KR101224025B1 - 아주까리에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머, 키트, 및 이들의 용도 - Google Patents

아주까리에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머, 키트, 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아주까리에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 56로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 아주까리의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 아주까리의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 아주까리의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 아주까리의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

아주까리에서 유래된 ＳＳＲ 프라이머, 키트, 및 이들의 용도 {SSR primer and kits derived from castor bean and use of there}
본 발명은 아주까리(castor bean; Ricinus communis L.)에서 분리한 SSR 프라이머, 키트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 56으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 아주까리의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류,동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 이용한 지문분석법 (fingerprinting)에는 RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs) 방법, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphic DNA) 방법, SSR (Simple Sequence Repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체 (microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.
벼에서는 벼 게놈에 반복되는 SSR을 PCR 기술로 증폭하여 벼 품종의 유전자형을 동정하는 초위성체 마커들이 개발되었다(대한민국 특허출원번호 제2001-34003호). 미국의 탕 (Tang) 박사팀은 879개의 SSR 마커들을 개발하여 해바라기의 유전자 지도를 발표한 바 있다 (Tang et al., Theor. Appl. Genet., 105: 1124-1136, 2002). 이외에도 보리, 콩 등에서 많은 SSR 마커들이 개발되었다. 그러나, 아주까리에서는 SSR 마커가 아직 국내에서 전혀 개발된 바 없으며, 외국에서도 이와 관련된 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다.
이에 본 발명자들은 아주까리의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 다양한 아주까리 재래종들에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 아주까리의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 56으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 아주까리의 DNA 다형성 검출 방법 및 아주까리의 품종 동정 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 아주까리의 DNA 다형성 검출용 키트 및 아주까리의 품종 동정용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 아주까리의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 아주까리의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 아주까리 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 아주까리의 품종 판별에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 아주까리의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 마커를 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 SSR은 초위성체(Microsatelite), 또는 Short Tandem Repeats (STRs)로 통용되기도 한다.
본 발명에서는 비오틴-스트렙타비딘 포획(biotin-streptavidin capture; Dixit et al., Mol. Eco. Note, 5: 736-738) 방법으로 아주까리로부터 SSR 마커를 개발하였다. 아주까리에서 분리된 SSR 마커는 본 발명에 의해 처음으로 제공되는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 SSR 마커는 다음과 같은 방법으로 개발되었다. 아주까리로부터 추출한 게놈 DNA를 제한효소로 처리해 DNA 단편을 제조한 후 AP11 및 AP12의 2개의 어댑터와 라이게이션 하였다.
라이게이션 산물을 비오틴이 표지된 SSR 탐침과 혼성화한 후 마그네틱 비드를 이용해 분리하였다. 이를 AP11 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후 서열을 분석함으로써 아주까리의 SSR을 포함하고 있는 420개의 DNA단편을 수득하였다.
상기에서 수득한 DNA단편을 분석함으로써 4개 이상의 반복 유닛을 포함하고 있는 단편만을 선발하고 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 SSR을 증폭 할 수 있는 양방향 프라이머 237쌍을 디자인하였다. 상기 프라이머쌍을 사용하여 다양한 아주까리 품종 및 야생근연종들의 PCR을 통한 DNA 프로파일링을 수행함으로써 다형성 변이를 많이 나타내는 28쌍의 SSR 프라이머쌍을 선발하였다.
본 발명에서 제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 56으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다. 바람직하게는 GB-RC-001(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-002(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-004(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-019(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-021(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-025(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-031(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-038(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-046(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-059(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-062(서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-070(서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-080(서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-088(서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-096(서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-098(서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-105(서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-107(서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-110(서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-133(서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-135(서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-169(서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-171(서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-174(서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-177(서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-2177(서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-225(서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍), 및 GB-RC-232(서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍)로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 및 이들에 의해 증폭되는 초위성체에 존재하는 반복 모티브 (repeat motif), 증폭되는 초위성체의 크기, TA(℃) 및 SSR이 존재하는 염색체 대립인자에 대한 정보를 하기 표 1에 기재하였다.
프라이머 쌍 반복 모티브 증폭산물의 크기(bp) TA℃ 대립인자 No.
GB-RC-001 (GCA)4, (GAA)7 271-283 55 2
GB-RC-002 (CT)18 255-267 54 5
GB-RC-004 (TC)8(AC)13 313-329 55 4
GB-RC-019 (CT)11 275-277 55 2
GB-RC-021 (CT)15 201-211 54 4
GB-RC-025 (AG)20 174-182 55 4
GB-RC-031 (CT)11 266-268 54 2
GB-RC-038 (CT)8 169-171 55 2
GB-RC-046 (CT)12 298-304 55 3
GB-RC-059 (GTT)9 272-290 55 3
GB-RC-062 (GAA)10 234-240 55 3
GB-RC-070 (CTT)5 246-249 55 2
GB-RC-080 (AG)15 207-213 55 3
GB-RC-088 (AAG)7 253-271 55 4
GB-RC-096 (TC)15 165-187 55 7
GB-RC-098 (CTT)11 277-305 55 6
GB-RC-105 (AC)10 194-206 55 5
GB-RC-107 (TTC)7 198-201 54 2
GB-RC-110 (GA)7 130-184 55 4
GB-RC-133 (CAG)5 277-303 54 2
GB-RC-135 (AG)11 300-308 54 2
GB-RC-169 (TA)7,(GA)12 172-176 54 3
GB-RC-171 (CT)12 246-260 54 4
GB-RC-174 (GTT)4,(GTT)4 236-248 55 2
GB-RC-177 (GA)15 178-188 55 3
GB-RC-217 (GAA)11 184-190 54 2
GB-RC-225 (TTC)4,(TTC)5 263-269 53 2
GB-RC-232 (CCTGAG)5 274-280 54 2
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 아주까리에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 아주까리의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 아주까리의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
구체적으로 아주까리의 DNA 다형성 검출 방법은 (a) 아주까리로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol . Biol . Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al ., Nuc . Res ., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 아주까리에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl (Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성 (denaturation); 결합 (annealing); 및 증폭 (extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장 (elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에서 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분 30초를 36 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔 (agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔 (polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치 (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
아울러, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 아주까리의 품종 및 재래종 동정 방법을 제공한다.
구체적으로 아주까리의 품종 및 재래종 동정 방법은
(a) 아주까리 및 대조군 아주까리 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계를 포함한다.
(a) 내지 (c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 아주까리 및 대조군 아주까리 품종에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대한 시료가 되는 아주까리와 대조군 아주까리 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 아주까리와 대조군 품종의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 아주까리는 대조군 아주까리 품종과 동일한 품종 및 재래종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 아주까리 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 아주까리가 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 아주까리보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 아주까리에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 아주까리 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 아주까리는 국내외 재래종 Ricinus communis L.에 해당된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 게놈 DNA 추출
재래종 아주까리(국립농업과학원 농업유전자원센터, 보존번호 : IT 104352)로부터 SDS를 이용한 방법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990)에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 이를 상세히 설명하면 다음과 같다. 생육 1개월째의 어린 아주까리 식물체로부터 0.5 g의 잎 조직을 채취하여 1.5 ml 튜브에 넣고 액체질소로 급냉시켰다. 이후, 즉시 플라스틱 막대로 잎을 곱게 마쇄하였다. 마쇄된 잎이 녹기 전에 추출 완충용액 (200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 750μl를 첨가하고, 혼합액을 65℃에서 30분간 보관하였다. 여기에 동량의 페놀 (phenol):클로로포름 (chloroform):이소아밀알코올 (isoamylalchol) (25:24:1) 용액을 추가로 첨가한 후, 약 15분간 교반하였다. 이를 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 새 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에 동량의 이소프로판올(-20℃)을 첨가하고, -20℃에서 1시간 보관하였다. 이후, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하였다. DNA를 건조시킨 후, 약 300μl의 RNase (50μg/ml)를 함유하는 TE 완충용액(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4)을 첨가하여 충분히 녹인 후, 37℃에서 1시간 동안 보관하였다.
< 실시예 2> 어댑터와의 라이게이션( ligation )
상기 실시예 1에서 얻은 게놈 DNA 500 ng을 각 제한효소 제조사의 지침에 따라 EcoRV, DraI, SmaI, PvuI, AluI, HaeIII 및 RsaI로 절단하였다. 절단된 DNA를 1.2% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 약 300-1500 bp 크기의 DNA 단편만을 겔로부터 일루션(elution)하여 수득하였다. 이후, 수득된 DNA 단편을 2개의 어댑터(adapter; AP-11 및 AP-12, 각 50 ng)와 T4 DNA 라이게이즈(ligase; Promega, 미국)를 이용하여 12℃에서 하룻밤 동안 라이게이션시켰다. 이 때 라이게이션 효율을 높이기 위해 5' 말단이 인산화된 AP-12 어댑터를 사용하였으며, 라이게이션시의 반응용액의 조성은 다음과 같다: 1X 라이게이션 버퍼 (Promega, 미국), 50 ng AP11 어댑터, 50 ng AP12 어댑터, 150 ng DNA 단편, 3 Unit T4 DNA 라이게이즈 (Promega, 미국). 표2에는 상기 어댑터로 사용된 폴리뉴클레오티드의 염기서열이 나타나 있다.
어댑터 명 염기서열 비고
AP-11 5'-CTCTTGCTTAGATCTGGACTA-3'
AP-12 5'-TAGTCCAGATCTAAGCAAGAG-3'
< 실시예 3> SSR을 포함하고 있는 DNA 단편의 선발 및 분리
<3-1> 마그네틱 비드 준비
마그네틱 비드 (magnetic bead; SA-PMPs, Promega, 미국; 1 mg/ml) 0.6 ml를 마그네틱 분리기(magnetic stand; Promega, 미국)로 수집한 후 용액을 제거하였다. 여기에 0.5x SSC (Saline-Sodium Citrate) 버퍼 0.6 ml를 넣어 세척을 하고 다시 마그네틱 분리기로 수집한 후 용액을 제거하였다. 0.5x SSC 버퍼를 이용한 세척은 3회 반복하여 실시하였다. 세척한 마그네틱 비드에 0.5x SSC 버퍼 100μl를 넣은 후 30분 이내에 사용하였다.
<3-2> 혼성화
상기 실시예 2에서 제조한 라이게이션 산물에 증류수를 넣어 500μl 가 되도록 한 후 65℃에서 10분간 변성(denature)시켰다. 여기에 바로 비오틴 (biotin)이 표지된 SSR 탐침 1.5μl(20 ng)와 20x SSC 버퍼 13μl를 넣고 상온에서 10분간 방치하여 결합을 유도하였다. 혼성화에 사용된 8개의 SSR 탐침은 하기 표 3에 기재하였으며, SSR 탐침은 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라 비오틴으로 표지하였다.
서열 비고
Biotin-(GA)20
Biotin-(CA)20
Biotin-(AT)20
Biotin-(GC)20
Biotin-(AGC)15
Biotin-(GGC)15
Biotin-(AAG)15
Biotin-(AGG)15
혼성화 반응을 통하여 게놈 DNA 단편 중 상기 반복염기서열을 가지고 있는 DNA 단편들은 비오틴이 표지된 SSR 탐침들과 상보적 결합을 할 것이고, 이를 SSR 탐침-템플릿 (template) 혼성체 (hybrid)라고 한다.
<3-3> 템플릿의 분리
<3-1>에서 제조한 마그네틱 비드 용액을 <3-2>에서의 SSR 탐침-템플릿 혼성체 용액에 넣고 상온에서 10분간 방치시킨다. 반응용액에서 마그네틱 분리기로 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 수집하고 상등액을 제거하였다. 상기 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 0.1x SSC 300μl로 4회 세척한 후 증류수 50μl를 넣고 90℃에서 5분간 가열하여 하기 템플릿을 분리하였다.
<3-4> PCR 반응
<3-3>에서 분리한 템플릿에 대해 AP-11 어댑터를 프라이머로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 혼합물(20μl)의 조성은 다음과 같다: 250 ng 어댑터-라이게이션된 DNA, 10 pmol AP11 프라이머, 2 mM dNTP, 2 units Taq DNA 중합효소, 5μl 10×완충용액. PCR 반응은 72℃에서 2분, 94℃에서 3분동안 가열한 후 94℃에서 30초; 56℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 24 싸이클 (cycle)로 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.
이와 같은 방법으로 본 발명에서는 SSR을 함유하고 있는 775개의 DNA 단편을 분리하였다.
< 실시예 4> 분리된 DNA 단편의 서열분석 및 프라이머 디자인
상기 실시예 3에서 분리된 SSR을 함유하고 있는 DNA 단편들을 pGEM T-easy vector 벡터 (Promega, 미국)에 클로닝하여 이들의 서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 (주)솔젠트에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 서열을 기초로 하여 4개 이상의 반복 유닛 (repeat unit)을 포함하고 있는 단편만을 선발하였다. 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 하여 SSR을 증폭할 수 있는 양 방향의 프라이머를 디자인하였다. 총 237쌍의 프라이머쌍을 디자인하였으며 대량 DNA profiling 검정을 위하여 각각의 정방향프라이머 5'끝에 M13 (TGTAAAACGACGGCCAGT) 염기서열을 붙였다.(결과미도시).
< 실시예 5> SSR 마커의 선발
상기 실시예 4에서 디자인된 프라이머쌍 중에서 다양한 아주까리 계통에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머 조합을 선발하기 위하여, 72점의 재래종 아주까리에 대하여 DNA 프로파일링 (profiling) 분석을 수행하였다. 표 4에는 SSR 분석에 사용된 아주까리에 대한 정보가 나타나 있다.
일련
번호 		IT
번호		 보존기관 원산지 일련
번호		 IT
번호		 보존기관 원산지
1 032167 농진청,농업유전자원센터 대한민국 37 113253 농진청,농업유전자원센터 대한민국
2 032174 농진청,농업유전자원센터 대한민국 38 113277 농진청,농업유전자원센터 대한민국
3 032182 농진청,농업유전자원센터 대한민국 39 113302 농진청,농업유전자원센터 대한민국
4 032185 농진청,농업유전자원센터 대만 40 113312 농진청,농업유전자원센터 대한민국
5 102864 농진청,농업유전자원센터 대한민국 41 113317 농진청,농업유전자원센터 대한민국
6 102967 농진청,농업유전자원센터 대한민국 42 113409 농진청,농업유전자원센터 대한민국
7 102993 농진청,농업유전자원센터 대한민국 43 119982 농진청,농업유전자원센터 대한민국
8 103109 농진청,농업유전자원센터 대한민국 44 162745 농진청,농업유전자원센터 대한민국
9 103271 농진청,농업유전자원센터 대한민국 45 162783 농진청,농업유전자원센터 대한민국
10 103318 농진청,농업유전자원센터 대한민국 46 162812 농진청,농업유전자원센터 대한민국
11 103676 농진청,농업유전자원센터 대한민국 47 162815 농진청,농업유전자원센터 대한민국
12 103858 농진청,농업유전자원센터 대한민국 48 162858 농진청,농업유전자원센터 대한민국
13 104089 농진청,농업유전자원센터 대한민국 49 175846 농진청,농업유전자원센터 대한민국
14 104178 농진청,농업유전자원센터 대한민국 50 175852 농진청,농업유전자원센터 대한민국
15 104259 농진청,농업유전자원센터 대한민국 51 178563 농진청,농업유전자원센터 대한민국
16 104573 농진청,농업유전자원센터 대한민국 52 180647 농진청,농업유전자원센터 대한민국
17 104637 농진청,농업유전자원센터 대한민국 53 180982 농진청,농업유전자원센터 대한민국
18 104706 농진청,농업유전자원센터 대한민국 54 183759 농진청,농업유전자원센터 이스라엘
19 104784 농진청,농업유전자원센터 대한민국 55 185823 농진청,농업유전자원센터 대한민국
20 104993 농진청,농업유전자원센터 대한민국 56 185824 농진청,농업유전자원센터 대한민국
21 105314 농진청,농업유전자원센터 대한민국 57 185825 농진청,농업유전자원센터 대한민국
22 105491 농진청,농업유전자원센터 대한민국 58 185827 농진청,농업유전자원센터 대한민국
23 105507 농진청,농업유전자원센터 대한민국 59 185828 농진청,농업유전자원센터 대한민국
24 105549 농진청,농업유전자원센터 대한민국 60 191079 농진청,농업유전자원센터 대만
25 105630 농진청,농업유전자원센터 대한민국 61 195066 농진청,농업유전자원센터 대한민국
26 105688 농진청,농업유전자원센터 대한민국 62 196834 농진청,농업유전자원센터 대한민국
27 108738 농진청,농업유전자원센터 대한민국 63 196881 농진청,농업유전자원센터 대한민국
28 108782 농진청,농업유전자원센터 대한민국 64 196882 농진청,농업유전자원센터 대한민국
29 108841 농진청,농업유전자원센터 대한민국 65 196882 농진청,농업유전자원센터 대한민국
30 108944 농진청,농업유전자원센터 대한민국 66 201754 농진청,농업유전자원센터 러시아
31 108987 농진청,농업유전자원센터 대한민국 67 204076 농진청,농업유전자원센터 대한민국
32 109160 농진청,농업유전자원센터 대한민국 68 207374 농진청,농업유전자원센터 대한민국
33 112947 농진청,농업유전자원센터 대한민국 69 207383 농진청,농업유전자원센터 대한민국
34 112997 농진청,농업유전자원센터 대한민국 70 208002 농진청,농업유전자원센터 대한민국
35 113194 농진청,농업유전자원센터 대한민국 71 208003 농진청,농업유전자원센터 대한민국
36 113223 농진청,농업유전자원센터 대한민국 72 212727 농진청,농업유전자원센터 대한민국
각각의 PCR 반응 혼합물 (20μl)의 조성은 다음과 같다: 실시예 1의 방법에 의해 분리한 아주까리 주형 DNA 40 ng, 정방향 프라이머 0.2 μM, 역방향 프라이머 0.6 μM, 형광물질이 표지된 M13 프라이머(TGTAAAACGACGGCCAGT) 0.6 μM, 1X PCR 반응액 (10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 unit DNA 중합효소. PCR 반응은 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 각 프라이머의 TA(표 1 참조)에 해당하는 온도에서 30초; 및 72℃ 에서 45초의 조건으로 35회 반복한 후, 다시 94℃에서 30초; 53℃에서 45초; 및 72℃에서 45초의 조건으로 15회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 15분의 조건으로 수행하였다.
각기 다른 형광물질로 증폭된 PCR 산물 단편의 크기를 분석하기 위해 자동 염기서열 분석 장치 (ABI 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였다. 분석을 위하여, PCR 산물 1.5 , Hi-di 포름아마이드 (formamide) 9.2μl, 내부 크기 표준시약 (Internal Size Standard; Genescan-500 ROX) 0.3μl를 혼합한 후 94℃에서 3분간 변성하여 분석에 사용하였다.
그 결과, 국내 및 국외에서 수집된 아주까리 재래종들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머쌍 28쌍을 확인하여 GB-RC-001(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-002(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-004(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-019(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-021(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-025(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-031(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-038(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-046(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-059(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-062(서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-070(서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-080(서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-088(서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-096(서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-098(서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-105(서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-107(서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-110(서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-133(서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-135(서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-169(서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-171(서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-174(서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-177(서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-2177(서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍), GB-RC-225(서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-RC-232(서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍)을 선별하였다 (표 1 참조). 상기 28쌍의 프라이머에 의해 증폭된 PCR 단편의 각각의 크기는 다음 표 5 내지 표 8과 같다.
일련번호 GB - RC -001 GB-RC-002 GB-RC-004 GB-RC-019 GB-RC-021 GB-RC-025 GB-RC-031 GB-RC-038
1 283 257 315 277 203 180 266 169
2 283 257 315 277 203 180 266 169
3 283 257/259 315 277 203 174/180 266 169
4 271 257 321 275/277 203 180 266 171
5 283 257 315 277 203 174 - 171
6 283 257 315 277 203 174 266 169
7 283 257 315 277 203 174 266 171
8 283 265 315 275 203 180 266 171
9 283 257 315 277 201 180 266 171
10 283 257 315 277 201 180 266 169
11 283 257 315 277 201/203 174 266 169
12 283 267 315 277 203 180 266 169
13 271 257 315 277 201 180 266 169
14 283 257 315 277 203 174 266 171
15 283 257 315 277 201 180 266 169
16 283 265 315 277 201 174 266 169
17 271/283 - 315 277 201 182 266 169
18 283 257 315 277 201/203 174 266 169
19 283 257 315 277 203 180 266 171
20 283 257 315 277 201 180 266 171
21 283 265 315 277 203 174 266 171
22 283 257 315 275 201/203 180 266 169
23 283 257 315 277 203 180 266 171
24 271/283 257 315 277 203 174 266 169/171
25 283 257 315 277 203 174/180 266 171
26 283 257 315 277 203 174 266 171
27 283 257 315 277 201 174 266 169
28 283 257 315 277 203 174 266 169
29 283 265 315 277 201 180 266 171
30 283 265 315 275 203 174 266 169
31 283 265/265 315 275 201 174 266 169
32 271/283 257 315 275 203 174/180 266 171
33 283 257 315 277 201 174 266 169
34 283 257 315 277 203 180 266 169
35 283 257 315 277 201/203 174 266 171
36 283 257 315 277 201 174/180 266 171
37 283 257 329 277 201 174 266 169
38 283 257 315 277 201 174 266 169
39 283 257 315 277 201/203 174 266 169
40 283 257 315 277 201 174 266 169/171
41 283 257 315 277 201/203 174 266 169/171
42 283 257 315 277 203 174 266 169
43 283 257 315 277 201 174 266 169
44 283 257 315 277 201 174 266 169
45 283 257 315 277 203 174 266 169
46 283 257 315 277 203 174 266 169
47 283 257 315 277 201 180 266 171
48 271/283 257/265 315 275/277 201/203 180 266 169/171
49 271/283 257/265 315 275/277 201 174/180 266 169/171
50 283 257 315 277 201 180 266 171
51 283 257 315 277 201 174 266 169
52 283 257 315 275 201 180 266 171
53 283 265 315 277 203 174 266 171
54 271/283 257/265 315 275/277 201/203 180 266 169/171
55 271/283 257 313/315 275/277 201/203 174 266 169/171
56 283 257 315 275/277 203 174/180 266 171
57 283 257 315 275 203 180 266 171
58 283 265 315 277 203 180 266 169
59 283 257 315 277 201 180 266 169
60 271 255 321 275 211 180 266 171
61 283 265 315 277 201/203 174/180 266 169
62 283 257/265 315 277 201/203 174/180 266 169
63 283 257 315 277 201/203 174/180 266 169/171
64 283 257 315 277 203 180 266 169
65 271 257 321 275 201/207 176 268 171
66 271/283 257/265 315 275/277 201/203 180 266 169/171
67 283 257 315 277 203 174 266 169
68 283 257 315 277 203 180 266 171
69 283 257 315 275 203 180 266 169
70 271/283 257 321/329 275/277 201/207 174 266 169/171
71 283 257 315 277 201 180 266 169
72 283 257 315 275 201 174 266 169
일련번호 GB - RC -046 GB - RC -059 GB - RC -062 GB - RC -070 GB - RC -080 GB - RC -088 GB - RC -096 GB - RC -098
1 304 290 234 249 207 256 181 290
2 304 290 234 249 207 256 181 290
3 298/304 290 234/240 249 207 256 181 290
4 304 290 240 249 213 271 187 290
5 298 290 234 249 21 256 185 290
6 304 284 234 249 213 271 181 290
7 298/304 290 234 249 207 271 181 290
8 304 284 234 249 213 256 181 290
9 298 290 234 249 207 271 181 290
10 298 290 234 249 207 256 187 290
11 298/304 284 234 249 207 256/271 181 290
12 304 284 234 249 207 256 181 290
13 304 290 234 249 207 271 -/- -
14 304 290 234 249 207 271 181 290
15 298 284 234 249 207 256 187 290
16 304 290 234 249 207 271 183 290
17 298 290 234 249 207 271 181 290
18 298 290 234 249 207 256 185 290
19 304 284 234 249 213 256 187 290
20 298 290 234 249 207 256 181 290
21 298/304 290 234 249 207 256 165/181 290
22 304 284/290 237 249 207 256 181 290
23 298 290 234 249 207/213 271 181 290
24 304 290 234 249 211 256/271 181 290
25 298/304 284/290 234 249 211/213 256 181 290
26 298 290 234 249 207 256/271 185 290
27 304 284 234 249 213 256 - -
28 298/304 290 234 249 207 256 181 290
29 304 290 234 249 213 271 181 290
30 304 290 234 249 207 256 181 290/293
31 304 290 234 249 207 256 181 290
32 298/304 290 234 249 207/213 271 181 284/290
33 298 290 237 249 207 256 185 290
34 298 290 234 249 207 256 181 290
35 298/304 290 234 249 207 271 181 290
36 304 290 234 249 207 271 181 290
37 304 290 234 249 207 256 181 290
38 298 290 234 249 207 256 181 290
39 304 284/290 234 249 207 268 187 290
40 304 290 234 249 207 268/271 187 290
41 298 284/290 234 249 207 268/271 187 290
42 298 290 234 246 207 253/253 181 290
43 304 290 240 249 213 256 181 290
44 298 284 234 249 207 256 185 290/305
45 304 284 234 249 207 256 181 280/290
46 304 284 234/237 249 207 256/268 181 290
47 298 290 237 249 207 256/271 181 290
48 298/304 284 234/240 246/249 213 256/271 187 284/290
49 298/304 284/290 234/240 246/249 207/213 256/271 181 284/290
50 304 290 234 249 207 271 181 290
51 298 290 234 249 207 256 181 290
52 298 290 234 249 207 271 181 290
53 298 290 234 249 207 256 181 290
54 304 284/290 234/240 246/249 207/211 256/271 181 284/290
55 302/304 284/290 234/240 249 213 271 175 284/290
56 298/304 290 234 249 207/213 271 181 290
57 304 290 234 249 213 271 181 277/290
58 298 290 234 249 207 268 175/185 -
59 304 290 234 249 213 271 181 290
60 302 272 234 246/246 213 271 -/- -
61 298/304 290 234 249 207 256 181 290
62 298/304 284/290 234/237 249 207 256 181 290
63 304 284/290 234 249 207/213 256/268 181 290
64 304 290 234 249 213 256 181 290
65 302 284 240 246 213 271 175 284
66 304 284/290 234/240 246/249 207/213 256/271 181 284/290
67 298 284 234 249 207 271 185 290
68 304 290 234 249 213 271 185 290
69 304 290 234 249 207 256 181 290
70 302/304 284/290 234/240 246/249 207/213 256/271 175 284/290
71 298 284 234 249 207 256 179 277/290
72 298 284 234 249 207 271 181 280/290
일련번호 GB - RC -105 GB - RC -107 GB - RC -110 GB - RC -133 GB - RC -135 GB - RC -169 GB - RC -171 GB - RC -174
1 206 198 184 303 308 174 250 236
2 206 201 184 303 308 174 250 236
3 200/206 198 184 277/303 308 174 250/260 236
4 200 198 174 303 308 174 250 236/248
5 206 198 184 277 308 174 250 236
6 206 198 184 303 308 174 250 236
7 206 198 184 303 308 174 250 236
8 206 198 184 303 308 174 260 236
9 200 198 184 303 308 174 250 236
10 200 198 184 303 308 174 250 236
11 200 198 184 303 308 174 250 236
12 200 198 184 303 308 174 250 236
13 - 198 184 303 308 174 260 236
14 206 198 184 303 308 174 250 236
15 206 198 184 303 308 174 250 236
16 206 198 184 303 308 174 260 236
17 200 198 184 303 308 174 260 236
18 200/206 198 184 303 308 174 250 236
19 206 198 184 303 308 174 250 236
20 200 198 184 303 308 174 250 236
21 200/206 198 184 303 308 174 250 236
22 206 198 184 303 308 174 250 236
23 206 198 184 303 308 174 250 236
24 206 198 184 303 308 174 250 236
25 206 198 184 303 308 174 250 236
26 - 198 174 303 308 174 250 236
27 - 198 184 277 308 174 250 236
28 200/206 198 184 303 308 174 250 236
29 206 198 184 303 308 174 250 236
30 206 198 184 303 308 174 250 236
31 206 198 184 277/303 308 174 250 236
32 206 198 184 303 308 174 250/260 236
33 200 198 184 277 308 174 260 236
34 200 198 184 303 308 174 250 236
35 200 198 184 303 308 174 260 236
36 206 198 184 303 308 174 250 236
37 206 198 184 277 308 174 250 236
38 206 198 184 303 308 174 250 236
39 200 198 184 303 308 174 250 236
40 200 198 - 303 308 174 250/260 236
41 200 198 184 303 308 174 260 236
42 206 198 184 303 308 174 260 236
43 200 198 184 303 308 174 250 236
44 200/204 198 184 303 308 174 250 236
45 206 198 184 303 308 174 250 236
46 206 198 184 303 308 174 250 236
47 206 198 130 - 308 174 260 236
48 200/206 198/201 184 277/303 300/308 174 250/260 236/248
49 200/206 198 174/184 277/303 300/308 174/176 260 236/248
50 200 198 184 303 308 174 260 236
51 206 198 184 303 308 174 260 236
52 200 198 184 303 308 174 260 236
53 200 198 184 303 308 174 260 236
54 200/206 198 184 277/303 300/308 172/174 250 236/248
55 200/206 198 174/184 277/303 300/308 172/174 246/250 236/248
56 200/206 198 174/184 277/303 308 174 250/260 236
57 196/200 198 174 277 308 174 260 236
58 194/206 198 184 303 308 174 260 236
59 206 198 184 303 308 174 260 236
60 - 198 170 277 300 172 246/246 248
61 206 198 184 303 308 174 250/260 236
62 200/206 198 184 303 308 174 260 236
63 206 198 184 303 308 174 250 236
64 206 198 184 303 308 174 250 236
65 200 198 174 277 300 172 258 248
66 200/206 198/201 174/184 277/303 300/308 174 250/260 236/248
67 200 198 184 303 308 174 250 236
68 200 198 184 303 308 174 250 236
69 200 198 184 303 308 174 250 236
70 200 198 174/184 277/303 300/308 172/174 258/260 236/248
71 200/206 198 184 303 308 174 250 236
72 206 198 184 303 308 174 250 236
일련번호 GB - RC -177 GB - RC -217 GB - RC -225 GB - RC -232 비고
1 184 190 269 280
2 184 190 269 280
3 184 190 269 280
4 184 184/190 269 274
5 184 190 269 274
6 184 190 263 280
7 184 190 263/269 280
8 184 190 269 280
9 184 190 269 280
10 184 190 263 280
11 184 190 269 274/280
12 184 190 269 274
13 184 190 263 274
14 184 190 263 274
15 184 190 269 280
16 184 190 269 274
17 184 190 269 274
18 184 190 263/269 280
19 184 190 263 280
20 184 190 269 280
21 184 190 263 274
22 184 190 263 274
23 184 190 269 280
24 184 190 263/269 274
25 184 190 263/269 274
26 184 190 269 274
27 184 190 269 274/280
28 184 190 263/269 274/280
29 184 190 263 280
30 - 190 263 280
31 184 190 263/269 280
32 184 190 263 280
33 184 190 269 274
34 184 190 269 274
35 184 190 263/269 274/280
36 184 190 263/269 274
37 184 190 269 280
38 184 190 269 280
39 184 190 269 280
40 184 190 269 280
41 184 190 269 280
42 184 190 269 280
43 184 190 269 280
44 184 190 269 274
45 184 190 269 280
46 184 190 269 280
47 184 190 269 280
48 178/184 184/190 263/269 274/280
49 184 184/190 263 274
50 184 190 263 280
51 184 190 263 274
52 184 190 263 274
53 184 190 263 274
54 178/184 184/190 263/269 274/280
55 178/184 184/190 263/269 274
56 184 190 263 274
57 184 190 263 274
58 184 190 269 274
59 184 190 269 274
60 188 184 263 274
61 184 190 269 274
62 184 190 263/269 274
63 184 190 263/269 280
64 184 190 263 280
65 178 184 263 274
66 178/184 184/190 263 274/280
67 184 190 269 274
68 184 190 269 280
69 184 190 269 274
70 178/188 184/190 263/269 274
71 184 190 269 274
72 184 190 269 274
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 아주까리에서 국내 처음으로 SSR 마커를 개발하였다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 아주까리의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 아주까리의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 아주까리 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 아주까리의 품종 판별에 이용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> SSR primer and kits derived from castor bean (Ricinus communis L.) and use of there <130> NPF18240 <160> 56 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 1 aaatggaaga tcataaaact cg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 2 ctccttctct tggaaattac tg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 3 ggagggtaag gagaacttta ct 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 4 gttaatatta ctgttgcctc cc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 5 tttctctgct ctctgaggta tt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 6 catcaataac atccaccact ta 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 7 gtatggtacg atctctttgg ac 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 8 tacgcagaga agcactaata ga 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 9 aagctcaact taaaagccta ga 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 10 attttggtgg tctagttcag tc 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 11 tgaacagttt aaatgaactc ca 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 12 gaaccatatc ttgcctgttt at 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 13 ctattcgaat gggaaataaa ac 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 14 tgtcaaacag aatcagagag aa 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 15 tttctgctac agtgctactg ac 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 16 taataaaaga atttgtggct gg 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 17 gcggtgttat cattcctata tt 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 18 aatcctcatt ttgcattctt ac 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 19 cacttggatc gaactcagac 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 20 tgatttgctc tttgtttatc ag 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 21 atggataatc atttgggtaa ga 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 22 cgtcaccaac cataatgtat aa 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 23 aaggaattga gttgattaat gg 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 24 aaagcctttg tagatgaaca tt 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 25 ttgaggaaac agaagatcaa at 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 26 agcacgccaa tactctgtaa 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 27 aattcaaacc tatcagcaaa ag 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 28 aaaaactaaa aatggacctg tg 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 29 ccacacctaa cttactccaa at 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 30 catccacata tttagtccga ta 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 31 aatacatagc atgtggacat ca 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 32 tatagactct tgttccacca ca 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 33 tagattttta tggataggtg cc 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 34 atgtagacac ttgactcacg aa 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 35 atcttttctt gaactgtgac ct 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 36 catggtgtag attcatcatt gt 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 37 aaggagatta atataggcag ca 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 38 tgtcatgatc agcatagtct tt 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 39 tccaacaagg attagacttt ct 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 40 aagttgtctg ttgttgtagc tg 22 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 41 tgtttagaag caactcatct tg 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 42 ttcagggtgt ttttagactt tt 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 43 attgatttta tacattcagg gg 22 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 44 ccaaaacaag aagctctctc ta 22 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 45 aactccttcc ttacagttta cg 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 46 ctttactcct tgctccatta ac 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 47 gttttgcttc cttttgttag tg 22 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 48 aatccagacc aaacatctaa ac 22 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 49 ccaagtggtc aagagagtgt at 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 50 tcctcaataa tatacaaagg gg 22 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 51 aaaaagtagc agaactagca cc 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 52 accatcttct tcatcttgtt tc 22 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 53 catatgtgat caatagggat gt 22 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 54 aatccagtag atttctcatt gc 22 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 55 aaagagatag ccactcaact gt 22 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Ricinus communis L. <400> 56 tatgattcac catgaaagct aa 22

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. (a) 아주까리 또는 대조군 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍;을 포함하는 조성물을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 아주까리의 DNA 다형성 검출 방법.
  6. (a) 아주까리 또는 대조군 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍;을 포함하는 조성물을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 PCR 산물의 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 아주까리의 품종 동정 방법.
  7. 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍;을 포함하는 아주까리의 DNA 다형성 검출용 키트.
  8. 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍;을 포함하는 아주까리의 품종 동정용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Genet. Resour. Crop. Evol., Vol. 55, No. 3, pp. 365-378 (2007.07.04.) *
NCBI, GenBank, Accession No. HM150762 (2010.08.01.) *

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