KR101183996B1 - 메밀에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 메밀에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 메밀의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 메밀의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 메밀의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 메밀의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며 종 및 품종 구분에 이용될 수 있다.
SSR 프라이머, 메밀, DNA 다형성

Description

메밀에서 유래된 ＳＳＲ 프라이머 및 이의 용도{SSR primer derived from Buckwheat and use thereof}
본 발명은 메밀(Buckwheat; Fagopyrum esculentum)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 메밀의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들 이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류, 동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.
벼에서는 벼 게놈에 반복되는 SSR을 PCR 기술로 증폭하여 벼 품종의 유전자형을 동정하는 초위성체 마커들이 개발되었다(대한민국 특허출원번호 제2001-34003호). 미국의 탕(Tang) 박사팀은 879개의 SSR 마커들을 개발하여 해바라기의 유전자 지도를 발표한 바 있다(Tang et al., Theor. Appl. Genet., 105: 1124-1136, 2002). 이외에도 보리, 콩 등에서 많은 SSR 마커들이 개발되었다. 세계적으로 메밀에서는 59개 초위성체(SSR) 마커들이 개발되었으나 단메밀(common buckwheat)과 쓴 메밀 (tatary buckwheat) 등 Cymosum 그룹에서 사용이 가능한 것으로 알려져 있다. 메밀에서는 SSR 마커가 아직 국내에서 전혀 개발된 바 없으며, 다양한 메밀속(Fagopyrum) 에 적용하능한 초위성체(SSR) 관련 연구가 미흡한 실정이다.
본 발명의 발명자들은 메밀의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 다양한 메밀 계통들에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 메밀의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 메밀의 DNA 다형성 검출 방법 및 메밀의 품종 동정 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 메밀의 DNA 다형성 검출용 키 트 및 메밀의 품종 동정용 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 메밀의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 마커를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 비오틴-스트렙타비딘 포획(biotin-streptavidin capture; Dixit et al., Mol. Eco. Note, 5: 736-738) 방법으로 메밀로부터 SSR 마커를 개발하였다. 메밀에서 분리된 SSR 마커는 본 발명에 의해 처음으로 제공되는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 SSR 마커는 다음과 같은 방법으로 개발되었다. 메밀로부터 추출한 게놈 DNA를 제한효소로 처리해 DNA 단편을 제조한 후 AP11 및 AP12의 2개의 어댑터와 라이게이션하였다.
라이게이션 산물을 비오틴이 표지된 SSR 탐침과 혼성화한 후 마그네틱 비드를 이용해 분리하였다. 이를 AP11 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후 서열을 분석함으로써 메밀의 초위성체를 포함하고 있는 504개의 DNA단편을 수득하였다.
상기에서 수득한 DNA단편을 분석함으로써 5개 이상의 반복 유닛을 포함하고 있는 단편만을 선발하고 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 초위성체를 증폭 할 수 있는 양방향 프라이머 192쌍을 디자인 하였다. 상기 프라이머쌍을 사용하여 다양한 재배형 메밀 계통 및 품종들의 PCR을 통한 DNA 프로파일링을 수행함으로써 다형성 변이를 많이 나타내는 10쌍의 SSR 프라이머쌍을 선발하였다.
본 발명에서 제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다. 바람직하게는 GB-FE-001(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-012(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-014(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-035(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-043(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-054(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-055(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-080(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-169(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-FE-191(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍)로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 및 이들에 의해 증폭되는 초위성체에 존재하는 반복 모티브(repeat motif), 증폭되는 초위성체의 크기, Tm(℃) 및 초위성체가 존재하는 염색체 대립인자에 대한 정보를 하기 표 1에 기재하였다.
본 발명의 SSR 프라이머쌍 및 이로부터 증폭되는 초위성체의 특성
프라이머 명 서열 서열번호 반복 모티브 증폭되는 초위성체의 크기의 범위(bp) AT℃
(Tm(℃))		 대립인자의 No.
1 GB-FE-001 aF TGAAACCCAACCATCAGG 1 (CAA)7 268 - 274 58 2
bR CGACAGTGGCTGGAGAAC 2
2 GB-FE-012 F ACTGCACCCCAGAGGATT 3 (CAG)5(CT)(CAG)&(GAK)8 197 - 209 58 6
R GCTGTATCCATGCCCGTA 4
3 GB-FE-014 F AGGAGCAGAGGTGGTGGT 5 (GA)10C(GA) 198 - 208 59 4
R CGGAGCCTCTGCAACC 6
4 GB-FE-035 F TGCAATGACTTGGAGGAGA 7 (GAY)14(GGT)(GAB)41 222 - 398 58 21
R ACCACCATTCAACAAGCG 8
5 GB-FE-043 F TTCAGCACCTGGATGGAC 9 (CCA)5 198 - 201 58 2
R TGTCCCCAATGTGAAAGG 10
6 GB-FE-054 F TGTTGGACTTCCTAGACCTG 11 (TR)12 227 - 249 58 9
R CATGAAAAGGGGATGCAA 12
7 GB-FE-055 F CTGCTTGGATCCCATTGA 13 (GAK)6&(GAT)3&(GAT)2 256 - 259 58 2
R AGCCTCTCGATCCCTCTG 14
8 GB-FE-080 F CGAGGTGGGCAGTAGAGA 15 (CST)7 231 - 276 59 4
R GAGGAGGACGAGGAGGTG 16
9 GB-FE-169 F CAACCCTATGCAGCGTTC 17 (ACA)6 188 - 191 58 3
R GAGGGGAAGCTGCTTGTT 18
10 GB-FE-191 F AATCAATGACCAGCACGC 19 (CAT)5 141 - 156 58 6
R CTGATGGAGGATGCCAAA 20
aF: 정방향 프라이머 bR: 역방향 프라이머
Degenerate 염기서열:K는 (G 또는 T), Y는 (C 또는 T), B는 (G, T 또는 C), R은 (A 또는 G), S는 (G 또는 C)를 말함.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 메밀에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 메밀의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 메밀의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
구체적으로 메밀의 DNA 다형성 검출 방법은
(a) 메밀로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 메밀에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분 30초를 36 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
아울러, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 메밀의 품종 동정 방법을 제공한다.
구체적으로 메밀의 품종 동정 방법은
(a) 메밀 및 대조군 메밀 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계를 포함한다.
(a) 내지 (c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 메밀 및 대조군 메밀 품종에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대한 시료가 되는 메밀와 대조군 메밀 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍을 적용한 PCR 산물에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 메밀와 대조군 메밀 품종의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 메밀는 대조군 메밀 품종과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 메밀 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 메밀와 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 메밀 보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 메밀에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 메밀의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 메밀의 품종 동정용 키트를 제공한다. 품종 동정 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 메밀은 Fagopyrum esculentum 및 이들의 변종일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 Fagopyrum esculentum 일 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 메밀에서 처음으로 SSR 마커를 개발하였다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 메밀의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 메밀의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 메밀의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 메밀의 품종을 판별할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
게놈 DNA 추출
재배종 메밀(국립농업과학원 농업유전자원센터, 보존번호 : FE-1)로부터 SDS를 이용한 방법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990)에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 이를 상세히 설명하면 다음과 같다. 생육 1개월째의 어린 메밀 식물체로부터 0.5g의 잎 조직을 채취하여 1.5㎖ 튜브에 넣고 액체질소로 급냉시켰다. 이후, 즉시 플라스틱 막대로 잎을 곱게 마쇄하였다. 마쇄된 잎이 녹기 전에 추출 완충용액(200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 750㎕를 첨가하고, 혼합액을 65℃에서 30분간 보관하였다. 여기에 동량의 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalchol) (25:24:1) 용액을 추가로 첨가한 후, 약 15분간 교반하였다. 이를 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 새 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에 동량의 이소프로판올(-20℃)을 첨가하고, -20℃에서 1시간 보관하였다. 이후, 13,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하였다. DNA를 건조시킨 후, 약 300㎕의 RNase (50㎍/㎖)를 함유하는 TE 완충용액(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4)을 첨가하여 충분히 녹인 후, 37℃에서 1시간 동안 보관하였다.
<실시예 2>
어댑터와의 라이게이션(ligation)
상기 실시예 1에서 얻은 게놈 DNA 500ng을 각 제한효소 제조사의 지침에 따라 EcoRV, DraI, SmaI, PvuI, AluI, HaeIII 및 RsaI로 절단하였다. 절단된 DNA를 1.2% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 약 300-1500 bp 크기의 DNA 단편만을 겔로부터 일루션(elution)하여 수득하였다. 이후, 수득된 DNA 단편을 2개의 어댑터(adapter; AP-11 및 AP-12, 각 50ng)와 T4 DNA 라이게이즈(ligase; Promega, 미국)를 이용하여 12℃에서 하룻밤 동안 라이게이션시켰다. 이 때 라이게이션 효율을 높이기 위해 AP-12 어댑터는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, Promega, 미국)로 5’ 말단을 인산화하였으며, 라이게이션시의 반응용액의 조성은 다음과 같다: 1X 라이게이션 버퍼(Promega, 미국), 50ng AP11 어댑터, 50ng AP12 어댑터, 150ng DNA 단편, 3 Unit T4 라이게이즈(Promega, 미국).
본 발명에서 사용한 어댑터
어댑터 명 염기서열 서열번호
AP-11 5'-CTCTTGCTTAGATCTGGACTA-3' 21
AP-12 5'-TAGTCCAGATCTAAGCAAGAG-3' 22
<실시예 3>
초위성체를 포함하고 있는 DNA 단편의 선발 및 분리
<3-1> 마그네틱 비드 준비
마그네틱 비드(magnetic bead; SA-PMPs, Promega, 미국; 1 mg/ml) 0.6 ml를 마그네틱 분리기(magnetic stand; Promega, 미국)로 수집한 후 용액을 제거하였다. 여기에 0.5x SSC(Saline-Sodium Citrate) 버퍼 0.6ml를 넣어 세척을 하고 다시 마그네틱 분리기로 수집한 후 용액을 제거하였다. 0.5x SSC 버퍼를 이용한 세척은 3회 반복하여 실시하였다. 세척한 마그네틱 비드에 0.5x SSC 버퍼 100㎕를 넣은 후 30분이내에 사용하였다.
<3-2> 혼성화
상기 실시예 2에서 제조한 라이게이션 산물에 증류수를 넣어 500㎕가 되도록 한 후 65℃에서 10분간 변성(denature)시켰다. 여기에 바로 비오틴(biotin)이 표지된 SSR 탐침 1.5㎕(20ng)와 20x SSC 버퍼 13㎕를 넣고 상온에서 10분간 방치하여 결합을 유도하였다. 혼성화에 사용된 8개의 SSR 탐침은 하기 표 3에 기재하였으며, SSR 탐침은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 비오틴으로 표지하였다.
메밀의 초위성체를 분리하기 위한 탐침의 서열
서열 서열번호
Biotin-(GA)20 23
Biotin-(AT)20 24
Biotin-(CA)20 25
Biotin-(AGC)15 26
Biotin-(GGC)15 27
Biotin-(AAG)15 28
Biotin-(AAC)15 29
Biotin-(AGG)15 30
혼성화 반응을 통하여 게놈 DNA 단편 중 상기 반복염기서열을 가지고 있는 DNA 단편들은 비오틴이 표지된 SSR 탐침들과 상보적 결합을 할 것이고, 이를 SSR 탐침-템플릿(template) 혼성체(hybrid)라고 한다.
<3-3> 템플릿의 분리
<3-1>에서 제조한 마그네틱 비드 용액을 <3-2>에서의 SSR 탐침-템플릿 혼성체 용액에 넣고 상온에서 10분간 방치시킨다. 반응용액에서 마그네틱 분리기로 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 수집하고 상등액을 제거하였다. 상기 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 0.1x SSC 300 ㎕로 4회 세척한 후 증류수 50㎕를 넣고 90℃에서 5분간 가열하여 하기 템플릿을 분리하였다.
<3-4> PCR 반응
<3-3>에서 분리한 템플릿에 대해 AP-11 어댑터를 프라이머로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 혼합물(20㎕)의 조성은 다음과 같다: 250 ng 어댑터-라이게이션된 DNA, 10 pmol AP11 프라이머, 2 mM dNTP, 2 units Taq DNA 중합효소, 5 ㎕ 10× 완충용액. PCR 반응은 72℃에서 2분, 94℃에서 3분 동안 가열한 후 94℃에서 30초; 56℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 24 싸이클(cycle)로 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.
이와 같은 방법으로 본 발명에서는 초위성체를 함유하고 있는 504개의 DNA 단편을 분리하였다.
<실시예 4>
분리된 DNA 단편의 서열분석 및 프라이머 디자인
상기 실시예 3에서 분리된 초위성체를 함유하고 있는 DNA 단편들을 pGEM T-easy vector 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하여 이들의 서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 (주)솔젠트에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 서열을 기초로 하여 5개 이상의 반복 유닛(repeat unit)을 포함하고 있는 단편만을 선발하였다. 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 하여 초위성체를 증폭할 수 있는 양 방향의 프라이머를 디자인하였다. 총 192쌍의 프라이머쌍을 디자인하였다(결과미도시).
<실시예 5>
SSR 마커의 선발
상기 실시예 4에서 디자인된 프라이머쌍 중에서 다양한 메밀 계통에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머 조합을 선발하기 위하여, 하기 표 4에 기재된 41점의 재배형 메밀 또는 메밀 품종에 대하여 PCR을 통한 DNA 프로파일링(profiling) 분석을 수행하였다.
상기 실시예 4에서 디자인된 프라이머쌍 중에서 다양한 메밀 계통에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머 조합을 선발하기 위하여, 하기 표 4에 기재된 41점의 재배형 메밀 또는 메밀 품종에 대하여 PCR을 통한 DNA 프로파일링(profiling) 분석을 수행하였다.
SSR 분석에 사용된 메밀
기탁번호 기탁기관 나라
1 FE-1 농진청,농업유전자원센터 대한민국
2 FE-2 농진청,농업유전자원센터 대한민국
3 FE-3 농진청,농업유전자원센터 대한민국
4 FE-4 농진청,농업유전자원센터 캐나다
5 FE-5 농진청,농업유전자원센터 캐나다
6 FE-6 농진청,농업유전자원센터 대한민국
7 FE-7 농진청,농업유전자원센터 대한민국
8 FE-8 농진청,농업유전자원센터 대한민국
9 FE-9 농진청,농업유전자원센터 대한민국
10 FE-10 농진청,농업유전자원센터 대한민국
11 FE-11 농진청,농업유전자원센터 대한민국
12 FE-12 농진청,농업유전자원센터 대한민국
13 FE-13 농진청,농업유전자원센터 대한민국
14 FE-14 농진청,농업유전자원센터 대한민국
15 FE-15 농진청,농업유전자원센터 대한민국
16 FE-16 농진청,농업유전자원센터 대한민국
17 FE-17 농진청,농업유전자원센터 대한민국
18 FE-18 농진청,농업유전자원센터 대한민국
19 FE-19 농진청,농업유전자원센터 대한민국
20 FE-20 농진청,농업유전자원센터 대한민국
21 FE-21 농진청,농업유전자원센터 대한민국
22 FE-22 농진청,농업유전자원센터 대한민국
23 FE-23 농진청,농업유전자원센터 대한민국
24 FE-24 농진청,농업유전자원센터 대한민국
25 FE-25 농진청,농업유전자원센터 대한민국
26 FE-26 농진청,농업유전자원센터 대한민국
27 FE-27 농진청,농업유전자원센터 대한민국
28 FE-28 농진청,농업유전자원센터 대한민국
29 FE-29 농진청,농업유전자원센터 대한민국
30 FE-30 농진청,농업유전자원센터 대한민국
31 FE-31 농진청,농업유전자원센터 대한민국
32 FE-32 농진청,농업유전자원센터 대한민국
33 FE-33 농진청,농업유전자원센터 대한민국
34 FE-34 농진청,농업유전자원센터 대한민국
35 FE-35 농진청,농업유전자원센터 대한민국
36 FE-36 농진청,농업유전자원센터 대한민국
37 FE-37 농진청,농업유전자원센터 우크라이나
38 FE-38 농진청,농업유전자원센터 러시아
39 FE-39 농진청,농업유전자원센터 대한민국
40 FE-40 농진청,농업유전자원센터 대한민국
41 FE-41 농진청,농업유전자원센터 대한민국
각각의 PCR 반응 혼합물(20㎕)의 조성은 다음과 같다: 실시예 1의 방법에 의해 분리한 메밀 주형 DNA 40ng, 정방향 프라이머 0.2μM, 역방향 프라이머 0.6μM, 형광물질이 표지된 M13 프라이머(TGTAAAACGACGGCCAGT, 서열변호 31) 0.6μM, 1X PCR 반응액 (10mM Tris-HCl (pH 8.8), 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 unit DNA 중합효소. PCR 반응은 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 각 프라이머의 Tm(표 1 참조)에 해당하는 온도에서 30초; 및 72℃에서 45초의 조건으로 35회 반복한 후, 다시 94℃에서 30초; 53℃에서 45초; 및 72℃에서 45초의 조건으로 15회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 15분의 조건으로 수행하였다.
각기 다른 형광물질로 증폭된 PCR 산물 단편의 크기를 분석하기 위해 자동 염기서열 분석 장치 (ABI 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였다. 분석을 위하여, PCR 산물 1.5㎕, Hi-di 포름아미드(formamide) 9.2㎕, 내부 크기 표준시약(Internal Size Standard; Genescan-500 ROX) 0.3㎕을 혼합한 후 94℃에서 3분간 변성하여 분석에 사용하였다.
그 결과, 국내 및 국외에서 수집된 메밀 재배형 및 메밀 품종들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머쌍 10쌍을 확인하여 GB-FE-001(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-012(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-014(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-035(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-043(서열번호 9과 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-054(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-055(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-080(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), GB-FE-169(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-FE-191(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍)을 선별하였다(표 1 참조). 상기 10쌍의 프라이머에 의해 증폭된 PCR 단편의 각각의 크기는 다음 표 5와 같다
프라이머에 따른 증폭된 초위성체의 종류 및 크기
FE-1 FE-2 FE-3 FE-4 FE-5 FE-6 FE-7 FE-8
GB-FE-001 274 274 268 268 268 268/274 268 274
GB-FE-012 197/200 206 206/209 197/209 200/206 206 197/206 197/209
GB-FE-014 204 204/210 206/208 208 204/208 204/210 204/206 204
GB-FE-035 264 267 261 246 255 380 371 240
GB-FE-043 198 198 198 201 198 198 198 198/201
GB-FE-054 235 247 247 231/235 231/235 233 229 231
GB-FE-055 259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259
GB-FE-080 231 231 234 231/276 231/234 231/276 231 231/276
GB-FE-169 191 191 191 176/191 191 191 191 191
GB-FE-191 144 147/156 156 144/156 153/156 156 153 153/156
FE-9 FE-10 FE-11 FE-12 FE-13 FE-14 FE-15 FE-16
GB-FE-001 268/274 268 268/274 268/274 268/274 268/274 268/274 268
GB-FE-012 206 206 197/209 191/206 206/209 197/206 206 206
GB-FE-014 204 204/208 208/210 204 204 204/208 206/210 204
GB-FE-035 252/368 243 231 249 255 246/258 249 240
GB-FE-043 198 198/201 198 201 201 198 198 198
GB-FE-054 233 237 247 233 233 235 247 239
GB-FE-055 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256 256/259
GB-FE-080 231 231/276 231 231 231 231 231 231/234
GB-FE-169 191 191 191 191 191 191 191 191
GB-FE-191 153/156 156 156 153/156 153 156 153 150/156
FE-17 FE-18 FE-19 FE-20 FE-21 FE-22 FE-23 FE-24
GB-FE-001 268 268/274 268 268/274 268 268 268 268
GB-FE-012 206 200/209 206 206 206 206 197/209 197/209
GB-FE-014 204 210 208/210 204/206 204/210 204 204/208 206/208
GB-FE-035 246 270/347 380 246/356 249 252 356 246
GB-FE-043 198 198/201 198/201 198 198/201 198 198 198
GB-FE-054 233 233 247 233 247 233 227 231
GB-FE-055 256/259 259 256/259 256/259 256/259 256/259 259 256/259
GB-FE-080 231 231 231 231 231/261 231 231 231
GB-FE-169 191 191 188/191 191 191 191 191 191
GB-FE-191 153/156 153 153/156 153/156 156 144/156 156 153
FE-25 FE-26 FE-27 FE-28 FE-29 FE-30 FE-31 FE-32
GB-FE-001 268 268/274 268/274 268/274 268/274 268/274 268/274 268/274
GB-FE-012 197/206 206 206 206/209 206 188/206 197/209 206
GB-FE-014 204/208 204 204/210 204/210 210 204/210 204/210 204
GB-FE-035 255 267 264 389/404 377 222/243 255 249/255
GB-FE-043 198 198/201 198/201 198 201 198 198 198
GB-FE-054 245/247 245 247 231 231 237/247 247 247
GB-FE-055 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259
GB-FE-080 231/276 231/276 231/276 231/234 231 231/276 231/261 231/276
GB-FE-169 191 191 191 191 191 191 191 191
GB-FE-191 153/156 153 156/214 156 156 156 144/153 153
FE-33 FE-34 FE-35 FE-36 FE-37 FE-38 FE-39 FE-40
GB-FE-001 268/274 268/274 268/274 268 268/274 268/274 268/274 268/274
GB-FE-012 197/206 206 206 206 206 206 200/209 206/209
GB-FE-014 206/210 210 204/208 204/208 208 204/208 210 204/210
GB-FE-035 255/258 240 258 267 258 246/249 252 380
GB-FE-043 198 198/201 198 198/201 198/201 198 198 198
GB-FE-054 235 235 233 247 233 231/235 247 247
GB-FE-055 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259 256/259
GB-FE-080 231 231/276 231 231/234 231 231/276 231/234 231
GB-FE-169 191 191 176/191 191 191 191 191 191
GB-FE-191 150/156 153 153 156 153/156 153/156 153 153
FE-41
GB-FE-001 268/274
GB-FE-012 206
GB-FE-014 204
GB-FE-035 246
GB-FE-043 198/201
GB-FE-054 247
GB-FE-055 256/259
GB-FE-080 231
GB-FE-169 191
GB-FE-191 153/156
상기 표 5에서와 같이 본 발명의 프라이머쌍에 의해 증폭된 SSR을 포함하는 부위의 크기가 41점의 메밀 샘플에서 다형성을 보였으며 이에 본 발명의 프라이머쌍에 의해 증폭된 부위에 위치하는 SSR은 다형성을 가짐을 알 수 있었다. 이 때 각각의 SSR의 반복모티프는 표1에 기재된 바와 같으며 다형성을 보이는 대립인자 수 역시 표1에 기재된 바와 같다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 메밀에서 국내에서 처음으로 SSR 마커를 개발하였다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 메밀의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 메밀의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 메밀의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 메밀의 품종을 판별할 수 있다.
<110> Republic of Korea (Management: Rural Development Administration) <120> SSR primer derived from Buckwheat and use thereof <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-001-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 1 tgaaacccaa ccatcagg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-001-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 2 cgacagtggc tggagaac 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-012-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 3 actgcacccc agaggatt 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-012-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 4 gctgtatcca tgcccgta 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-014-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 5 aggagcagag gtggtggt 18 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-014-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 6 cggagcctct gcaacc 16 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-035-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 7 tgcaatgact tggaggaga 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-035-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 8 accaccattc aacaagcg 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-043-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 9 ttcagcacct ggatggac 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-043-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 10 tgtccccaat gtgaaagg 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-054-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 11 tgttggactt cctagacctg 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-054-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 12 catgaaaagg ggatgcaa 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-055-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 13 ctgcttggat cccattga 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-055-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 14 agcctctcga tccctctg 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-080-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 15 cgaggtgggc agtagaga 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-080-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 16 gaggaggacg aggaggtg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-169-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 17 caaccctatg cagcgttc 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-169-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 18 gaggggaagc tgcttgtt 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-191-F: forward primer for detecting Actinidia arguta <400> 19 aatcaatgac cagcacgc 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-FE-191-R: reverse primer for detecting Actinidia arguta <400> 20 ctgatggagg atgccaaa 18 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-11: adaptor primer <400> 21 ctcttgctta gatctggact a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-12: adaptor primer <400> 22 tagtccagat ctaagcaaga g 21 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(GA)20 <400> 23 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AT)20 <400> 24 atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(CA)20 <400> 25 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AGC)15 <400> 26 agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagc 45 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(GGC)15 <400> 27 ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggc 45 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AAG)15 <400> 28 aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaag 45 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AAC)15 <400> 29 aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaac 45 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AGG)15 <400> 30 aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggagg 45 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 primer <400> 31 tgtaaaacga cggccagt 18

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 SSR 프라이머쌍.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. (a) 메밀 및 대조군 메밀 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    (c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 메밀 및 대조군 메밀 품종의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 메밀의 품종 동정 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 메밀의 품종 동정용 키트.
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