collating a base different from a normal product of the single nucleotide polymorphism site specified in (1) with an identification marker, and estimating or specifying a mixed cultivar and a mixing ratio thereof; including.
  • the information on the single nucleotide polymorphic site of the sequence data is, for example, the shape or numerical value of the single nucleotide polymorphic site obtained as a result of the sequence.
  • the single base polymorphic site obtained as a result of the sequence Electropherograms of polymorphic sites (color-coded waveforms indicating each base obtained during sequencing) and amplified fragments are cloned into E. coli, etc., and the resulting clones are sequenced and their sequences are The content ratio of the base at the single nucleotide polymorphic site obtained by comparison is exemplified.
  • the normal product means a hop product that is a single product and has established information on the single nucleotide polymorphism site constituting the identification marker.
  • the description of a normal product may mean a sample containing only a single variety in which information on single nucleotide polymorphism sites constituting an identification marker is established.
  • the sequences of the multiple clones are aligned to determine the base content ratio for each single nucleotide polymorphism site.
  • the content ratio should be 100% of the same base as the normal base in any part, but if different varieties are mixed, the base is the same as the normal base. Is not 100%, and another base content is observed.
  • the mixed variety can be specified and the content ratio can be obtained.
  • the method of cloning into Escherichia coli requires a lot of labor and time since many clones need to be analyzed.
  • a DNA fragment containing the cultivar identification region of the subject hop sample is used with a specific primer having an additional sequence necessary for the next step. It is possible to more accurately determine the contamination varieties and the contamination ratio by sequencing in large quantities with a next-generation sequencer, aligning them, and determining the base content ratio for each single nucleotide polymorphism site Is possible.
  • a primer is set immediately before polymorphism (SNP), and polymorphism typing is performed with the type of base incorporated by extending only one base.
  • SNP polymorphism
  • SNaPshot registered trademark
  • MGB Minor Groove Binder
  • Example 1 Preparation of Identification Marker (a) Transcriptome Analysis
  • a) Transcriptome Analysis In order to obtain inter-variety DNA polymorphism regions necessary for development of hop variety identification technology, a large amount of sequence data was obtained using a next-generation sequencer, and a wide range of them was obtained.
  • We wanted to search for SNPs the frequency with which SNPs are detected in the human genome is considered to be 1 / 100-300 bases; http://www.eubios.info/hmback.htm). Therefore, the inventors focused on the transcriptome. Transcriptome analysis requires about 1/100 of data processing compared to the case where the entire genome is targeted, and the delivery time and cost can be reduced. Moreover, although it is less than the whole genome, as many as 15,000 SNP data can be used in our calculations. Therefore, assuming that SNPs necessary for multi-variety identification would be obtained, SNP analysis between varieties was performed using this method.
  • Transcriptome analysis was commissioned to Eurofins for the samples collected as described above. Specifically, extraction of total RNA, purification of mRNA, creation of cDNA library, homogenization of expression level difference, size adjustment (500-700 bp), preparation of cDNA library for GS FLX sequencer, “Titanium Chemistry Was sequenced using Roche / 454 Genome Sequencer FLX.
  • the SNP search was conducted in the same manner as described above, using the contigs and singlets of the cultivar B as the reference sequence and the single reads of the cultivar A and cultivar C applied to it. Further, using the base sequences of the contigs and singlets of cultivar A as reference sequences, the single reads of cultivar B and cultivar C were applied thereto, and SNP search was carried out in the same manner as described above.
  • the analysis regions thus selected were designated as B1, A1, C1, and A1-2 regions, and primers were designed and synthesized to amplify the SNP-containing area.
  • the sequence of each primer is shown below.
  • CTAB Cyltrimethyl ammonium bromide
  • DNA extraction by the CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) method was performed as follows. 2% (w / v) CTAB (Calbiochem), 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA (pH 8.0), 1.4 M NaCl, 1% (w / v) PVP (Polyvinylpyrrolidone)
  • a CTAB solution was prepared. 650 ⁇ l of this CTAB solution and 2 ⁇ l of a 1 mg / ml RNase A solution were placed in a 1.5 ml microtube together with the sample ground as described above and stirred well. The microtube containing the specimen and the CTAB solution was immersed in a constant temperature water bath at 65 ° C.
  • the supernatant was discarded, the precipitate was rinsed with about 500 ⁇ l of 70% ethanol, and dried for about 5 minutes with a centrifugal evaporator, and dissolved in 20-50 ⁇ l of TE buffer to obtain a DNA sample.
  • PCR product was purified using QIAquick PCR Purification Kit (50) (Qiagen) according to the following method based on the protocol. That is, 5 times (225 ⁇ l) of PBI Buffer was added to the PCR reaction solution (remaining amount: about 45 ⁇ l) and mixed. Next, this liquid was put into QIA quickspin and centrifuged at 13,000 rpm (about 11,000 ⁇ g) for 1 minute. The filtrate was discarded and 750 ⁇ l PE Buffer was added, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 1 minute. The filtrate was discarded and centrifuged again at 14,000 rpm (about 13,000 ⁇ g) for 1 minute.
  • the filtrate was discarded, the column was transferred to a new 1.5 ml Eppendorf tube, 30 ⁇ l EB Buffer was added, allowed to stand for 1 minute, and then centrifuged at 13,000 rpm for 2 minutes to use the filtrate as a sample.
  • the PCR product purified solution was diluted with sterilized distilled water to 5 to 20 ng / ⁇ l, and each primer diluted with 2 ⁇ l of Sequence premix (Big dye) to 8 ⁇ l and 1 ⁇ M alone (primer set) In any one of the above, 3.2 ⁇ l was added, and a cycle sequence reaction solution adjusted to a final 20 ⁇ l with sterilized distilled water was obtained.
  • sequence product was purified by CENTRI-SEP Spin Column (Life Technologies). That is, the filler is swelled at room temperature for 2 hours or more and added so that the above-mentioned sequence product (about 20 ⁇ l) is placed on the center of CENTRI-SEP Spin Column that has been pretreated, and then added to a 1.5 ml microtube. Was centrifuged at 2,700 rpm (about 500 ⁇ g) for 2 minutes, and the solution collected in the microtube was recovered as purified DNA. After drying this solution under reduced pressure, 20 ⁇ l of TSR or Hi-Diformamide was added and left for about 10 minutes, and then mixed well.
  • This solution is transferred to a 0.2 ml microtube (for PCR), denatured (95 ° C., 2 minutes) with DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600, immediately inserted into ice and rapidly cooled, and left for 10 minutes. I left it above.
  • DNA sequence ABI PRISM 310 Genetic Analyzer was used, and it was carried out based on the “ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Operation Guide”. That is, the rapidly cooled sample was transferred to a sample tube, covered with a tube septa, and set in a 48-well sample tray. After that, the sequence was performed by the dye terminator method according to the operation guide. Note that there is a limit to the range that can be sequenced depending on the analysis device. Accordingly, since the A1-2 region has a fragment size of about 1500 bp, the sequence data is about 500 bp from the 5 ′ side (primer L) to the A1-2-L region and the 3 ′ side (primer R) about 800 bp. Data on two regions of the A1-2-R region was obtained.
  • the base sequence of the A1 region was determined for the 14 varieties of hops selected as identification target varieties. Table 7 below shows the sequence numbers representing the base sequences of the A1 region in each variety.
  • the base sequence of the B1 region was determined for the 14 varieties of hops selected as identification target varieties.
  • Table 8 shows the sequence numbers representing the base sequences of the B1 region in each variety.
  • the base sequence of the C1 region was determined for 14 hops selected as identification target varieties.
  • Table 9 below shows the sequence numbers representing the base sequence of the C1 region in each variety.
  • the base sequence of the A1-2 region was further analyzed.
  • the base sequences of the A1-2-L region and the A1-2-R region in the Perle-derived DNA sample are shown in SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 60, respectively, and the A1-2-L region and A1-2 in the DNA sample derived from Northern Brewer
  • the base sequences of the -R region were as shown in SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 61, respectively. These sequences were aligned to determine consensus sequences for the A1-2-L and A1-2-R regions (SEQ ID NOs: 12 and 14, respectively).
  • SNPs corresponding to the positions specified in FIG. 4 for SEQ ID NOS: 12 and 14 were evaluated. As a result, as shown in FIG. 4, SNP differences were observed at a plurality of locations.
  • identification markers for the A1-2-L region and the A1-2-R region were determined for five varieties of Sladeck, Spaltar, Perle, Tettnang, and Northern Brewer.
  • the base sequence of the A1-2-L region was determined for the above five hops.
  • Table 10 below shows the sequence numbers representing the base sequence of the A1-2-L region in each variety.
  • the identification markers capable of discriminating the five types shown in Table 10 could be prepared by combining the SNP or indel portion of the A1-2-L region.
  • the base sequence of the A1-2-R region was determined for the above five hops.
  • Table 11 below shows the sequence numbers representing the base sequence of the A1-2-R region in each variety.
  • Example 2 Comparison of DNA sample preparation methods In the DNA extraction of Example 1 (f) (2), the results were compared between when the DNA sample was extracted from hop pellets and when extracted from hop dried spikelets. .
  • Example 3 Comparison among clones About 1 g of dried Saika clones (Osvald's clone 31, 72, 114) was ground in a mortar in the presence of liquid nitrogen, and about 50 mg of the dried spikelets were used in Example 1 ( DNA was extracted by the CTAB method as in (2) of f). For the extracted DNA sample, the DNA fragments in the A1, B1, and C1 regions were amplified in the same manner as in (3) to (7) of Example 1 (f), and the amplified DNA fragments were sequenced. The base sequences of the three clones were aligned for each region and compared.
  • Example 4 Model experiment mixed with other varieties Analysis of Saaz and Premiant mixed sample (A1 region) was performed. Each pellet was pulverized according to Example 1, and then a sample mixed at a weight ratio as shown in Table 12 was prepared.
  • the waveform of C is recognized by being overlapped with the waveform of T.
  • the waveform of C is slightly recognized as compared with the case in which the premix is not mixed.
  • Example 5 Identification of American varieties It was examined whether analysis of each region (and SNP included) of A1, B1, C1, and A1-2 is applicable to identification of American varieties.
  • each primer (primer that specifies the single strand of the primer pair that you want to sequence) and pure water to make 14 ⁇ L, entrust the sequencing to Operon Biotechnology Co., Ltd.
  • PC-processed sequence data was obtained from raw data, electropherogram, and electropherogram.
  • Table 15 below shows the sequence numbers representing the base sequence of the A1 region in each variety.
  • Galena has two types of sequences, and can be given discrimination ability based on the difference (base numbers 245 to 248).
  • the consensus sequence (indicated by A, G, C, T) and the SNP location (indicated by N) of the B1 region at the time of identification including American varieties are described in the sequence listing as SEQ ID NO: 105.
  • Table 19 below shows the sequence numbers representing the base sequence of the C1 region in each variety.
  • Cascade and Super Galena have two sequences, and can be distinguished based on the difference.
  • the consensus sequence (indicated by A, G, C, T) and SNP position (indicated by N) of the C1 region at the time of identification including American varieties are described in the sequence listing as SEQ ID NO: 106.
  • SEQ ID NO: 1 Primer A1-3L SEQ ID NO: 2: Primer A1-3R SEQ ID NO: 3: Primer B1-1L SEQ ID NO: 4: Primer B1-1R SEQ ID NO: 5: Primer C1-1L SEQ ID NO: 6: Primer C1-1R SEQ ID NO: 7: Primer A1-2-1L SEQ ID NO: 8: Primer A1-2-1R

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Abstract

　本発明は、品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型で構成される識別マーカーを利用したホップの品種を識別するための方法、並びに該識別マーカーの作製方法に関する。本発明はまた、当該ホップの品種を識別するための方法に用いるプライマー又はプローブ、及び当該識別マーカーを含む領域の核酸を提供する。本発明はさらに、ホップ試料において、異品種の混入を検出する方法を提供する。

Description

ホップ品種の識別方法
　本発明は、品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型で構成される識別マーカーを利用したホップの品種を識別するための方法、並びに該識別マーカーの作製方法に関する。
　ホップ（学名：Humulus lupulus）は、麻（アサ）科に属する、雌雄異株の蔓性（ツル性）植物である。雌株は「毬花」と呼ばれる松かさに似た花のようなものをつけ、この毬花がビールの原料になる。未受精の毬花にはルプリンと呼ばれる黄色い粒があり、ビール独特の香りや爽やかな苦味の由来となっている。ホップは、ほろ苦さと爽快な香りを付ける、泡持ちを良くする、ビールのテリ（色つや）を良くする、雑菌の繁殖をおさえるといった役割を有し、ビール醸造には欠かせない原料のひとつである。
　ホップはドイツ、アメリカをはじめ、チェコ、イギリス、フランス、中国、スロベニア、南アフリカ、オーストラリア、ニュージーランド、日本などで栽培されており、その栽培品種も多岐にわたっている。ホップの品種にはアロマホップとビターホップがある。アロマホップは、華やかな香りと穏やかな苦味を与えるホップであり、ビターホップは、しまりのある苦味を与えるホップである。このようにホップは、品種ごとに香りや味が異なっているため、高品質のビールを醸造するには、目的にあったホップ品種の選別が重要となる。そしてその品質を安定に維持するためには、発注した原料ホップが正しく納入されているかを正確にチェックすることが重要である。これまでは、サプライヤーによって提供される品質保証書やルプリンに含まれるα酸などの成分含量の違い、毬花では外観上の差異に基づいて確認されてきた。しかしながら日本では一般的に、ホップの毬花を乾燥させて粉砕、圧縮整形してペレット状にしたものを購入しビール醸造に使用している。そのため毬花の外観上の特徴から品種を識別することは非常に困難である。また毬花から得られる苦味成分や精油成分などの化学成分も、環境要因の影響を受けやすいことや、品種によっては類似の値を示すものがあることなどから、識別の指標とすることには限界があった。
　一方、近年いくつかの遺伝子工学を応用した品種識別方法が開発されてきた。これらの方法は品種間での塩基配列の違い、すなわち多型を検出することで品種識別を行っている。ホップにおいては、国際公開公報（ＷＯ１９９７／００５２８１）で、ＲＡＰＤ法により品種間で異なるＤＮＡ領域を見つけ、該領域を増幅しうるプライマーを設計し、該プライマーを用いたＰＣＲにより多型領域を増幅し、増幅断片の有無又はそのサイズの差を解析することによりホップ品種を識別する方法が開示され、また特開平１１－１０３８９５公報では、高濃度の塩化リチウムを使用することによりＰＣＲに適したゲノムＤＮＡをホップから効率よく抽出・精製し、このゲノムＤＮＡに対して、ランダムプライマー、ＳＴＳ化されたプライマー等のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ホップ品種を識別しうるＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡの有無によりホップ品種を判別する方法が、また特開２００６－３４１４２公報では、品種間で多型を含むマイクロサテライト領域を、該領域を増幅しうるように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、マイクロサテライトＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡ断片の長さの差異を解析することにより品種を識別する方法が開示されている。
　ホップゲノム上の多型を利用することでホップ品種を識別する上記方法は、ホップの栽培環境や収穫時期あるいは保存方法に影響されることなく、ホップの品種を正確に識別できる有効な手段であるが、いずれの方法もＰＣＲによる増幅の有無又はサイズの差から識別を行うため、酵素反応や電気泳動、ゲルの染色などの条件のばらつきの影響を受けやすく、再現性に問題がある。すなわちＰＣＲや染色の不具合によってバンドが現われないのか、あるいは元来増幅しないものなのかを区別することが困難であるため、結果を見誤る危険性がある。また上記方法は、キャピラリー電気泳動およびレーザーによるＤＮＡ断片検出やゲル電気泳動試料の染色による検出などであるため、被検体であるホップの品種を特定することや、異品種の混入の有無を推測することまでは可能であっても、混入品種を推定又は特定することや、混入品種の混入割合を分析することは困難である。また被検体の劣化や損傷などによりＤＮＡが断片化されている場合には、解析の精度が低下し、結果を見誤る危険性がある。
　極めて有用で利用しやすい多型マーカーとして、一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」ともいう。）が注目されている。ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）は、１塩基の違いに基づく、塩基配列の多型である。ＳＮＰは反応条件のばらつきに影響されないため、擬似結果がなく判定が容易であり、またＳＮＰデータは（０，１）のデジタル信号に変換して情報処理することができるため、サンプル処理とデータ解析の自動化が容易であり、膨大なＳＮＰデータを用いてさまざまな解析が可能である。またさまざまな長さの非特異的なテイルを持つプライマーを設計するなどの方法で、一度に多くのＳＮＰ解析が可能である。
　しかしながらホップは２倍体で２０本（２本鎖が１０対）の染色体を持ち、ゲノムサイズが約２７～３０億塩基対（２．７～３ＧＢ）と膨大であり、構造遺伝子との関連性も明確にされていない。従ってゲノム解析の結果からホップ品種間のＳＮＰを、多品種識別が可能な程度十分な数で、見出すことは実施されておらず、いまだＳＮＰを多型マーカーとして利用したホップ品種の識別方法は知られていない。
国際公開公報第ＷＯ１９９７／００５２８１号パンフレット 特開平１１－１０３８９５号公報 特開２００６－３４１４２号公報
　本発明は、品種間における一塩基多型からなる識別マーカーを利用したホップの品種を識別するための方法、並びに該識別マーカーの作製方法を提供する。
　すなわち、発注した原料ホップが注文通りの品種であるかどうか、また異品種が混入していないかどうかを確認する際、酵素反応や電気泳動、ゲルの染色などの条件のばらつきに影響されることなく正確に品種を特定し、異品種の混入の有無を検出できることに加え、異品種が混入している場合には、混入品種を推定又は特定し、その混入割合を分析できるようなホップ品種の識別方法の開発が強く望まれていた。
　本発明者らは、上記課題を解決するためにＤＮＡ解析に基づくホップ品種の識別方法について鋭意研究を行った。ＤＮＡ解析については、これまでにも、ＳＳＲ法、ＲＡＰＤ法、ＲＦＬＰ法、ＡＦＬＰ法など、ＰＣＲ増幅産物やその制限酵素断片の大きさの違いや有無に基づく方法が報告されている。しかし、これらの方法の多くは操作が煩雑で、また酵素反応や電気泳動、ゲルの染色などの条件のばらつきの影響を受けやすく、再現性が懸念され、更に他品種が混入している場合にはその検出が困難になる場合が多い。われわれは、近年発達している超高速ＤＮＡ塩基配列解析技術を用いて大量のデータを取得し、より広範囲にかつ効率的にＳＮＰを探索し、これらを識別マーカーとして、正確かつ簡便にホップの品種識別を行う方法を開発した。
　すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
　（１）ホップ品種の識別方法であって、以下の工程：
（ｉ）被検体のホップ由来のＤＮＡについて、品種識別領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程であって、当該品種識別領域はホップ品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成される識別マーカーを含む、前記工程；
（ｉｉ）上記工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について、一塩基多型の遺伝子型を同定する工程；
（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）で同定された被検体のホップのＤＮＡについての品種識別領域中の一塩基多型の遺伝子型と、既知のホップ品種のＤＮＡについての対応する領域中の一塩基多型の遺伝子型を比較し、当該領域の中の一塩基多型の遺伝子型について被検体のホップと既知のホップ品種の間での一致又は不一致を解析する工程；
（ｉｖ）上記工程（ｉｉｉ）の解析結果に基づいて被検体のホップの品種を特定する工程；
を含む、前記方法。
　（２）工程（ｉｉ）が、工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について品種識別領域の塩基配列を同定することにより行われ、そして
　工程（ｉｉｉ）が、工程（ｉｉ）で同定された被検体のホップのＤＮＡについての品種識別領域の塩基配列と、既知のホップ品種のＤＮＡについての対応する領域の塩基配列を比較し、当該領域の中の識別マーカーについて被検体のホップと既知のホップ品種の間での一致又は不一致を解析することにより行われる、（１）に記載の方法。
　（３）工程（ｉｉ）が、工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について、ホップ品種間で相違する一塩基多型を検出するプローブ及び／又はプライマーと接触させることにより、一塩基多型の遺伝子型を同定する工程である、（１）に記載の方法。
　（４）品種識別領域が、以下の工程：
（ａ）２以上の異なる品種のホップを用いて、トランスクリプトーム解析を行う工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の結果得られたＤＮＡ断片の塩基配列を元に、品種ごとにアセンブルする工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）の結果得られたコンティグ及び／又はシングレットを品種間で比較して、品種間で相違する一塩基多型（ＳＮＰ）の探索を行う工程；
（ｄ）上記工程（ｃ）のＳＮＰ探索の結果、ＳＮＰが含まれる領域を選択し、該領域を増幅するためのプライマーを設計する工程；
（ｅ）上記工程（ｄ）で設計したプライマーを用いて、ホップから抽出したＤＮＡを鋳型として上記工程（ｄ）で選択した領域が増幅しうることを確認し、その塩基配列を決定することにより、識別領域とそれを増幅しうるプライマーを決定する工程；
（ｆ）上記工程（ｅ）で決定したプライマーを用いて、識別対象品種のホップから抽出したＤＮＡを鋳型として識別領域を増幅し、識別領域の塩基配列を決定する工程；及び
（ｇ）上記工程（ｆ）で決定した識別領域の塩基配列を品種間で比較して、識別対象品種を識別するために必要なＳＮＰの組み合わせで構成される識別マーカーを決定する工程；
を含む方法により作製された識別マーカーを含む領域である、（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の方法。
　（５）品種識別領域が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される１以上の塩基配列の一部又は全部であって、図１、図２、図３、図４及び図６で特定されている一塩基多型又は挿入欠失部分の少なくとも一つを含む領域である、（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の方法。
　（６）品種識別領域が、配列番号９で表される塩基配列を含む領域、配列番号１０で表される塩基配列を含む領域、配列番号１１で表される塩基配列を含む領域、配列番号１２で表される塩基配列を含む領域、配列番号１３で表される塩基配列を含む領域、配列番号１４で表される塩基配列を含む領域、及び配列番号１５で表される塩基配列を含む領域からなる群より選択される１以上の領域である、（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の方法。
　（７）品種識別領域が、以下：
配列番号９で表される塩基配列を含む領域、配列番号１０で表される塩基配列を含む領域、及び配列番号１１で表される塩基配列を含む領域；の３種の領域に加えて、以下：
配列番号１２及び／又は配列番号１４で表される塩基配列の一部又は全部であって、図４で特定されている一塩基多型又は挿入欠失部分の少なくとも一つを含む領域；
である、（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の方法。
　（８）工程（ｉ）が、配列番号１及び配列番号２の組み合わせ、配列番号３及び配列番号４の組み合わせ、配列番号５及び配列番号６の組み合わせ、及び配列番号７及び配列番号８の組み合わせからなる群より選択されるプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により行われる、（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の方法。
　（９）工程（ｉ）が、以下：
配列番号１及び配列番号２の組み合わせ、配列番号３及び配列番号４の組み合わせ、並びに、配列番号５及び配列番号６の組み合わせ；の３種のプライマーセットに加えて、配列番号７及び配列番号８の組み合わせ、のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により行われる、（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の方法。
　（１０）ホップ品種間で相違する一塩基多型の組み合わせで構成される識別マーカーの作製方法であって、以下の工程：
（ａ）２以上の異なる品種のホップを用いて、トランスクリプトーム解析を行う工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の結果得られたＤＮＡ断片の塩基配列を元に、品種ごとにアセンブルする工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）の結果得られたコンティグ及び／又はシングレットを品種間で比較して、品種間で相違する一塩基多型（ＳＮＰ）の探索を行う工程；
（ｄ）上記工程（ｃ）のＳＮＰ探索の結果、ＳＮＰが含まれる領域を選択し、該領域を増幅するためのプライマーを設計する工程；
（ｅ）上記工程（ｄ）で設計したプライマーを用いて、ホップから抽出したＤＮＡを鋳型として上記工程（ｄ）で選択した領域が増幅しうることを確認し、その塩基配列を決定することにより、識別領域とそれを増幅しうるプライマーを決定する工程；
（ｆ）上記工程（ｅ）で決定したプライマーを用いて、識別対象品種のホップから抽出したＤＮＡを鋳型として識別領域を増幅し、識別領域の塩基配列を決定する工程；及び
（ｇ）上記工程（ｆ）で決定した識別領域の塩基配列を品種間で比較して、識別対象品種を識別するために必要なＳＮＰの組み合わせで構成される識別マーカーを決定する工程；
を含む、前記方法。
　（１１）（１０）に記載の方法によって作製された識別マーカーの少なくとも一部を含む核酸。
　（１２）核酸であって、当該核酸はホップの品種識別領域を含み、そして、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される１以上の塩基配列の一部又は全部であって、図１、図２、図３、図４、及び図６で特定されている一塩基多型又は挿入欠失部分の少なくとも一つを含む、前記核酸。
　（１３）（１１）又は（１２）に記載の核酸を増幅し得るように設計されたプライマー。
　（１４）プライマーであって、配列番号１～８のいずれかに記載された塩基配列からなり、ここで当該プライマーはホップの品種識別のために用いられる、前記プライマー。
　（１５）（１０）に記載の方法により同定された品種識別領域中の、ホップ品種間で相違する一塩基多型を検出するためのプローブ。
　（１６）プローブであって、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される１以上の塩基配列において、図１、図２、図３、図４又は図６で特定される位置における少なくとも一つの一塩基多型又は挿入欠失部位を検出することができ、そしてそれによりホップ品種間で相違する一塩基多型を検出する、前記プローブ。
　（１７）ホップ試料における異品種の混入を検出する方法であって、以下の工程：
（ｉ）被検体のホップ試料から抽出したＤＮＡについて、品種識別領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程であって、当該品種識別領域はホップ品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成される識別マーカーを含む、前記工程；
（ｉｉ）上記工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について品種識別領域の塩基配列を解析し、シークエンスデータを得る工程；
（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータについて、識別マーカーを構成する一塩基多型部位の情報を、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と比較する工程；及び 
（ｉｖ）ホップ試料における異品種の混入の有無を決定する工程、ここで、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致する場合は、異品種の混入はないと判断し、あるいは、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、異品種の混入があると判断する；
を含む、前記方法。
　（１８）工程（ｉｖ）に引き続いて以下の工程：
（ｖ）上記工程（ｉｖ）で、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位に出現している正常品以外に由来する情報から、その塩基を特定する工程；及び
（ｖｉ）上記工程（ｖ）で特定された一塩基多型部位の正常品とは異なる塩基を、識別マーカーと照合し、混入品種を推定又は特定する工程；
をさらに含む、（１７）に記載の方法。
　（１９）工程（ｉｖ）に引き続いて以下の工程：
（ｖ）上記工程（ｉｖ）で、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位に出現している正常品以外に由来する情報から、その塩基を特定し、混入割合を求める工程；及び
（ｖｉ）上記工程（ｖ）で特定された一塩基多型部位の正常品とは異なる塩基を、識別マーカーと照合し、混入品種とその混入割合を推定又は特定する工程；
をさらに含む、（１７）に記載の方法。
（２０）工程（ｉｉｉ）において、１９～２５塩基の挿入配列の有無の解析を含む、（１）ないし（９）のいずれかに記載の方法。
　品種間における一塩基多型からなる識別マーカーを利用してホップの品種が識別できるようになったことで、発注した原料ホップが注文通りの品種であるかどうか、異品種が混入していないかどうかを確認する際、被検体であるホップの品種を正確に特定すること、及び異品種の混入の有無を検出することが可能となる。さらに異品種が混入しているような場合、混入の有無だけでなく、混入品種を推定又は特定し、その混入割合を分析できるようになる。
　また、本発明の方法により作製された識別マーカーを構成する塩基の情報を用いて、目的とする品種を識別するためのプライマーやプローブを作製することができ、これを利用してリアルタイムＰＣＲ法や次世代シークエンサーを用いた解析により、異品種の混入割合を定量的に分析できるようになることが期待できる。
　これにより、目的とする高品質のビールを安定して供給することが可能となる。また、被検体が劣化や損傷している場合であっても、品種を識別することが可能となる。
図１は、１４品種のホップのＡ１領域におけるＳＮＰ解析結果を示す図及び塩基のコード表である。ＳＮＰの位置は、Ａ１領域のコンセンサス配列（配列番号９）の５’側から数えたＳＮＰの位置を示す。解析したＳＮＰは２４箇所である。解析に供した１４種のホップは、９タイプのディプロタイプに分類された。 図２は、１４品種のホップのＢ１領域におけるＳＮＰ解析結果を示す図である。ＳＮＰの位置は、Ｂ１領域のコンセンサス配列（配列番号１０）の５’側から数えたＳＮＰの位置を示す。解析したＳＮＰは１０箇所である。解析に供した１４種のホップは、７タイプのディプロタイプに分類された。Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ以外の塩基の表記については、図１のコード表を参照。 図３は、１４品種のホップのＣ１領域におけるＳＮＰ解析結果を示す図である。ＳＮＰの位置は、Ｃ１領域のコンセンサス配列（配列番号１１）の５’側から数えたＳＮＰの位置を示す。解析したＳＮＰは２９箇所であり、そのうち配列番号１１の１２９～１３４番目の塩基は挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）部分である。解析に供した１４種のホップは、３タイプのディプロタイプに分類された。Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ以外の塩基の表記については、図１のコード表を参照。 図４は、Perle及びNorthern BrewerのＡ１－２－Ｌ領域及びＡ１－２－Ｒ領域におけるＳＮＰ解析結果を示す図である。ＳＮＰの位置は、Ａ１－２－Ｌ領域の２品種コンセンサス配列（配列番号１２）及びＡ１－２－Ｒ領域の２品種コンセンサス配列（配列番号１４）のそれぞれについて、の５’側から数えたＳＮＰの位置を示す。Ａ１－２－Ｌ領域について解析したＳＮＰは２１箇所であり、そのうち配列番号１２の１８６～１９４及び３９９番目の塩基はｉｎｄｅｌ部分である。Ａ１－２－Ｒ領域について解析したＳＮＰは６７箇所であり、そのうち配列番号１４の５７～５９及び６５番目の塩基はｉｎｄｅｌ部分である。Perle及びNorthern Brewerは異なるディプロタイプを示した。 図５は、品種識別に供試したホップの品種と識別マーカーのディプロタイプをまとめた表である。 図６は、Sladeck、Spalter、Perle、Tettnang、及びNorthern BrewerのＡ１－２－Ｌ領域及びＡ１－２－Ｒ領域におけるＳＮＰ解析結果を示す図である。ＳＮＰの位置は、Ａ１－２－Ｌ領域の５品種コンセンサス配列（配列番号１３）及びＡ１－２－Ｒ領域の５品種コンセンサス配列（配列番号１５）のそれぞれについて、の５’側から数えたＳＮＰの位置を示す。Ａ１－２－Ｌ領域について解析したＳＮＰは２３箇所であり、そのうち配列番号１３の１２、１８３～１９１及び３９６番目の塩基はｉｎｄｅｌ部分である。Ａ１－２－Ｒ領域について解析したＳＮＰは２８箇所であり、そのうち配列番号１５の４３７番目の塩基はｉｎｄｅｌ部分である。解析に供した５つの品種のホップは、Ａ１－２－Ｌ領域でそれぞれ異なるディプロタイプを示し、Ａ１－２－Ｒ領域で４タイプのディプロタイプに分類された。 図７は、Sladeck、Spalter、Perle、Tettnang、及びNorthern Brewerについて、Ａ１－２－Ｌ領域（配列番号１３）における識別マーカーのディプロタイプをまとめた表である。 図８は、Saaz及びPremiantの混合試料について、Ａ１領域の塩基配列を解析した結果を示すエレクトロフェログラムである。Ａ１領域の塩基番号は、配列番号９における塩基番号に従う。
　以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明は、品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成される識別マーカーを利用したホップの品種を識別するための方法、該識別マーカーの作製方法、当該識別マーカーを利用したホップ試料中の異品種の混入を検出する方法、当該識別マーカー、当該識別マーカーを有する領域を増幅し得るように設計された品種識別プライマー、及び当該識別マーカーを検出するための品種識別プローブに関する。
　＜本発明の概要＞
　本出願は、品種間で相違する少なくとも一つのＳＮＰで構成される識別マーカーを用いてホップの品種を識別することを特徴とする発明に関する。具体的には、被検体のホップのＤＮＡを抽出して、ＳＮＰからなる識別マーカーを有する領域の塩基配列に対応する塩基配列中の、識別マーカーに対応する部位の塩基が、識別マーカーの塩基と一致するか否かを解析して、一致する場合は、被検体のホップの品種を識別マーカーの品種と特定するものである。
　＜定義＞
　本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
　本明細書において「識別マーカー」とは、ホップの品種を識別するための指標をいい、品種間で相違する１以上の一塩基多型によって構成される。本発明の識別マーカーは識別対象品種間で重複がないように品種と識別マーカーを１対１で対応するように決定されるが、識別対象とする品種の数や種類に応じて、識別マーカーを構成する一塩基多型を変更しても構わない。例えば、識別したい品種が２品種だけの場合には、１個の一塩基多型から構成される識別マーカーを用いれば足り、識別したい品種が多数の場合には、複数の一塩基多型の組み合わせ（場合によっては複数の識別領域の複数の一塩基多型の組み合わせ）により重複がないように識別マーカーを決定する。識別マーカーは、基本的には重複がないように決定するが、識別の目的によっては、識別マーカーが重複する複数の品種（すなわち同じ識別マーカーを有する複数の品種）を１つのグループとみなし、１つの識別マーカーと対応させて使用することもできる。
　本明細書において「識別領域」とは、ホップ由来のＤＮＡにおいて識別マーカーを含む領域を意味する。識別領域は、１つの領域に限定されるものではなく、複数の領域であってもよい。また、識別領域のうち、品種の識別にあたって被検体のＤＮＡ断片の増幅を行う核酸の領域を特に、「品種識別領域」と記載することがある。品種識別領域は、識別領域と同じ領域であってもよく、また品種識別の目的に応じて別途設定してもよい。また品種識別領域は、１つの領域に限定されるものではなく、複数の領域であってもよい。
　＜識別マーカーの作製方法＞
　本出願は、ホップの品種を識別するための識別マーカーを作製する方法を提供する。
　一態様において、本発明の識別マーカーは、２以上の異なる品種のホップを用いて、トランスクリプトーム解析を行い、一塩基多型（ＳＮＰ）が比較的多く存在する領域を選定し、プライマーを設計し、識別領域とそれを増幅しうるプライマーを決定する。次に識別対象の品種からＤＮＡを抽出し、前記プライマーを用いて識別領域を増幅し塩基配列を決定し品種間で比較することによって、識別対象品種の識別に必要な、少なくとも１つのＳＮＰで構成される識別マーカーを決定することにより作製する。
　具体的には、ホップの品種を識別するための識別マーカーを作製する方法は、以下の工程：
（ａ）２以上の異なる品種のホップを用いて、トランスクリプトーム解析を行う工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の結果得られたＤＮＡ断片の塩基配列を基に、品種ごとにアセンブルする工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）の結果得られたコンティグ及び／又はシングレットを品種間で比較して、品種間で相違する一塩基多型（ＳＮＰ）の探索を行う工程；
（ｄ）上記工程（ｃ）のＳＮＰ探索の結果、ＳＮＰが含まれる領域を選択し、該領域を増幅するためのプライマーを設計する工程；
（ｅ）上記工程（ｄ）で設計したプライマーを用いて、ホップから抽出したＤＮＡを鋳型として上記工程（ｄ）で選択した領域が増幅しうることを確認し、その塩基配列を決定することにより、識別領域とそれを増幅しうるプライマーを決定する工程； 
（ｆ）上記工程（ｅ）で決定したプライマーを用いて、識別対象品種のホップから抽出したＤＮＡを鋳型として識別領域を増幅し、識別領域の塩基配列を決定する工程；及び
（ｇ）上記工程（ｆ）で決定した識別領域の塩基配列を品種間で比較して、識別対象品種を識別するために必要なＳＮＰの組み合わせで構成される識別マーカーを決定する工程；を含んでもよい。ただし、本発明はこれらの方法に限定されるものではなく、一般的に知られている他の方法を適宜改変して用いてもよい。
　上記の工程（ａ）～（ｇ）について、以下の通り説明する。
　（ａ）ホップを用いてトランスクリプトーム解析する工程
　識別マーカーに含めるべきＳＮＰの候補を探索するために、まず異なる品種のホップを２以上使用して、それぞれについてトランスクリプトーム解析を行う。
　トランスクリプトーム（transcriptome）とは、ある特定の状態の組織や細胞中に存在する全ｍＲＮＡ（ないしは一次転写産物、transcripts）の総体である。
　以下に本発明におけるトランスクリプトーム解析の手順を一例として説明するが、特にこれに限定されるものではない。まず、ホップの複数品種の組織からそれぞれ全ＲＮＡを粗抽出し、全ＲＮＡからの全ｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を精製し、このｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡの合成を行う。得られたｃＤＮＡライブラリーは発現量の多いものと少ないものが混在しているため、発現量の違いを補正（均一化）し、さらにサイズを基準にした精製を行う。次いで、超高速ＤＮＡ塩基配列解析装置を用いてｃＤＮＡのシークエンス解析を行う。
　上記全ＲＮＡが抽出されるホップの組織としては、芽、葉、茎、毬花を構成する各種組織が好適に使用されるが、特にこれに限定されない。また、ホップ株から上記組織を採取する場合、ホップ株の栽培方法やその生育ステージなども特に限定されない。さらにホップの組織としては、生であっても乾燥したものであっても、また例えばペレット状に加工したものであっても構わない。ただしＲＮＡは分解されやすいため、ホップ株から採取した新鮮な組織を速やかに使用することが好ましく、またＲＮＡを多く含有する組織として若葉を使用することが好ましい。また解析用の試料を採取する際には、ＲＮＡの分解を極力防ぐような対策をとることや、コンタミの防止に努めることが好ましい。
　またトランスクリプトーム解析に用いるホップの品種は、異なる品種を２品種以上用いればよく、用いる品種や数は目的に応じて選択することができる。なお、より大量のＳＮＰを検出するためには、異なる品種を３品種以上用いることが好ましい。また識別対象品種の中から選択して用いることが好ましい。
　ホップの組織からの全ＲＮＡの抽出～ｃＤＮＡのシークエンス解析までのトランスクリプトーム解析の各ステップは、一般的に採用される方法を採用して行うことができる。
　（ｂ）品種ごとにアセンブルする工程
　上記のようにして品種ごとにトランスクリプトーム解析で明らかとなったＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ）の塩基配列に基づいて、品種ごとに配列アセンブリングを行う。配列アセンブリングとは、短いＤＮＡの断片から元の長い塩基配列を再構築することと言われる。例えば工程（ａ）の結果得られたＤＮＡ断片の塩基配列を基に相互にオーバーラップする塩基配列を有するか否かでクラスタリングし、クラスタリングされた一連のＤＮＡ断片についてオーバーラップ部分を見つけて繋ぎ合わせて（アセンブルし）、ひとつの配列を得ることができる。このようにしてアセンブルされた配列を「コンティグ（contig）」と総称し、またコンティグ形成に加わらなかったシングルリード（single read）を「シングレット（singlet）」と総称する。配列アセンブリングによるコンティグの作製は、一般的に採用される方法により行うことができる。
　（ｃ）品種間で対応する塩基の相違を検出する工程
　上記のようにして品種ごとにトランスクリプトーム解析で明らかとなったＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて、互いにオーバーラップする配列部分をもとにアセンブルしてコンティグを作製する。これによって得られたコンティグ配列及び／又はシングレット配列を用いて、品種間での対応する塩基の相違（ここではＳＮＰ）を検出する。
　２品種以上の品種間で対応する塩基の相違を検出するには、まずその中の１品種を参照配列（リファレンス）として選択する。次に、選択した品種のコンティグ及び／又はシングレット（好ましくはコンティグ、より好ましくはコンティグ及びシングレット）をリファレンス配列として指定し、これを基準に他の品種のシングルリードを、共通部分を有するか否かでそれぞれマッピングする。さらにマッピングされたシングルリードが構成要素となっているコンティグを解析ソフト上で展開したアセンブル情報から割り出す。このようにして得られたリファレンスとその他の品種のコンティグ及び／又はシングレットについてアライメントを行い、ＳＮＰを検出する。なお１品種のみのリファレンスではＳＮＰを見逃す可能性があるため、他の品種をそれぞれリファレンスとして上記と同様にマッピングしてアライメントしてＳＮＰを検出し、これらの結果を総合してＳＮＰデータとすることが好ましい。異なる品種それぞれをリファレンスにしてＳＮＰを検出することにより、より多くのＳＮＰを検出することが可能となり、識別マーカーとしてより適格なＳＮＰを選択することが可能となる。なお本発明において３品種以上の品種間で対応する塩基の相違を検出する場合は、品種間で対応する塩基の中で、少なくともいずれか２品種間で相違していればＳＮＰとみなす。品種間で対応する塩基の相違を検出するには、一般的に採用されている方法で行うことができる。上記方法は一例であって、これに限定されるものではない。他の方法として１品種のコンティグ配列を使ってブラスト検索することにより、相違を検出することも可能である。
　（ｄ）ＳＮＰを含有する領域を選択し、プライマーを設計する工程
　このようにして、コンティグ配列及び／又はシングレット配列を用いてＳＮＰを検出した結果から、識別に利用可能なＳＮＰが存在する領域を選択する。多数の品種の識別を目的とする場合には、ＳＮＰが多数存在する領域を選択することが望ましい。より具体的には、解析のしやすさからホモ接合体（２倍体のそれぞれの２本鎖間で塩基配列が一致している）におけるＳＮＰが存在する領域を優先し、またコンティグあたりのＳＮＰ数が多い領域を選択することが例示できるが、特に限定されない。
　次にこの領域を増幅しうるようなプライマーを設計する。プライマーの設計は、一般的に採用される方法により行うことができる。
　（ｅ）識別領域とこれを増幅しうるプライマーを決定する工程
　上記のようにして設計したプライマーは、ｃＤＮＡライブラリーから作製されたコンティグ配列又はシングレット配列を基に設計されたものであるため、プロモーター領域やイントロンを含むゲノムＤＮＡにおいてうまく増幅するかどうかわからない。このため、ホップから抽出したゲノムＤＮＡを用いて増幅を確認する必要がある。また増幅した場合でも挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）やマイクロサテライトの有無や、目的とするＳＮＰが存在することを確認するため、サンガー法等による塩基配列の確認が必要である。従って工程（ｄ）で設計したプライマーを用いて、ホップ品種（好ましくは工程（ａ）で使用したホップ品種）のペレット、乾燥毬花などから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＳＮＰを含有する領域を増幅しシークエンスを行う。これにより、適当なサイズで増幅できること、及び前記トランスクリプトーム解析に基づく塩基配列と比較し、品種識別に適用可能であることを確認し、識別に利用できる領域（識別領域）とそれを増幅しうるプライマーを決定する。イントロンの存在等によって増幅できない場合や、増幅サイズや塩基配列に不都合、不具合がある場合には選択領域の再検討やプライマーの再設計を行う。
　なお、識別マーカーを作製するための識別領域は、１つの領域に限定されるものではなく、複数の領域を選択することもできる。複数の領域を選択することによってより多くの品種を識別することが可能となる。
　また識別領域には挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）部分が含まれていてもよい。広い意味で一塩基多型（ＳＮＰ）には、挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）も含まれ、本発明では、識別マーカーを構成するＳＮＰとして挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）部分を利用することもできる。
　（ｆ）識別領域の塩基配列を決定する工程、及び（ｇ）識別対象品種の識別マーカーを決定する工程
　工程（ｅ）で決定した、識別領域を増幅しうるプライマーを用いて、識別対象品種から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてそれぞれ識別領域を増幅する。
　本明細書において識別対象品種とは、識別の対象として選択したホップの品種をいい、２以上の異なる品種が含まれる。ホップは、学名Humulus lupulusとして分類される植物であれば特に限定されない。例えば、ドイツ、アメリカ、チェコ、イギリス、フランス、中国、スロベニア、南アフリカ、オーストラリア、ニュージーランド、日本などを原産国とするホップが挙げられる。
　ヨーロッパ原産のホップの例として、Saaz、Sladeck、Premiant、Tradition、Spalter、Spalter Select、Perle、Tettnang、Brewer’s Gold、Northern Brewer、Magnum、Herkules、German Nugget、Taurus、Admiral、Aurora、Hersbrucker、Hallertau Merkur、Hallertau Mittelfrueh、Target、等が挙げられるが、これらに限定されない。
　アメリカ原産のホップの例として、Amarillo、Cascade、Centennial、Chinook、Cluster、Columbus、Crystal、Fuggle 、Galena、Golding、Horizon、Liberty、Mount Hood、Nugget、Santiam、Sterling、Summit、Super Galena、Tettnanger、Tomahawk、Ultra、Willamette、Zeus、等が挙げられるが、これらに限定されない。
　識別の目的に応じて対象品種の種類や数を自由に設定することができる。例えば、栽培地が近隣の品種を選択するなどその時々の目的に応じて対象品種を選択することができる。
　一態様として、識別対象品種は、実施例１の表４に示すドイツ及びチェコを原産国とする１４種のホップである。
　このようにして目的に応じて選択した識別対象品種について、増幅ＤＮＡ断片のシークエンスを行い、塩基配列を決定する。
　工程（ｆ）で決定した各識別対象品種の識別領域の塩基配列についてアライメントを行い、ＳＮＰ部分を抽出する。識別対象品種間で重複しないように品種と識別マーカーが１対１で対応するように、抽出されたＳＮＰを組み合わせて識別マーカーを決定する。
　ここで、上記工程（ｆ）及び（ｇ）は、以下（１）～（１１）に示す手順に従って行ってもよい。
　（１）ホップの入手
　本発明で用いる「ＤＮＡ」は、ホップの組織からＤＮＡを抽出することにより得ることができる。ホップの組織としては、芽、葉、茎、毬花を構成する各種組織が好適に使用されるが、特にこれに限定されない。また、ホップ株から上記組織を採取する場合、ホップ株の栽培方法やその生育ステージなども特に限定されない。さらにホップの組織としては、生であっても乾燥したものであっても、また例えばペレット状に加工したものであってもよい。
　（２）ＤＮＡの抽出
　ＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ（Cetyltrimethyl ammonium bromide）法や市販キットのQiagen DNeasy Tissue Kit（キアゲン社）やISOPLANT II（ニッポンジーン社）等の当業者に公知の方法を用いて抽出することができる。操作性と経済性の点からＣＴＡＢ法が好ましい。
　（３）ＤＮＡ断片の増幅
　上記のように抽出したＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する。本発明で用いるＰＣＲ法は特に限定されず、公知のＰＣＲ法に加え、種々の改良方法を含む。以下はその一例である。
すなわち、プライマーのセット、鋳型ＤＮＡの他にＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２ 、各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の試薬類を混合してＰＣＲ反応液とする。ＰＣＲの１サイクルは、熱変性、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長（合成）反応の３つのステップからなる。各ステップはそれぞれ異なる、場合により同一の反応温度と反応時間を必要とし、これらは増幅すべきＤＮＡ領域の塩基配列、その長さ等により適宜決定される。このような操作は市販のサーマルサイクラーを用いて行うことができる。
　本発明に使用するプライマーとしては、前記工程（ｅ）で決定した識別領域を増幅しうるプライマー対を用いる。例えば本発明者が決定したプライマーセット（Ａ１－３Ｌ／Ａ１－３Ｒ（配列番号１及び２））、プライマーセット（Ｂ１－１Ｌ／Ｂ１－１Ｒ（配列番号３及び４））、プライマーセット（Ｃ１－１Ｌ／Ｃ１－１Ｒ（配列番号５及び６））、及び／又はプライマーセット（Ａ１－２－１Ｌ／Ａ１－２－１Ｒ（配列番号７及び８））を用いることができる。
　（４）ＰＣＲによる増幅の確認
　ＰＣＲの結果（ＰＣＲ産物）の評価方法として、特定のＤＮＡ断片を同定しうる任意の方法、例えば、電気泳動、ゲルろ過、ハイブリダイゼーションを用いて目的の大きさのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認する。例えば、プライマーセット（Ａ１－３Ｌ／Ａ１－３Ｒ（配列番号１及び２））を使用した場合は、大きさが６５１塩基長；プライマーセット（Ｂ１－１Ｌ／Ｂ１－１Ｒ（配列番号３及び４））を使用した場合は、大きさが７２９塩基長；プライマーセット（Ｃ１－１Ｌ／Ｃ１－１Ｒ（配列番号５及び６））を使用した場合は、大きさが６４６塩基長；プライマーセット（Ａ１－２－１Ｌ／Ａ１－２－１Ｒ（配列番号７及び８））を使用した場合は、大きさが約１５００塩基長；がそれぞれ増幅されていることを確認する。
　（５）ＰＣＲ産物の精製
　増幅されたＰＣＲ産物は、サイクルシークエンス反応の鋳型として用いるために、余剰のプライマー等の反応に用いた成分と分離する。この精製は、例えば、市販のQIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社）を使用し、その製品に添付のプロトコールに従って行うことができる。
　（６）サイクルシークエンス反応及びシークエンス産物の精製
　上記のように精製したＰＣＲ産物のシークエンスを行うため、それを鋳型にして、サイクルシークエンス反応を実施する。この方法は、ＰＣＲ法に類似し、サーマルサイクラーを用いて、熱変性、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長反応の３つのステップを繰り返し実施するが、どちらか１種類のプライマーを用い、塩基ごとに異なる４種類の蛍光色素で標識したターミネーター存在下で長さの異なる種々の１本鎖ＤＮＡを合成する方法である。サイクルシークエンスの方法は、例えば、市販のBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Life Technologies）を用いてよい。具体的には、当該キットの日本語版プロトコール（ｐ．２２「１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡのサイクルシークエンス」、ｐ．２５「GeneAmpPCR System9700, 9600, 2700, 2400でのサイクルシークエンス」及びｐ．３８－４０「スピンカラム（やスピンプレート）での精製法」）に基いて実施することができる。なお、用いるプライマーの塩基配列は、目的のＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅に用いるものと同じでよい。すなわち、ＰＣＲ産物の精製液を必要があれば滅菌蒸留水で希釈したものに、所定の物質を加えて、サイクルシークエンス反応液を作製する。これをＰＣＲ用マイクロチューブに入れ、ＰＣＲ装置にセットし、変性（例えば、９６℃、１分）を行った後、変性（例えば、９６℃、１０秒）、アニーリング（例えば、５０℃、５秒）、鎖伸長（例えば、６０℃、４分）の反応を例えば２５回繰り返す。なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を下げて保持してよい。
　その後、上記で得られた反応液から、シークエンシング産物、すなわち１本鎖ＤＮＡの混合液を精製し、以降のシークエンサーに供する試料を調製する。この方法の一例として、CENTRISEP Spin Column（Life Technologies）を用いる方法があげられ、添付のプロトコールに従って操作し、目的の試料を得る。
　（７）ＤＮＡ断片のシークエンス
　上記Dye Terminator法で得られたシークエンス産物につき、シークエンスを行う。方法としては電気泳動法を用いるのが一般的であり、一例として、ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて電気泳動を行い、標識に用いた蛍光物質が塩基ごとに異なることを利用して、レーザー蛍光検出器により順次塩基配列を決定することがあげられる。
　（８）塩基配列の解析
　決定された塩基配列を解析し、シークエンスデータを得る。それぞれ得られたシークエンスデータを照合して正確な塩基配列を決定する。
　（９）塩基配列のアラインメント
　上記のようにして得られた識別対象品種のシークエンスデータについて、アラインメントを行う。
　（１０）全識別対象品種の上記塩基配列で保存されている塩基の除外
　このようにして、アラインメントした結果、上記塩基配列から、全識別対象品種の上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を除外する。このように、全ての上記塩基配列で保存されている塩基の部位を除外することにより、一塩基多型の存在を明確に確認することができ、また、後の工程において一塩基多型に基づく識別マーカーの決定を容易に行うことができる。
　具体的には、アラインメントにより得られたデータから、全識別対象品種の塩基配列において塩基が保存されている部位を抽出する。「塩基が保存されている」とは、得られたアラインメントデータの縦列が全識別対象品種の塩基配列において全て同じ塩基であることを意味する。抽出された部位を全て除外する。保存された部位を全て除外する理由は以下のとおりである。
　すなわち、ホップ品種の塩基配列を比較する場合、大部分の塩基が全識別対象品種に共通して存在すると考えられる。しかし、本発明では、全識別対象品種に共通する部分を除いた一塩基多型の部分に着目することを特徴としており、当該一塩基多型が品種と相関性を有することに基づいて、識別マーカーを作製するものであるからである。
　抽出する方法は、全識別対象品種の塩基配列において保存された塩基を抽出できる方法であれば、目視、機械操作等どのような方法を用いてもよい。
　（１１）識別マーカーの決定
　上記の除外を行った後に残ったＳＮＰを用いて識別マーカーを決定する。前述の通り、本発明の識別マーカーは識別対象品種間で重複がないように品種と識別マーカーが１対１で対応するように決定する。なお識別マーカーは、その使用目的、すなわち識別対象とする品種の数や種類に応じて、識別マーカーを構成するＳＮＰをその都度決定する。例えば、特定の２品種のみを識別する場合には、当該２品種の識別が可能なＳＮＰを１箇所選択して識別マーカーとすることができる。また多数の品種について識別したい場合には、複数箇所のＳＮＰを（場合によっては複数の識別領域の複数箇所のＳＮＰを）組合せることにより、当該品種間で重複がないように識別マーカーを決定することができる。
　例えば、以下の実施例１において記載する表４に示すような１４品種のホップを識別対象とする場合、当該１４品種はＡ１領域（配列番号９）に存在する２４箇所のＳＮＰから９タイプに分類でき、Ｂ１領域（配列番号１０）に存在する１０箇所のＳＮＰから７タイプに分類でき、Ｃ１領域（配列番号１１）に存在する２９箇所のＳＮＰ（このうち配列番号１１の１２９～１３４番目の塩基に相当する６箇所が挿入欠失部分）から３タイプに分類でき、これらを組み合わせることによって、１４品種を１３タイプに分類できる。すなわち、１４品種のうち１２品種については、Ａ１領域、Ｂ１領域、Ｃ１領域それぞれに存在するＳＮＰによって、識別マーカーと品種が１対１で対応できる。さらに残った１タイプには類似の２品種が該当するため、これら類似２品種を識別する領域としてＡ１－２－Ｌ領域（配列番号１２）に存在する２１箇所のＳＮＰ（このうち１０箇所が挿入欠失部分）及びＡ１－２－Ｒ領域（配列番号１４）に存在する６７箇所のＳＮＰ（このうち４箇所が挿入欠失部分）のいずれかにより、識別マーカーと２品種を対応させることができる。このように、上述の１４品種を識別する場合、Ａ１領域の２４箇所のＳＮＰ、Ｂ１領域の１０箇所のＳＮＰ、Ｃ１領域の２９箇所のＳＮＰ（このうち６箇所が挿入欠失部分）、並びにＡ１－２－Ｌ領域及びＡ１－２－Ｒ領域中のいずれか１つのＳＮＰの、合計６４箇所のＳＮＰを識別マーカーとして決定することができる。また、例えば上述の１４品種の中からいくつかの品種を選んで識別対象とする場合には、上述の６４箇所のＳＮＰの中から該識別対象品種を識別するために必要なＳＮＰを選択して識別マーカーとして決定することも可能である。
　また、例えば上記類似２品種だけを識別対象品種とする場合には、Ａ１－２－Ｌ領域及びＡ１－２－Ｒ領域中のいずれか１つのＳＮＰを識別マーカーとして決定することができる。また、以下の実施例１において記載する表４に示すような１４品種のホップのうちSladeck、Spalter、Perle、Tettnang、及びNorthern Brewerの５品種を識別対象品種とする場合には、Ａ１－２－Ｌ領域（配列番号１３）に存在する２３箇所のＳＮＰ（このうち１１箇所が挿入欠失部分）を識別マーカーとして決定することができる。
　上記記載は、識別対象品種として実施例１の表４に示すドイツ及びチェコを原産国とする１４種のホップの場合を例に説明しているが、アメリカを原産国とする品種をも含む更なる多品種の識別の態様は実施例５を参照されたい。表２０に示されているように、枠で囲った２２塩基（塩基番号６４－８５）がPremiantとSummitには認められるのに対し、Zeusにはその挿入配列は存在しない。このように、挿入配列の有無も品種識別の要素とすることができる。挿入配列の長さは特に制限されるものではないが、例えば１９～２５塩基である。更に、この挿入配列中にもＳＮＰが認められ（塩基番号６４番目、６７番目、７５番目）、挿入配列中のＳＮＰを識別マーカーとすることもできる。更なる識別要素として、この挿入配列に続いて塩基番号１４１にまで達する（ＣＡ）もしくは（ＴＡ）の繰り返し配列の長さも識別要素となる。例えば、SummitはPremiantとZeusに比べて１２塩基長い構造になっている。
　また、先に述べたように、表４に示すような１４品種のホップを識別対象とする場合はＢ１領域（配列番号１０）に存在する１０箇所のＳＮＰから７タイプに分類できるが、アメリカを原産国とする品種（例えばGalena）を含む場合は、２４５～２４８番目の塩基もＳＮＰであり、識別マーカーとなる。
　また、先に述べたように、表４に示すような１４品種のホップを識別対象とする場合はＣ１領域（配列番号１１）に存在する２９箇所のＳＮＰから３タイプに分類できるが、アメリカを原産国とする品種（例えばGalena）を含む場合は、７６～８０、９３、１３６、１３８、１６３、１６５、２４５、３１３、３２１、３７３、３７６、４３５、４３８番目の塩基もＳＮＰであり、識別マーカーとなる。
　別の態様において、本発明の識別マーカーは、２以上の異なる品種のホップ由来の、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、クロロプラストＤＮＡを用いて作製してもよい。好ましくは、２以上の異なる品種のホップ由来のゲノムＤＮＡを用いてもよい。
　ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はクロロプラストＤＮＡを用いてホップの品種を識別するための識別マーカーを作製する場合は、識別マーカーを作製する方法は、以下の工程：
（ａ－１）２以上の異なる品種のホップの組織からゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はクロロプラストＤＮＡを抽出する工程；
（ａ－２）上記工程（ａ－１）の結果得られたＤＮＡをランダムに切断し、適当なサイズの断片を選別する工程；
（ａ－３）上記工程（ａ－２）で得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程；
（ｂ）上記工程（ａ－３）の結果得られたＤＮＡ断片の塩基配列を基に、品種ごとにアセンブルする工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）の結果得られたコンティグ及び／又はシングレットを品種間で比較して、品種間で相違する一塩基多型（ＳＮＰ）の探索を行う工程；
（ｄ）上記工程（ｃ）のＳＮＰ探索の結果、ＳＮＰが含まれる識別領域を選択し、該領域を増幅するためのプライマーを設計する工程；
（ｆ）上記工程（ｄ）で設計したプライマーを用いて、識別対象品種のホップから抽出したＤＮＡを鋳型として識別領域を増幅し、識別領域の塩基配列を決定する工程；及び
（ｇ）上記工程（ｆ）で決定した識別領域の塩基配列を品種間で比較して、識別対象品種を識別するために必要なＳＮＰの組み合わせで構成される識別マーカーを決定する工程；を含んでもよい。
　工程（ａ－１）～（ａ－３）は、当業者に知られた手法により行うことができる。特に、大量のＤＮＡ断片が得られるため、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定するにあたっては、超高速ＤＮＡ塩基配列解析装置を使用するのが好ましい。
　工程（ｂ）～（ｄ）及び（ｆ）～（ｇ）は、先に記載した態様であるトランスクリプトーム解析による方法において説明した手法で行うことができる。
　また、トランスクリプトーム解析による方法では、イントロンを含まないｍＲＮＡに基づいて、翻訳領域または５’又は３’非翻訳領域のＳＮＰを探索しているのに対し、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はクロロプラストＤＮＡを用いる態様では、イントロンを含めたＤＮＡの全領域のＳＮＰ探索を行う。このことから、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はクロロプラストＤＮＡを用いる場合は、トランスクリプトーム解析による識別マーカーの作製方法においてＳＮＰを含有する領域を増幅するために設計されたプライマーによる該領域の増幅確認に相当する工程（ｅ）を省略することができる。
　上記トランスクリプトームを用いる態様、及びゲノムＤＮＡ（核ゲノム）、ミトコンドリアＤＮＡ、又はクロロプラストＤＮＡを用いる態様では、まず初めに２以上の異なるホップ品種を用いてＳＮＰ探索を行ない識別領域とプライマーを決定した後、全識別対象品種を用いて識別領域の塩基配列を比較し識別マーカーに適したＳＮＰを決定するという２段階の方法で識別マーカーを作製しているが、初めから識別対象品種全てを用いてＳＮＰ探索を行ない識別領域とプライマーを決定した後、該識別領域の塩基配列を比較し識別マーカーに適したＳＮＰを決定することもできる。すなわち先に記載した二つの態様において、初めから識別対象品種全てを用いる場合には、識別対象品種の識別領域の塩基配列を決定する工程（ｆ）が不要となる。
　＜ホップ品種の識別方法＞
　本発明はまた、ホップ品種を識別するための方法を提供する。具体的には、ホップ品種の識別方法は、以下の工程：
（ｉ）被検体のホップ由来のＤＮＡについて、品種識別領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程であって、当該品種識別領域はホップ品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成される識別マーカーを含む、前記工程；
（ｉｉ）上記工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について、一塩基多型の遺伝子型を同定する工程；
（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）で同定された被検体のホップのＤＮＡについての品種識別領域中の一塩基多型の遺伝子型と、既知のホップ品種のＤＮＡについての対応する領域中の一塩基多型の遺伝子型を比較し、当該領域の中の一塩基多型の遺伝子型について被検体のホップと既知のホップ品種の間での一致又は不一致を解析する工程；
（ｉｖ）上記工程（ｉｉｉ）の解析結果に基づいて被検体のホップの品種を特定する工程；
を含んでもよい。
　被検体のホップは、学名Humulus lupulusとして分類される植物であれば特に限定されない。例えば、識別マーカーの作製方法の項目において列挙したヨーロッパ原産のホップ、アメリカ原産のホップが挙げられるがこれらに限定されない。
　一態様として、被検体のホップは、実施例１の表４に示す１４種のホップである。
　上記の工程（ｉ）～（ｉｖ）について、以下の通り説明する。
　（ｉ）品種識別領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程
　品種識別領域を含むＤＮＡ断片は、品種を識別しようとする被検体のホップからゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、基準とする識別マーカーを有する領域を増幅し得る品種識別プライマーを用いて品種識別領域を含むＤＮＡ断片を増幅する。ゲノムＤＮＡの抽出及びＤＮＡ断片の増幅は、例えば、上述の＜識別マーカーの作製方法＞の「（ｆ）識別領域の塩基配列を決定する工程、及び（ｇ）識別対象品種の識別マーカーを決定する工程」の項目において、（１）ホップの入手～（３）ＤＮＡ断片の増幅、として記載した手法に従って、又はこれに準じて行ってもよい。
　品種識別領域は、上述の識別マーカーの作製方法により作製された識別マーカーを含む領域である。識別マーカーを構成する一塩基多型が複数の領域に存在する場合、品種識別領域は、該複数の領域であってもよい。また、識別マーカーを構成する一塩基多型が複数存在する場合、品種識別領域は、これら全部が存在する一つの領域であっても、また少なくとも１個の一塩基多型が存在する領域が複数あってもよい。具体的な品種識別領域としては、
配列番号９（Ａ１領域）の塩基配列の７４、７７、８７、１０３、１１６、１１８、１２１、１２５、１３４、１３５、１４８、１９２、１９５、１９７、１９９、２０３、２０４、２２６、２３０、２３５、３０６、３１６、３３０、５３２番目；
配列番号１０（Ｂ１領域）の塩基配列の１７８、２０４、２２７、２３４、３７０、４２６、４３９、５４７、５６２、６２４番目；
配列番号１１（Ｃ１領域）の塩基配列の３、１３、１７、８７、８８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、２５４、３３１、３５６、３７５、３８０、３９６、３９８、３９９、４２１、４６０、４７４、４７５、４７６、４７７、４８０、４８１、５００、５４７番目（１２９～１３４番目はｉｎｄｅｌ部分）；
配列番号１２（Ａ１－２－Ｌ領域）の塩基配列の３４、１０１、１１８、１２４、１６４、１６８、１７１、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、３９２、３９８、３９９、４５９、５０２番目（１８６～１９４、及び３９９番目はｉｎｄｅｌ部分）；
配列番号１３（Ａ１－２－Ｌ領域）の塩基配列の２、１２、３１、９８、１１５、１２１、１６１、１６５、１６８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、３８９、３９５、３９６、４５６、４９９番目（１２、１８３～１９１、及び３９６番目はｉｎｄｅｌ部分）；
配列番号１４（Ａ１－２－Ｒ領域）の塩基配列の１、２、３、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５６、５７、５８、５９、６３、６５、６８、７２、７８、７９、８４、８６、８８、９０、９２、１１８、１５３、１５４、１９１、２０５、２０６、２２６、２２８、２３３、２５４、２８９、３１５、３５０、３９２、４０５番目（５７～５９及び６５番目はｉｎｄｅｌ部分）；
配列番号１５（Ａ１－２－Ｒ領域）の塩基配列の２、６、１２、１３、１８、２０、２２、２４、２６、３６、５２、８７、８８、１２５、１３９、１４０、１６０、１６２、１６７、１８８、２２３、２４９、２７３、２８４、３２６、３３９、４２１、４３７番目（４３７番目のｉｎｄｅｌ部分）；
において記号ｎで示された一塩基多型またはｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域が挙げられる。
　一態様において、品種識別領域は、配列番号９（Ａ１領域）の塩基配列の一部又は全部であって記号ｎで示された一塩基多型の少なくとも一つを含む領域であってもよく、品種識別領域は、配列番号９の塩基配列を含む領域であってもよい。または、品種識別領域は、配列番号１０（Ｂ１領域）の塩基配列の一部又は全部であって記号ｎで示された一塩基多型の少なくとも一つを含む領域であってもよく、品種識別領域は、配列番号１０の塩基配列を含む領域であってもよい。あるいは、品種識別領域は、配列番号１１（Ｃ１領域）の塩基配列の一部又は全部であって記号ｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域であってもよく、品種識別領域は、配列番号１１の塩基配列を含む領域であってもよい。さらには、品種識別領域は、配列番号１２若しくは１３（Ａ１－２－Ｌ領域）の塩基配列の一部又は全部であって記号ｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域であってもよく、品種識別領域は、配列番号１２若しくは１３の塩基配列を含む領域であってもよい。また、品種識別領域は、配列番号１４若しくは１５（Ａ１－２－Ｒ領域）の塩基配列の一部又は全部であって記号ｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域であってもよく、品種識別領域は、配列番号１４若しくは１５の塩基配列を含む領域であってもよい。
　別の態様において、品種識別領域は、配列番号９（Ａ１領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型の少なくとも一つを含む領域；配列番号１０（Ｂ１領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型の少なくとも一つを含む領域；配列番号１１（Ｃ１領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域；配列番号１２若しくは１３（Ａ１－２－Ｌ領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域；及び、配列番号１４若しくは１５（Ａ１－２－Ｒ領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域；からなる群より選択される領域の２以上の領域であってよい。あるいは、品種識別領域は、配列番号９（Ａ１領域）の塩基配列を含む領域、配列番号１０（Ｂ１領域）の塩基配列を含む領域、配列番号１１（Ｃ１領域）の塩基配列を含む領域、配列番号１２若しくは１３（Ａ１－２－Ｌ領域）の塩基配列を含む領域、及び配列番号１４若しくは１５（Ａ１－２－Ｒ領域）の塩基配列を含む領域からなる群より選択される領域の２以上、３以上、４以上、又は５つすべての領域であってよい。
　さらに別の態様において、品種識別領域は、配列番号９（Ａ１領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型の少なくとも一つを含む領域、配列番号１０（Ｂ１領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型の少なくとも一つを含む領域、及び配列番号１１（Ｃ１領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域、からなる群より選択される領域の１以上の領域に加えて、配列番号１２若しくは１３（Ａ１－２－Ｌ領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域又は配列番号１４若しくは１５（Ａ１－２－Ｒ領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域、であってよい。または、品種識別領域は、配列番号９（Ａ１領域）の塩基配列を含む領域、配列番号１０（Ｂ１領域）の塩基配列を含む領域、及び配列番号１１（Ｃ１領域）の塩基配列を含む領域、からなる群より選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは３つすべて、の領域に加えて、配列番号１２若しくは１３（Ａ１－２－Ｌ領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域又は配列番号１４若しくは１５（Ａ１－２－Ｒ領域）の塩基配列の一部又は全部であってｎで示された一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む領域、であってよい。あるいは、品種識別領域は、配列番号９（Ａ１領域）の塩基配列を含む領域、配列番号１０（Ｂ１領域）の塩基配列を含む領域、及び配列番号１１（Ｃ１領域）の塩基配列を含む領域、からなる群より選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは３つすべて、の領域に加えて、配列番号１２若しくは１３（Ａ１－２－Ｌ領域）の塩基配列を含む領域又は配列番号１４若しくは１５（Ａ１－２－Ｒ領域）の塩基配列を含む領域、であってよい。
　品種識別プライマーは、識別マーカーを作製する際に決定した、識別領域を増幅し得るプライマーであっても、また識別マーカーを含有する領域（品種識別領域）を増幅し得るように別途設計されたプライマーであってもよい。識別マーカーを構成する一塩基多型が複数の領域に存在する場合、品種識別プライマーは、それぞれの領域を増幅し得るプライマーであってもよい。また、識別マーカーを構成する一塩基多型が複数存在する場合、品種識別プライマーは、これら全部が存在する一つの領域を増幅しうるプライマーであっても、また少なくとも１個の一塩基多型が存在する複数の領域をそれぞれ増幅しうる複数のプライマーであってもよい。
　品種識別プライマーとして利用可能なプライマーには、配列番号１～８に記載の塩基配列からなるプライマーが含まれる。工程（ｉ）においてＤＮＡ断片増幅のために用いられるプライマーセットの例は、配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、並びに、配列番号７及び８の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、からなる群より選択される１以上の組み合わせのプライマーセットが挙げられる。
　別の態様において、工程（ｉ）は、配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、並びに、配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、からなる群より選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは３つすべて、のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により行われる。
　別の態様において、工程（ｉ）は、配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、並びに、配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、の３つのプライマーセットに加えて、配列番号７及び８の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により行われる。
　（ｉｉ）一塩基多型の遺伝子型を同定する工程
　工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について、一塩基多型の遺伝子型を同定する。
　一態様において、一塩基多型の遺伝子型の同定は、品種識別領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を同定することにより行われる。塩基配列の解析は、例えば、上述の＜識別マーカーの作製方法＞の「（ｆ）識別領域の塩基配列を決定する工程、及び（ｇ）識別対象品種の識別マーカーを決定する工程」の項目において、（５）ＰＣＲ産物の精製～（８）塩基配列の解析、として記載した手法に従って、又はこれに準じて行ってもよい。
　別の態様において、一塩基多型の遺伝子型の同定は、増幅したＤＮＡ断片について、識別マーカーを構成し、ホップ品種間で相違する一塩基多型を検出するプローブ及び／又はプライマーと接触させることにより、行ってもよい。一塩基多型を検出するプローブ及び／又はプライマーは、当業者に公知の手法に従って設計及び作製することができる。そのようにして得られたプローブを用いる一塩基多型の遺伝子型の同定は、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法などの、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。また、プライマーを用いる一塩基多型の遺伝子型の同定は、配列解析によるもののほか、ＳＮａＰｓｈｏｔ（登録商標） 法（ライフテクノロジーズ社）など、検出すべき一塩基多型に応じて長さが異なる増幅産物が生じるよう設計したプライマーを利用した同定方法が利用できる。また、プローブ及びプライマーを用いる一塩基多型の遺伝子型の同定は、ＭＧＢ（Minor Groove Binder）プローブ（ライフテクノロジーズ社）とそれを挟むように設計されたプライマーを併用するリアルタイムＰＣＲ法などが利用できる。
　（ｉｉｉ）品種識別領域中の一塩基多型の遺伝子型を比較し、解析する工程
　工程（ｉｉｉ）では、被検体のホップのＤＮＡについての品種識別領域中の識別マーカーを構成する一塩基多型の遺伝子型と、既知のホップ品種のＤＮＡについての対応する領域中の一塩基多型の遺伝子型を比較する。そして、この比較において、識別マーカーを構成する一塩基多型の遺伝子型について、被検体のホップと既知のホップ品種の間での一致または不一致を解析する。
　比較は、視覚的検査や数学的計算により行うことができる。又は、コンピュータプログラムを用いることもできる。また、比較は、品種識別領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列と、既知のホップの品種のＤＮＡについての対応する領域の塩基配列を比較することにより行ってもよい。比較は、一般的に被検体の遺伝子上にある一塩基多型の検定（ＳＮＰのタイピング）で採用される方法により行うことができる。
　以下に、塩基配列を直接比較する場合の具体的な比較の方法を、解析用コンピュータプログラムを用いた場合について例示する。すなわち、上述の識別マーカー作製方法により得られた識別マーカーの、塩基を表すデータと、前記塩基の塩基配列位置を表すデータとを含む識別マーカーテーブルを予め、SeqScape（Life Technologies）等の解析用コンピュータプログラムが動作したコンピュータに格納する。格納する識別マーカーテーブルは１つでも又は複数であってもよい。そして、被検体であるホップから得られた塩基を表すデータを含む被検体塩基配列のリストを前記コンピュータに格納する。
　そして、前記識別マーカーテーブルの前記塩基配列位置を表すデータを参照して、被検体塩基配列リストと、前記識別マーカーテーブルとの間の対応する塩基配列位置にある塩基を表すデータを前記コンピュータで比較させる。比較は、前記解析用コンピュータプログラムにより両者の塩基配列をアラインメントすることにより行うことができる。
　（ｉｖ）被検体のホップの品種を特定する工程
　工程（ｉｖ）では、工程（ｉｉｉ）の解析結果に基づいて、被検体のホップの品種を特定する。
　具体的には、被検体の塩基配列中の識別マーカーに相当する部位の塩基と前記識別マーカーの塩基が完全に一致するかを解析し、完全に一致する場合は、被検体は前記識別マーカーの品種であると特定する。
　このように、本発明の識別マーカーを用いると、被検体であるホップの品種を特定することができる。コンピュータを用いて解析をする場合、予め複数の品種に関する識別マーカーを有する領域の塩基配列を記録しておき、被検体の塩基配列を各品種の塩基配列と順次、比較・解析を行うことにより、簡易かつ迅速に被検体であるホップの品種を特定することができる。
　なお、識別マーカーとして決定した特定の塩基を色付けすることにより、上記した比較を容易に実行することもできる。すなわち、まず、着色された対照の塩基（識別マーカー）を有する塩基配列と、被検体の塩基配列をアラインメントした後、着色された塩基だけを抜き出して両者を比較した表を作成する。これにより塩基の種類と存在する位置の全てが一致するか否かの識別が容易になり、被検体であるホップがその識別マーカーの品種であるか否かを容易に判別できる。なお、この方法は複数の被検体を同時に解析できるため好ましい。
　＜識別マーカーを含む核酸＞
　本発明は、上記の識別マーカーを作製する方法により作製された識別マーカーの少なくとも一部を含む核酸をも提供する。
　ここで「核酸」とは、２以上のヌクレオチドで構成されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。ＤＮＡの塩基配列で記載された核酸についてＲＮＡが意図される場合には、ＤＮＡの塩基配列のチミンをウラシルに置き換えて理解すべきであることは当業者に理解されよう。また、核酸は一本鎖であってもよく、相補鎖とハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
　具体的には、識別マーカーの少なくとも一部を含む核酸は、配列番号９（Ａ１領域）、配列番号１０（Ｂ１領域）、配列番号１１（Ｃ１領域）、配列番号１２若しくは１３（Ａ１－２－Ｌ領域）、配列番号１４若しくは１５（Ａ１－２－Ｒ領域）、からなる群より選択される塩基配列の一部を含み、かつ、当該塩基配列において記号ｎで示される一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを含む核酸であってもよい。好ましくは、識別マーカーの少なくとも一部を含む核酸は、配列番号９（Ａ１領域）、配列番号１０（Ｂ１領域）、配列番号１１（Ｃ１領域）、配列番号１２又は１３（Ａ１－２－Ｌ領域）、及び、配列番号１４又は１５（Ａ１－２－Ｒ領域）、からなる群より選択される塩基配列を含む核酸であってもよい。
　＜プライマー＞
　本発明は、上記の識別マーカーの少なくとも１部を含む核酸を増幅することができる、プライマーをも提供する。
　プライマーは、上記の識別マーカーの少なくとも一部を含む核酸を増幅し得るように設計されたプライマーであれば、特に限定されない。
　＜プローブ＞
　本発明は、識別マーカーを構成する一塩基多型を検出するためのプローブをも提供する。
　プローブは、例えば、配列番号９（Ａ１領域）、配列番号１０（Ｂ１領域）、配列番号１１（Ｃ１領域）、配列番号１２又は１３（Ａ１－２－Ｌ領域）、及び、配列番号１４又は１５（Ａ１－２－Ｒ領域）、からなる群より選択される塩基配列において、ｎで示される一塩基多型又はｉｎｄｅｌ部分の少なくとも一つを検出することができるものである。
＜異品種の混入を検出する方法＞
　異品種の混入が懸念される場合、本発明の識別マーカーを利用して、例えば以下に記載する方法で、異品種の混入を検出することができる。
　ホップ試料における異品種の混入を検出する方法であって、以下の工程：
（ｉ）被検体のホップ試料から抽出したＤＮＡについて、品種識別領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程であって、当該品種識別領域はホップ品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成される識別マーカーを含む、前記工程；
（ｉｉ）上記工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について品種識別領域の塩基配列を解析し、シークエンスデータを得る工程；
（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータについて、識別マーカーを構成する一塩基多型部位の情報を、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と比較する工程；及び 
（ｉｖ）ホップ試料における異品種の混入の有無を決定する工程、ここで、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致する場合は、異品種の混入はないと判断し、あるいは、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、異品種の混入があると判断する；
を含む、前記方法。
　さらに、（ｉｖ）に引き続いて以下の工程を行うことにより、混入品種の推定又は特定を行なうことができる。すなわち、
（ｖ）上記工程（ｉｖ）で、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位に出現している正常品以外に由来する情報から、その塩基を特定する工程；及び
（ｖｉ）上記工程（ｖ）で特定された一塩基多型部位の正常品とは異なる塩基を、識別マーカーと照合し、混入品種を推定又は特定する工程；
を含む。
　また、さらに（ｉｖ）に引き続いて以下の工程を行うことにより、混入割合を分析することができる。すなわち、
（ｖ）上記工程（ｉｖ）で、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位に出現している正常品以外に由来する情報から、その塩基を特定し、混入割合を求める工程；及び
（ｖｉ）上記工程（ｖ）で特定された一塩基多型部位の正常品とは異なる塩基を、識別マーカーと照合し、混入品種とその混入割合を推定又は特定する工程；
を含む。
　ここで、シークエンスデータの一塩基多型部位の情報とは、例えばシークエンスの結果得られた、一塩基多型部位の形状や数値であり、具体的には、シークエンスの結果得られた、一塩基多型部位のエレクトロフェログラム（シークエンスのときに得られる各塩基を示す色分けされた波形）や、増幅断片を大腸菌などにクローニングし、得られた複数個のクローンについてシークエンスを行い、それらの配列を比較することで得られる一塩基多型部位での塩基の含有比率などが挙げられる。
　また、ここにおいて正常品とは、単一品種であって、識別マーカーを構成する一塩基多型部位の情報が確立されているホップ品種を意味する。場合により、正常品という記載は、識別マーカーを構成する一塩基多型部位の情報が確立された単一品種のみを含む試料を意味することもある。
　エレクトロフェログラムを用いて、異品種の混入を検出する場合には、被検体であるホップ試料のエレクトロフェログラムに、正常品の波形とは別の波形が重なって出てくることで異品種の存在が確認できる。そして一塩基多型部位に出現する正常品とは別の波形からその塩基を特定し、識別マーカーと照合することによって、混入品種を推定又は特定することができる。各識別マーカー（ＳＮＰ）におけるその品種に特徴的な塩基が全て認められれば、混入品種の特定が可能である。更に、それらの波形の重なり具合や高さなどから、別途実施したあらかじめ混入割合が既知の他品種混合品の解析結果と比較することで、異品種のおおよその混入割合が求められる。
　また増幅断片を大腸菌などにクローニングして得られた複数個のクローンのシークエンスデータを用いる場合には、その複数個のクローンの配列をアライメントして一塩基多型部位ごとに塩基の含有比率を求めることによって、異品種の混入を検出することが可能である。すなわち異品種が混入していなければ、含有比率は、いずれの部位も正常品の塩基と同じ塩基が１００％となるはずであるが、異品種が混入していると正常品の塩基と同じ塩基が１００％とはならず、別の塩基の含有比率が認められる。このようにして正常品の塩基とは異なる塩基を、識別マーカーと照合することによって、混入品種を特定し、含有比率を求めることができる。ただし大腸菌にクローニングする方法は、数多くのクローンを分析する必要があるため多大な労力と時間を要する作業が発生する。
　一塩基多型部位ごとに塩基の含有比率を求める別の方法として、被検体であるホップ試料の品種識別領域を含むＤＮＡ断片を、次のステップに必要な付加配列を有する特異的なプライマーを用いて増幅し、それを次世代シークエンサーで大量にシークエンスし、それらをアライメントして一塩基多型部位ごとに塩基の含有比率を求めることで、混入品種の特定と混入比率をより正確に求めることが可能である。
　また、プライマーを多型（ＳＮＰ）直前に設定し、一塩基のみを伸長させて取り込んだ塩基の種類で多型のタイピングを行う方法がある。例えば、ＳＮａＰｓｈｏｔ（登録商標） 法（ライフテクノロジーズ社）と呼ばれる方法である。また、ＭＧＢ（Minor Groove Binder）プローブ（ライフテクノロジーズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ法で異品種を定量的に分析できる方法がある。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　実施例１　識別マーカーの作製
　（ａ）トランスクリプトーム解析
　ホップ品種識別技術開発に必要な品種間ＤＮＡ多型領域を得るため、次世代シークエンサーを用いて大量のシークエンスデータを得、それらの中から広範囲にＳＮＰ（ヒトゲノムの場合のＳＮＰが検出される頻度は、１個／１００－３００塩基と考えられている；http://www.eubios.info/hmback.htm）を探索したいと考えた。そこで本発明者らはトランスクリプトームに着目した。トランスクリプトーム解析は全ゲノムを対象とする場合に比べて、おおよそ１／１００程度のデータ処理で済み、納期やコストが抑えらる。しかも全ゲノムに比べて少ないとは言え、我々の計算では１万５千個ものＳＮＰデータが利用できる。そのため、多品種識別に必要なＳＮＰが得られるであろうと想定し、本手法を利用して品種間のＳＮＰ解析を実施した。
　（１）試料の採取・保管
　次項の表４に記載の識別対象品種の中から３品種（便宜上、品種Ａ、Ｂ、Ｃと記載する）を選択し、該品種のホップ生葉を採取した。すなわち、以下に示す方法でサンプリング・保管を実施した。
ａ．組織－できるだけ若い葉（小さい、黄緑色、やわらかい）を採取した。ただし表面に白い異物が付着したような葉は除外した。
ｂ．方法－ＲＮａｓｅの付着を防止するため、手術用手袋をはめた手で葉を採取した。採取と同時にＲＮＡ分解防止用の試薬に浸漬した。
ｃ．保管－常温で少なくとも１週間程度はＲＮＡが安定であるが、トランスクリプトーム解析及びＳＮＰ配列解析を行うまでの間、可能な限り冷蔵庫に入れて保管した。
　（２）トランスクリプトーム解析
　上記のように採取した試料について、トランスクリプトーム解析を、Eurofins社に委託して行った。具体的には、全ＲＮＡの抽出、ｍＲＮＡの精製、ｃＤＮＡライブラリーの作成、発現量の差の均一化、サイズ調整（５００～７００ｂｐ）、GS FLXシークエンサー用のｃＤＮＡライブラリーの調製、「Titanium Chemistry」を用いたRoche/454 Genome Sequencer FLXによるシークエンスを行った。
　（ｂ）アセンブル（コンティグの作成）
　トランスクリプトームデータを用いたＳＮＰ解析
　上記トランスクリプトーム解析によって得られたシークエンスデータを用いてコンティグの作成を、Eurofins社に委託して行った。具体的には、各ホップ品種についてＤＮＡ断片の塩基配列を基に、クラスタリングとアセンブルを行った。その結果、各品種より合計約４２０００～４５０００種のコンティグ（ｃＤＮＡの一部）の塩基配列を取得した。そのうち、１０００ｂｐ以上の長さを有するコンティグは約４５００～６７００個であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（ｃ）ＳＮＰの探索
　次に上記アセンブルによって得られたコンティグとシングレットのシークエンスデータを用いてＳＮＰの探索を、Eurofins社に委託して行った。具体的には、品種Ｃのコンティグ及びシングレットの塩基配列を参照配列（reference）にして、品種Ｂ、品種Ａのシングルリードをそれに当てて、共通部分を有するか否かでそれぞれマッピングする。さらにマッピングされたシングルリードが構成要素となっているコンティグを解析ソフト上で展開したアセンブル情報から割り出す。このようにして得られたリファレンスとその他の品種のコンティグ及び／又はシングレットについてアライメントを行い、ＳＮＰの探索を実施した（バイオインフォマティクス解析）。しかし、それだけでは不十分であったので、品種Ｂのコンティグ及びシングレットの塩基配列を参照配列にして、品種Ａ、品種Ｃのシングルリードをそれに当てて、上記と同様の方法でＳＮＰの探索を実施し、さらに品種Ａのコンティグ及びシングレットの塩基配列を参照配列にして、品種Ｂ、品種Ｃのシングルリードをそれに当てて、上記と同様の方法でＳＮＰの探索を実施した。
　（ｄ）ＳＮＰが含まれる領域の選択及びプライマーの設計
　上記ＳＮＰ探索によって得られたＳＮＰデータを用いて、リファレンスを除く２品種がホモであるＳＮＰを抽出し、さらにその中からコンティグあたりのＳＮＰ数の多い領域を抽出した。結果を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　このようにして選択したそれぞれの解析領域を、Ｂ１領域、Ａ１領域、Ｃ１領域、Ａ１－２領域と命名し、ＳＮＰを含むエリアが増幅されるようなプライマーを設計し、合成した。それぞれのプライマーの配列を以下に記した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（ｅ）識別領域とプライマーの決定
　前記トランスクリプトーム解析に用いたホップ３品種（品種Ａ、Ｂ、及びＣ）のペレット又は乾燥毬花からＤＮＡを抽出し、表３に記載のプライマーを用いてＡ１、Ｂ１、Ｃ１及びＡ１－２の各領域を増幅し、サンガー法によるダイレクトシークエンスを実施した。具体的には、下記（ｆ）の（２）～（８）と同様の方法で行った。その結果、増幅することを確認し、また次世代シークエンサーから得られたデータとの比較を行い、品種Ａ、Ｂ、Ｃの三者間での識別が可能であることを確認した。
　（ｆ）識別対象品種を用いた識別領域のシークエンス
　Ａ１、Ｂ１、Ｃ１及びＡ１－２の各領域（及び含まれるＳＮＰ）の解析は、上記３品種以外の品種の識別にも適用可能と判断し、品種を拡大して解析を進めた。
　（１）ホップの品種識別に供試した品種
　識別対象品種として、以下の表４に記した１４品種を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（２）ＤＮＡ抽出
　ａ．ホップペレットからの抽出
　ホップペレットを乳鉢中で磨砕するか、スパチュラなどで細かく砕き、その１０～５０ｍｇから下記ＣＴＡＢ法を用いてＤＮＡを抽出した。
　ＣＴＡＢ（Cetyltrimethyl ammonium bromide）法によるＤＮＡ抽出は以下のように行った。２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ（Calbiochem社製）、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ（Polyvinylpyrrolidone）を組成とするＣＴＡＢ液を調製した。このＣＴＡＢ液６５０μｌと１ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅＡ溶液２μｌを上記のように粉砕した検体と共に１．５ｍｌ容のマイクロチューブに入れよく攪拌した。この検体とＣＴＡＢ液の入ったマイクロチューブを内部の試料が浸るように６５℃の恒温水槽に漬けて１時間インキュベートしてホップの細胞を破砕した。次に等量（６５０μｌ）のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加え、手で３分間転倒混和した。短時間の遠心分離（Beckman Allegra 21R Centrifuge F2402H；１５，０００ｒｐｍ（約１５，０００×ｇ）で１～５分間））を行い、有機溶媒層（下層）と水層（上層）に分画し、水層（約４００μｌ）を新しいチューブに移した。等量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後、上記と同様に遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿を約５００μｌの７０％エタノールでリンスし、遠心エバポレーターで約５分間乾燥させたものを、２０～５０μｌのＴＥバッファーに溶解してＤＮＡ試料とした。
　ｂ．ホップ乾燥毬花からの抽出
　ホップ乾燥毬花約１ｇを液体窒素存在下で乳鉢中で磨砕し、その１０～５０ｍｇから上記と同様にＤＮＡ試料を調製した。
　（３）ＰＣＲ
　識別領域のＤＮＡ断片の増幅は、上記（２）で調製したＤＮＡ試料及びPerfectShot Ex Taq(Loading dye mix)（タカラバイオ株式会社）を用い、添付のマニュアルに準じてＰＣＲ反応液（５０μｌ；０．２ｍｌ容のマイクロチューブ）を調製して行った。識別領域として、Ａ１領域、Ｂ１領域、Ｃ１領域、Ａ１－２領域を選択し、この領域のＤＮＡ断片を増幅した。各識別領域のＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーの名称及び塩基配列、並びにＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件を以下にまとめた。
　Ａ１領域解析用プライマーセット
Ａ１－３Ｌ：　　TAAGGTGTTGGGAGGGTTGA（配列番号１）
Ａ１－３Ｒ：　　CCACCAATAACAGGCTCCAC（配列番号２）
　Ｂ１領域解析用プライマーセット
Ｂ１－１Ｌ：　　CAGACTTGTGGCTGTCAAAAA（配列番号３）
Ｂ１－１Ｒ：　　CTTCTCCTTCGAACCTGTCG（配列番号４）
　Ｃ１領域解析用プライマーセット
Ｃ１－１Ｌ：　　CGGCGTTTTTCAATTTTCAT（配列番号５）
Ｃ１－１Ｒ：　　GTGATGACTCGGGCTTCAGT（配列番号６）
　Ａ１－２領域解析用プライマーセット
Ａ１－２－１Ｌ：　　GAAATCTGCTTKGAGAAACCTGG（配列番号７）
Ａ１－２－１Ｒ：　　GCAGGTATCTTTGTAGGTACATC（配列番号８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（４）ＰＣＲによる増幅の確認
　上記で得られたＰＣＲ反応液の５μｌをアガロースゲル電気泳動に供した。この際、ミニゲル電気泳動システム「Ｍｕｐｉｄ」を用いて電気泳動を実施し（ゲル；３％　NuSieve 3:1 Agarose（ＦＭＣバイオプロダクツ社製、又はCambrex Bio Science Rockland社製、泳動条件；１００Ｖ、３０分）、２μｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液中で約４０分間染色後、ＵＶ照射下で増幅産物の写真撮影を行った。その結果、各ＤＮＡ試料について、目的の大きさのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。各プライマーセットを用いた場合に増幅されるＤＮＡ断片の大きさを下表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（５）ＰＣＲ産物の精製
　上記ＰＣＲ産物の精製にはQIAquick PCR Purification Kit (50)（キアゲン社）を使用し、プロトコ－ルに基づいて以下の方法で行った。すなわち、ＰＣＲ反応液（残量約４５μｌ）にPBI Bufferを５倍量（２２５μｌ）加えて、混和した。次に、この液をQIA quickspinに入れ、１３，０００ｒｐｍ（約１１，０００×ｇ）で１分間遠心分離した。ろ液を捨て、７５０μｌ　PE Bufferを添加した後、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ろ液を捨て、再度１４，０００ｒｐｍ（約１３，０００×ｇ）で１分間遠心分離した。ろ液を捨て、新しい１．５ｍｌエッペンチューブにカラムを移し、３０μｌ　EB Bufferを添加し、１分間放置後、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、ろ液をサンプルとした。
　（６）サイクルシークエンス反応及びシークエンス産物の精製
　BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Life Technologies）を用い、その日本語版プロトコール（ｐ．２２「１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡのサイクルシークエンス」、ｐ．２５「GeneAmp PCR System 9700, 9600, 2700, 2400でのサイクルシークエンス」及びｐ．３８－４０「スピンカラム（やスピンプレート）での精製法」）に基いて以下のように実施した。なお、用いたプライマーの塩基配列は、目的のＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅に用いたものと同じである。すなわち、ＰＣＲ産物の精製液を５～２０ｎｇ／μｌになるように滅菌蒸留水で希釈し、このうちの２μｌにSequence premix(Big dye)を８μｌと１μＭに希釈した各プライマーをそれぞれ単独（プライマーセットのうちのいずれか一方）で３．２μｌ添加し、滅菌蒸留水にて最終２０μｌに調整したサイクルシークエンス反応液を得た。これを０．２ｍｌ容のマイクロチューブ（ＰＣＲ用）に入れ、ＰＣＲ装置（DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600；旧Perkin Elmer社製）にセットして、変性（９６℃、１分）を行った後、変性（９６℃、１０秒）、アニーリング（５０℃、５秒）、鎖伸長（６０℃、４分）の反応を２５回繰り返した。なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を４℃に下げて保持した。
　シークエンス産物は、CENTRI-SEP Spin Column（Life Technologies）にて精製した。すなわち、充填剤を室温で２時間以上膨潤させて前処理の完了しているCENTRI-SEP Spin Columnの中心部に上記シークエンス産物（約２０μｌ）を載せるように添加し、１．５ｍｌ容のマイクロチューブを下部に受け、２，７００ｒｐｍ（約５００×ｇ）、２分間遠心分離を行い、マイクロチューブ内に集まった溶液を精製ＤＮＡとして回収した。この溶液を減圧下で乾燥させた後、２０μｌのＴＳＲ又はHi-Di formamideを添加し、１０分間程度放置した後、よく混和した。この液を０．２ｍｌ容のマイクロチューブ（ＰＣＲ用）に移し、DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600にて変性（９５℃、２分）を行い、直ちに氷中に挿入して急冷し、そのまま１０分間以上放置した。
　（７）ＤＮＡシークエンス
　ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを使用し、「ABI PRISM 310 Genetic Analyzer操作ガイド」に基づいて実施した。すなわち、上記の急冷後の試料をサンプルチューブに移し、チューブセプタで蓋をし、４８穴サンプルトレーにセットした。その後は、操作ガイドに従ってDye Terminator法によりシークエンスを実施した。なお、解析装置によって異なるがシークエンスできる範囲には限界がある。従ってＡ１－２領域は断片の大きさが約１５００ｂｐであるため、シークエンスデータは、５’側（プライマーＬ）から約５００ｂｐのＡ１－２－Ｌ領域と、３’側（プライマーＲ）から約８００ｂｐのＡ１－２－Ｒ領域の２領域のデータが得られた。
　（８）塩基配列の決定
　５’側（プライマーＬ）と３’側（プライマーＲ）からそれぞれ得られたシークエンスデータを照合して正確な塩基配列を決定した。
　（ｇ）識別マーカーの決定
　上記（ｆ）で決定された１４品種の塩基配列について、各識別領域ごとにアラインメントを行い、ＳＮＰの箇所を検出した。
　識別対象品種として選んだ１４品種のホップについて、Ａ１領域の塩基配列を決定した。各品種におけるＡ１領域の塩基配列を表す配列番号を以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　これらの塩基配列についてアラインメントを行い、Ａ１領域のコンセンサス配列（配列番号９）を決定した。表７に示す各品種について決定された塩基配列について、Ａ１領域の２４箇所のＳＮＰ、すなわち、配列番号９の７４、７７、８７、１０３、１１６、１１８、１２１、１２５、１３４、１３５、１４８、１９２、１９５、１９７、１９９、２０３、２０４、２２６、２３０、２３５、３０６、３１６、３３０、５３２番目の位置に対応するＳＮＰを評価した。識別対象品種の１４種のホップは、Ａ１領域における２４箇所のＳＮＰについて、タイプ１～タイプ９の９通りの組み合わせを示した。その結果を図１に示した。
　次に、識別対象品種として選んだ１４品種のホップについて、Ｂ１領域の塩基配列を決定した。各品種におけるＢ１領域の塩基配列を表す配列番号を以下の表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　これらの塩基配列についてアラインメントを行い、Ｂ１領域のコンセンサス配列（配列番号１０）を決定した。表８に示す各品種について決定された塩基配列について、Ｂ１領域の１０箇所のＳＮＰ、すなわち、配列番号１０の１７８、２０４、２２７、２３４、３７０、４２６、４３９、５４７、５６２、６２４番目の位置に対応するＳＮＰを評価した。識別対象品種の１４種のホップは、Ｂ１領域における１０箇所のＳＮＰについて、タイプａ～タイプｇの７通りの組み合わせを示した。その結果を図２に示した。
　そして、識別対象品種として選んだ１４品種のホップについて、Ｃ１領域の塩基配列を決定した。各品種におけるＣ１領域の塩基配列を表す配列番号を以下の表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　これらの塩基配列についてアラインメントを行い、Ｃ１領域のコンセンサス配列（配列番号１１）を決定した。表９に示す各品種について決定された塩基配列について、Ｃ１領域の２９箇所のＳＮＰ（このうち６箇所は挿入欠失部分）、すなわち、配列番号１１の３、１３、１７、８７、８８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、２５４、３３１、３５６、３７５、３８０、３９６、３９８、３９９、４２１、４６０、４７４、４７５、４７６、４７７、４８０、４８１、５００、５４７番目（１２９～１３４番目がｉｎｄｅｌ部分）の位置に対応するＳＮＰを評価した。識別対象品種の１４種のホップは、Ｃ１領域における２９箇所のＳＮＰ又はｉｎｄｅｌ部分について、タイプｉ～タイプｉｉｉの３通りの組み合わせを示した。その結果を図３に示した。
　Ａ１領域の２４箇所のＳＮＰ、Ｂ１領域の１０箇所のＳＮＰ、Ｃ１領域の２９箇所のＳＮＰ又はｉｎｄｅｌ部分の解析を経て、１４品種のうち、Perle及びNorthern Brewerを除く１２品種までを異なるタイプに分類することができた（図５）。
　Perle及びNorthern Brewerを識別するために、さらにＡ１－２領域の塩基配列を解析した。Perle由来のＤＮＡ試料におけるＡ１－２―Ｌ領域及びＡ１－２－Ｒ領域の塩基配列はそれぞれ配列番号５８及び配列番号６０に、Northern Brewer由来のＤＮＡ試料におけるＡ１－２―Ｌ領域とＡ１－２－Ｒ領域の塩基配列はそれぞれ配列番号５９及び配列番号６１に示す通りであった。これらの配列についてアラインメントを行い、Ａ１－２－Ｌ及びＡ１－２－Ｒ領域のコンセンサス配列（それぞれ配列番号１２及び１４）を決定した。Perle及びNorthern Brewerについて決定された塩基配列について、配列番号１２及び１４について図４で特定される位置に対応するＳＮＰを評価した。その結果、図４に示すように、複数箇所でＳＮＰの相違が観察された。
　よって、Ａ１領域、Ｂ１領域、Ｃ１領域のＳＮＰに加えて、Ａ１－２－Ｌ領域とＡ１－２－Ｒ領域の少なくとも１つのＳＮＰを組み合わせることにより、表４に示す１４品種すべての識別が可能な識別マーカーを作製することができた（図５）。
　さらに、Sladeck、Spaltar、Perle、Tettnang、Northern Brewerの５品種について、Ａ１－２－Ｌ領域およびＡ１－２－Ｒ領域の識別マーカーの決定を行った。
　上記５品種のホップについて、Ａ１－２－Ｌ領域の塩基配列を決定した。各品種におけるＡ１－２－Ｌ領域の塩基配列を表す配列番号を以下の表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　これらの塩基配列についてアラインメントを行い、Ａ１－２－Ｌ領域のコンセンサス配列（配列番号１３）を決定した。表１０に示す各品種について決定された塩基配列について、Ａ１－２－Ｌ領域の２３箇所のＳＮＰ（このうち１１箇所は挿入欠失部分）、すなわち、配列番号１３の２、１２、３１、９８、１１５、１２１、１６１、１６５、１６８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、３８９、３９５、３９６、４５６、４９９番目（１２、１８３～１９１、及び３９６番目はｉｎｄｅｌ部分）の位置に対応するＳＮＰを評価した。識別対象品種の５種のホップは、Ａ１－２－Ｌ領域における２３箇所のＳＮＰ又はｉｎｄｅｌ部分について、タイプ（１）～タイプ（５）の５通りの組み合わせを示した。その結果を図６に示した。
　Ａ１－２－Ｌ領域のＳＮＰ又はｉｎｄｅｌ部分の組み合わせにより、表１０に示す５品種の識別が可能な識別マーカーを作製することができた。
　また、上記５品種のホップについて、Ａ１－２－Ｒ領域の塩基配列を決定した。各品種におけるＡ１－２－Ｒ領域の塩基配列を表す配列番号を以下の表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　これらの塩基配列についてアラインメントを行い、Ａ１－２－Ｒ領域のコンセンサス配列（配列番号１５）を決定した。表１１に示す各品種について決定された塩基配列について、Ａ１－２－Ｒ領域の２８箇所のＳＮＰ（このうち１箇所は挿入欠失部分）、すなわち、配列番号１５の２、６、１２、１３、１８、２０、２２、２４、２６、３６、５２、８７、８８、１２５、１３９、１４０、１６０、１６２、１６７、１８８、２２３、２４９、２７３、２８４、３２６、３３９、４２１、４３７番目（４３７番目のｉｎｄｅｌ部分）の位置に対応するＳＮＰを評価した。識別対象品種の５種のホップは、Ａ１－２－Ｒ領域における２８箇所のＳＮＰ又はｉｎｄｅｌ部分について、タイプ（ａ）～タイプ（ｄ）の４通りの組み合わせを示した。その結果を図６に示した。
　Ａ１－２－Ｒ領域のＳＮＰ又はｉｎｄｅｌ部分の組み合わせにより、表１０に示す５品種のうち４品種（３品種と、２品種からなる１グループ）の識別が可能な識別マーカーを作製することができた。
　実施例２：ＤＮＡ試料の調製方法の比較
　実施例１（ｆ）の（２）のＤＮＡ抽出において、ＤＮＡ試料をホップペレットから抽出した場合とホップ乾燥毬花から抽出した場合とで結果を比較した。
　その結果、ホップペレットを出発材料とした場合、ホップ乾燥毬花を出発材料とした場合のいずれのＤＮＡ試料でも、ＤＮＡ抽出及びシークエンスが可能であることを確認した。また、得られるＤＮＡ解析結果も同じであることを確認した。
　よって、ホップ乾燥毬花を用いる場合でもペレットと同様にＤＮＡ解析が可能であり、加工工程での検査（ペレット加工工程でのコンタミ検証など）が技術的に可能であることを確認した。
　実施例３：クローン間での比較
　Saazクローン３種（Osvald’s clone 31, 72, 114）の乾燥毬花を約１ｇ、液体窒素存在下で乳鉢中で磨砕し、その約５０ｍｇから実施例１（ｆ）の（２）と同様にＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ試料について、実施例１（ｆ）の（３）～（７）と同様に、Ａ１、Ｂ１、及びＣ１領域のＤＮＡ断片を増幅し、増幅したＤＮＡ断片の配列決定を行った。クローン３品種の塩基配列について、各領域ごとにアライメントを行い、比較した。
　その結果、Saazクローン３種間で解析した領域の塩基配列に差異がないことが確認された。すなわち、上記の品種識別領域を利用する解析では、いずれのクローンが用いられたとしても、Saazとして識別されることが明らかとなった。この結果から、Ａ１、Ｂ１、及びＣ１領域を品種識別領域として利用する解析では、クローン別判定の必要がないことが確認された。
　実施例４：他品種混入のモデル実験
　SaazとPremiant混合試料の分析（Ａ１領域）を実施した。それぞれのペレットを実施例１にしたがって粉砕した後、表１２のような重量比率で混合したサンプルを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　サンプル（１）～（５）それぞれを用いて、実施例１と同様の操作によりＤＮＡ抽出、ＰＣＲによるＡ１領域の増幅、シークエンス、データ解析を実施した。その結果、図８に示すように両者の混合比率がエレクトロフェログラム（波形）にどのように反映されているかを調べることで、混入割合のおおよその検出下限を５％と求めることができた。例えば、配列番号９の１９９番目の塩基に対応するＳＮＰ箇所では、SaazがＴであるのに対して、PremiantがＣであり、それぞれの品種の混合割合に応じて、それぞれの塩基のピークの形状（高さ）が変化していることがわかる。すなわち、Saazが100％の場合のエレクトロフェログラムでは、Ｔ以外の波形が認められないのに対し、Premiantが混合されている場合には、Ｔの波形にＣの波形が重なって認められる。そしてPremiantが５％混合された場合のエレクトロフェログラムでは、混合されていない場合と比較して、Ｃの波形がわずかではあるが認められている。
実施例５：アメリカ品種の識別
　Ａ１、Ｂ１、Ｃ１及びＡ１－２の各領域（及び含まれるＳＮＰ）の解析が、アメリカ品種の識別にも適用可能か検討を行った。
Ａ．方法
１．供試品種
　識別対象品種として、表１３に記したアメリカホップ８品種（Cascade、Zeus、Summit、Galena、Super Galena、Nugget、Columbus、Tomahawk）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
２．ＤＮＡ抽出
　実施例１の「ｂ．ホップ乾燥毬花からの抽出」の欄に記載した方法に準じて各乾燥毬花約１ｇを液体窒素存在下で乳鉢中で磨砕し、その１０～５０ｍｇからＤＮＡ試料を調製した。
３．ＰＣＲおよび増幅の確認、増幅産物の精製
　Ａ１領域、Ｂ１領域、Ｃ１領域、Ａ１－２領域の各プライマーを用いて、実施例（３）ＰＣＲ～（５）ＰＣＲ産物の精製の欄に記載の手順に従ってＰＣＲを実施し、増幅の確認後、増幅産物の精製を行った。
４．ＤＮＡシークエンス
　ＰＣＲ産物精製品と各プライマー（プライマーペアーのうち、シークエンスしたい側の１本鎖を指定するプライマー）と純水を混合して１４μＬとし、オペロンバイオテクノロジー社にシークエンシングを委託しシークエンス結果（生データ、エレクトロフェログラム、エレクトロフェログラムからＰＣで処理されたシークエンスデータ）を得た。
５．シークエンス結果の解析
　上記４で得られた５’側（プライマーＬ）と３’側（プライマーＲ）からのデータを照合して正確な塩基配列を決定した。
Ｂ．結果
　結果を以下に記す。
１．Ａ１領域のマーカーを用いた検討
　いずれの品種についてもＡ１領域用プライマーによるＰＣＲ増幅が可能であり、シークエンスを行った結果、８品種を計４タイプに分類できた（表１４）。
　尚、各品種におけるＡ１領域の塩基配列を表す配列番号を以下の表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
２．Ｂ１領域のマーカーを用いた検討
　いずれの品種についてもＢ１領域用プライマーによるＰＣＲ増幅が可能であり、シークエンスを行った結果、８品種を計４タイプに分類できた（表１６）。
　尚、各品種におけるＢ１領域の塩基配列を表す配列番号を以下の表１７に示す。Galenaは配列が２通りあり、その相違（塩基番号２４５～２４８）に基づき識別能力を持たせることもできる。
　アメリカ品種を含めた識別の際のＢ１領域のコンセンサス配列（A,G,C,Tで表示）およびSNP箇所（Nで表示）を配列番号１０５として配列表に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
３．Ｃ１領域のマーカーを用いた検討
　いずれの品種についてもＣ１領域用プライマーによるＰＣＲ増幅が可能であり、シークエンスを行った結果、８品種を計３タイプに分類できた（表１８）。
　尚、各品種におけるＣ１領域の塩基配列を表す配列番号を以下の表１９に示す。CascadeおよびSuper Galenaは配列が２通りあり、その相違に基づき識別能力を持たせることもできる。
　アメリカ品種を含めた識別の際のＣ１領域のコンセンサス配列（A,G,C,Tで表示）およびSNP箇所（Nで表示）を配列番号１０６として配列表に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　３領域の解析結果を総合すると、いずれの品種についてもプライマーによるＰＣＲ増幅が可能であり、シークエンスを行った結果、８品種のうち６品種から得られたＤＮＡ型は互いに異なり、またいずれも欧州品種にないタイプであったので、これらの品種間での識別が可能であった。しかし、ZeusとSummitの２品種については、チェコのPremiantと同じCタイプのDNA型を示した（表１４、１６、１８）。
４．Ａ１－２領域のマーカーを用いた解析
　Ａ１、Ｂ１、Ｃ１領域解析でチェコのPremiantと同じDNAタイプCとなったZeusとSummitに対し、Ａ１－２－Ｒ領域の解析を行った結果、３者間でindelやSSR、SNPsの存在が認められた。特にindelとSSRについて顕著に異なっていた（表２０）。表２０は配列番号１４の塩基番号に基づいており、上からそれぞれPremiant、Zeus、Summitの順に配列を記載し、それらの下にPerleとNorthern Brewerの識別の際のコンセンサス配列（A,G,C,Tで表示）およびSNP箇所（Nで表示）を記載した。アメリカ品種の識別の際のＡ１－２領域のコンセンサス配列（A,G,C,Tで表示）およびSNP箇所（Nで表示）を配列番号１０７して配列表に記載した。
　表２０より明らかなように、塩基番号６４－８５の２２塩基挿入がPremiantとSummitには認められたのに対し、Zeusには認められなかった。しかも、更に詳細に観察すると、上記２２塩基の挿入配列の中にもPremiantとSummitの間で３箇所（塩基番号６４番目、６７番目、７５番目）のＳＮＰが認められた。この領域で３品種間に違いが認められたが、更に顕著な違いとして、この挿入配列に続いて塩基番号１４１にまで達する、（ＣＡ）もしくは（ＴＡ）の繰り返し配列において、Summitだけが他の２品種に比べて１２塩基長い構造になっていた。以上の結果を合わせ、これら３品種の間での識別が可能となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
５．まとめ
　以上の結果を総合すると、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１及びＡ１－２の各領域の解析の結果、アメリカ産のホップ８品種の識別が可能であった。これらにチェコ３品種、ドイツ１１品種を加えた全２２品種の識別が可能になった（表２１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　配列番号１：　プライマーＡ１－３Ｌ
　配列番号２：　プライマーＡ１－３Ｒ
　配列番号３：　プライマーＢ１－１Ｌ
　配列番号４：　プライマーＢ１－１Ｒ
　配列番号５：　プライマーＣ１－１Ｌ
　配列番号６：　プライマーＣ１－１Ｒ
　配列番号７：　プライマーＡ１－２－１Ｌ
　配列番号８：　プライマーＡ１－２－１Ｒ

Claims (20)

  1. 　ホップ品種の識別方法であって、以下の工程：
    （ｉ）被検体のホップ由来のＤＮＡについて、品種識別領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程であって、当該品種識別領域はホップ品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成される識別マーカーを含む、前記工程；
    （ｉｉ）上記工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について、一塩基多型の遺伝子型を同定する工程；
    （ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）で同定された被検体のホップのＤＮＡについての品種識別領域中の一塩基多型の遺伝子型と、既知のホップ品種のＤＮＡについての対応する領域中の一塩基多型の遺伝子型を比較し、当該領域の中の一塩基多型の遺伝子型について被検体のホップと既知のホップ品種の間での一致又は不一致を解析する工程；
    （ｉｖ）上記工程（ｉｉｉ）の解析結果に基づいて被検体のホップの品種を特定する工程；
    を含む、前記方法。
  2. 　工程（ｉｉ）が、工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について品種識別領域の塩基配列を同定することにより行われ、そして
    　工程（ｉｉｉ）が、工程（ｉｉ）で同定された被検体のホップのＤＮＡについての品種識別領域の塩基配列と、既知のホップ品種のＤＮＡについての対応する領域の塩基配列を比較し、当該領域の中の識別マーカーについて被検体のホップと既知のホップ品種の間での一致又は不一致を解析することにより行われる、
    請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（ｉｉ）が、工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について、ホップ品種間で相違する一塩基多型を検出するプローブ及び／又はプライマーと接触させることにより、一塩基多型の遺伝子型を同定する工程である、請求項１に記載の方法。
  4. 　品種識別領域が、以下の工程：
    （ａ）２以上の異なる品種のホップを用いて、トランスクリプトーム解析を行う工程；
    （ｂ）上記工程（ａ）の結果得られたＤＮＡ断片の塩基配列を元に、品種ごとにアセンブルする工程；
    （ｃ）上記工程（ｂ）の結果得られたコンティグ及び／又はシングレットを品種間で比較して、品種間で相違する一塩基多型（ＳＮＰ）の探索を行う工程；
    （ｄ）上記工程（ｃ）のＳＮＰ探索の結果、ＳＮＰが含まれる領域を選択し、該領域を増幅するためのプライマーを設計する工程；
    （ｅ）上記工程（ｄ）で設計したプライマーを用いて、ホップから抽出したＤＮＡを鋳型として上記工程（ｄ）で選択した領域が増幅しうることを確認し、その塩基配列を決定することにより、識別領域とそれを増幅しうるプライマーを決定する工程；
    （ｆ）上記工程（ｅ）で決定したプライマーを用いて、識別対象品種のホップから抽出したＤＮＡを鋳型として識別領域を増幅し、識別領域の塩基配列を決定する工程；及び
    （ｇ）上記工程（ｆ）で決定した識別領域の塩基配列を品種間で比較して、識別対象品種を識別するために必要なＳＮＰの組み合わせで構成される識別マーカーを決定する工程；
    を含む方法により作製された識別マーカーを含む領域である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　品種識別領域が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される１以上の塩基配列の一部又は全部であって、図１、図２、図３、図４及び図６で特定されている一塩基多型又は挿入欠失部分の少なくとも一つを含む領域である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　品種識別領域が、配列番号９で表される塩基配列を含む領域、配列番号１０で表される塩基配列を含む領域、配列番号１１で表される塩基配列を含む領域、配列番号１２で表される塩基配列を含む領域、配列番号１３で表される塩基配列を含む領域、配列番号１４で表される塩基配列を含む領域、及び配列番号１５で表される塩基配列を含む領域からなる群より選択される１以上の領域である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　品種識別領域が、以下：
    配列番号９で表される塩基配列を含む領域、配列番号１０で表される塩基配列を含む領域、及び配列番号１１で表される塩基配列を含む領域；の３種の領域に加えて、以下：
    配列番号１２及び／又は配列番号１４で表される塩基配列の一部又は全部であって、図４で特定されている一塩基多型又は挿入欠失部分の少なくとも一つを含む領域；
    である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　工程（ｉ）が、配列番号１及び配列番号２の組み合わせ、配列番号３及び配列番号４の組み合わせ、配列番号５及び配列番号６の組み合わせ、及び配列番号７及び配列番号８の組み合わせからなる群より選択されるプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　工程（ｉ）が、以下：
    配列番号１及び配列番号２の組み合わせ、配列番号３及び配列番号４の組み合わせ、並びに、配列番号５及び配列番号６の組み合わせ；の３種のプライマーセットに加えて、配列番号７及び配列番号８の組み合わせ、のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　ホップ品種間で相違する一塩基多型の組み合わせで構成される識別マーカーの作製方法であって、以下の工程：
    （ａ）２以上の異なる品種のホップを用いて、トランスクリプトーム解析を行う工程；
    （ｂ）上記工程（ａ）の結果得られたＤＮＡ断片の塩基配列を元に、品種ごとにアセンブルする工程；
    （ｃ）上記工程（ｂ）の結果得られたコンティグ及び／又はシングレットを品種間で比較して、品種間で相違する一塩基多型（ＳＮＰ）の探索を行う工程；
    （ｄ）上記工程（ｃ）のＳＮＰ探索の結果、ＳＮＰが含まれる領域を選択し、該領域を増幅するためのプライマーを設計する工程；
    （ｅ）上記工程（ｄ）で設計したプライマーを用いて、ホップから抽出したＤＮＡを鋳型として上記工程（ｄ）で選択した領域が増幅しうることを確認し、その塩基配列を決定することにより、識別領域とそれを増幅しうるプライマーを決定する工程；
    （ｆ）上記工程（ｅ）で決定したプライマーを用いて、識別対象品種のホップから抽出したＤＮＡを鋳型として識別領域を増幅し、識別領域の塩基配列を決定する工程；及び
    （ｇ）上記工程（ｆ）で決定した識別領域の塩基配列を品種間で比較して、識別対象品種を識別するために必要なＳＮＰの組み合わせで構成される識別マーカーを決定する工程；
    を含む、前記方法。
  11. 　請求項１０に記載の方法によって作製された識別マーカーの少なくとも一部を含む核酸。
  12. 　核酸であって、当該核酸はホップの品種識別領域を含み、そして、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される１以上の塩基配列の一部又は全部であって、図１、図２、図３、図４、及び図６で特定されている一塩基多型又は挿入欠失部分の少なくとも一つを含む、前記核酸。
  13. 　請求項１１又は１２に記載の核酸を増幅し得るように設計されたプライマー。
  14. 　プライマーであって、配列番号１～８のいずれかに記載された塩基配列からなり、ここで当該プライマーはホップの品種識別のために用いられる、前記プライマー。
  15. 　請求項１０に記載の方法により同定された品種識別領域中の、ホップ品種間で相違する一塩基多型を検出するためのプローブ。
  16. 　プローブであって、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される１以上の塩基配列において、図１、図２、図３、図４又は図６で特定される位置における少なくとも一つの一塩基多型又は挿入欠失部位を検出することができ、そしてそれによりホップ品種間で相違する一塩基多型を検出する、前記プローブ。
  17. 　ホップ試料における異品種の混入を検出する方法であって、以下の工程：
    （ｉ）被検体のホップ試料から抽出したＤＮＡについて、品種識別領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程であって、当該品種識別領域はホップ品種間で相違する少なくとも一つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成される識別マーカーを含む、前記工程；
    （ｉｉ）上記工程（ｉ）で増幅したＤＮＡ断片について品種識別領域の塩基配列を解析し、シークエンスデータを得る工程；
    （ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータについて、識別マーカーを構成する一塩基多型部位の情報を、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と比較する工程；及び 
    （ｉｖ）ホップ試料における異品種の混入の有無を決定する工程、ここで、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致する場合は、異品種の混入はないと判断し、あるいは、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、異品種の混入があると判断する；
    を含む、前記方法。
  18. 　工程（ｉｖ）に引き続いて以下の工程：
    （ｖ）上記工程（ｉｖ）で、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位に出現している正常品以外に由来する情報から、その塩基を特定する工程；及び
    （ｖｉ）上記工程（ｖ）で特定された一塩基多型部位の正常品とは異なる塩基を、識別マーカーと照合し、混入品種を推定又は特定する工程；
    をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 　工程（ｉｖ）に引き続いて以下の工程：
    （ｖ）上記工程（ｉｖ）で、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位の情報が、正常品の対応する一塩基多型部位の情報と一致しない場合は、上記工程（ｉｉ）で得られたシークエンスデータの一塩基多型部位に出現している正常品以外に由来する情報から、その塩基を特定し、混入割合を求める工程；及び
    （ｖｉ）上記工程（ｖ）で特定された一塩基多型部位の正常品とは異なる塩基を、識別マーカーと照合し、混入品種とその混入割合を推定又は特定する工程；
    をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 　工程（ｉｉｉ）において、１９～２５塩基の挿入配列の有無の解析を含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022168195A1 (ja) 2021-02-03 2022-08-11 国立大学法人東北大学 遺伝情報解析システム、及び遺伝情報解析方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997005281A1 (fr) 1995-07-28 1997-02-13 Sapporo Breweries Ltd. Methode de differentiation genetique des varietes du houblon
JPH11103895A (ja) 1997-10-03 1999-04-20 Kirin Brewery Co Ltd ホップ品種の識別方法
JP2006034142A (ja) 2004-07-23 2006-02-09 Asahi Breweries Ltd マイクロサテライトｄｎａを用いたホップ品種鑑定法
JP2007330230A (ja) * 2006-06-19 2007-12-27 National Agriculture & Food Research Organization 醸造酒中の原料植物の判別方法
WO2008035702A1 (fr) * 2006-09-20 2008-03-27 Sapporo Breweries Limited Procédé pour la sélection d'une souche de houblon, marqueur d'exsudat pour une utilisation dans la sélection d'une souche de houblon et ensemble d'amorces
WO2008053834A1 (fr) * 2006-10-30 2008-05-08 Sapporo Breweries Limited Procédé de sélection d'une lignée de houblon et ensemble amorce et marqueur de sélection utilisé pour sélectionner la lignée de houblon
JP2009100653A (ja) * 2007-10-19 2009-05-14 Tohoku Techno Arch Co Ltd 一塩基多型（ｓｎｐ）を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドから成るイネ品種判別用ｓｎｐマーカー、及び、該ｓｎｐ分析によるイネの品種判別方法
JP2011188846A (ja) * 2010-02-17 2011-09-29 Takii Shubyo Kk 遺伝的多型マーカーセット、プローブセット、検出キットおよび品種判定方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2444493A4 (en) * 2009-06-19 2013-02-20 Kirin Holdings Kk PROTEIN OF NOVEL PRENYLATIONENZYM ACTIVITY AND THIS CODING GEN

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997005281A1 (fr) 1995-07-28 1997-02-13 Sapporo Breweries Ltd. Methode de differentiation genetique des varietes du houblon
JPH11103895A (ja) 1997-10-03 1999-04-20 Kirin Brewery Co Ltd ホップ品種の識別方法
JP2006034142A (ja) 2004-07-23 2006-02-09 Asahi Breweries Ltd マイクロサテライトｄｎａを用いたホップ品種鑑定法
JP2007330230A (ja) * 2006-06-19 2007-12-27 National Agriculture & Food Research Organization 醸造酒中の原料植物の判別方法
WO2008035702A1 (fr) * 2006-09-20 2008-03-27 Sapporo Breweries Limited Procédé pour la sélection d'une souche de houblon, marqueur d'exsudat pour une utilisation dans la sélection d'une souche de houblon et ensemble d'amorces
WO2008053834A1 (fr) * 2006-10-30 2008-05-08 Sapporo Breweries Limited Procédé de sélection d'une lignée de houblon et ensemble amorce et marqueur de sélection utilisé pour sélectionner la lignée de houblon
JP2009100653A (ja) * 2007-10-19 2009-05-14 Tohoku Techno Arch Co Ltd 一塩基多型（ｓｎｐ）を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドから成るイネ品種判別用ｓｎｐマーカー、及び、該ｓｎｐ分析によるイネの品種判別方法
JP2011188846A (ja) * 2010-02-17 2011-09-29 Takii Shubyo Kk 遺伝的多型マーカーセット、プローブセット、検出キットおよび品種判定方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CASTRO C.B. ET AL.: "DNA sequence and expression variation of hop (Humulus lupulus) valerophenone synthase (VPS), a key gene in bitter acid biosynthesis.", ANN. BOT., vol. 102, no. 2, 2008, pages 265 - 273, XP055176862 *
CYCLE SEQUENCING OF SINGLE- AND DOUBLE-STRANDED DNA, pages 22
CYCLE SEQUENCING ON THE GENEAMP PCR SYSTEM 9700, 9600, 2700, OR 2400, pages 25
JAVORNIK B. ET AL.: "Hop EST resources for marker development.", ACTA HORT., vol. 848, 2009, pages 65 - 71, XP008175503 *
PATZAK J.: "Gene specific molecular markers for hop (Humulus lupulus L.).", ACTA HORT., vol. 848, 2009, pages 73 - 80, XP008175528 *
SPIN COLUMN (SPIN PLATE) PURIFICATION, pages 38 - 40

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