JP4097288B2 - ホップにおける遺伝学的品種識別方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、ホップの品種識別方法、特に遺伝子工学技術を利用した品種識別方法に関する。
背景技術
ホップは、ビールに独特な芳香と苦味を与えると共に、過剰なタンパク質を沈殿・分離させたり、雑菌の繁殖を抑える等の作用を有している。しかし、これらの作用の程度等は、主にホップの品種によって差異があるため、一定の品質のビールの製造や新たなビールの開発にはホップの品種を識別した上で使用する必要がある。
このホップの品種識別方法としては、従来、ホップの含有成分、例えば苦味成分（α酸／β酸cohumulone/humulone,colupulone/lupulone）、精油成分（farnesene,caryophyllene）差異に基づいて行っていた。
しかしながら、上記の苦味成分や精油成分の差異による識別方法は、各種成分の測定に多大な労力を必要とする上に、同一品種であっても収穫の地域や年度により各種成分が大きく変動することから、上記方法では正確な品種判定が行えなかった。
一方、近年の遺伝子工学の進歩により、生物種によっては染色体等の配列の解明が試みられ、ここで解明された塩基配列に基づき、生物種間または同一生物の品種間での遺伝情報の差異、すなわち、ＤＮＡ配列の多型から種の識別が行われようとしていている。このような多型に基づく品種の識別は、ＤＮＡ配列自身が環境的な影響を受けにくく変化することが殆どないため、確実なる識別を行うことができる。
そこで、本発明は、上記のような遺伝学的な手法を用いて、正確かつ簡便なホップの品種識別方法を提供する。
発明の開示
本発明のホップの品種識別方法は、品種間のＤＮＡ配列の違いすなわち多型に基づき、この多型を遺伝学的な手法で検出して識別する方法であり、詳細には、被検体であるホップのＤＮＡのうち品種間で多型を含む領域を品種識別プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという）により増幅し、この増幅ＤＮＡを解析することにより品種を識別する。
上記の方法を達成するためには、ホップにおける品種間のＤＮＡ配列上の多型を知る必要がある。
この多型とは、具体的には、挿入、欠失、置換などに由来する配列上の編成の違いを含み、また、多型に関与する配列の長さは１ｂｐであってもよく、または数十ｂｐ以上であってもよいが、望ましくは数ｂｐから数十ｂｐである。
上記のような品種間の配列上の多型を検出する方法としては、品種毎に染色体ＤＮＡの対応する部分の配列を決定し、ここで決定した配列を比較解析して、多型を検出することもできるが、より簡便には、Williamsら（Nucleic Acids Research．第18巻，第6531頁、1990年）により開発されたＲＡＰＤ（Random amplified polymorphic DNA）法を利用することができる。
このＲＡＰＤ法は、配列が未知のＤＮＡ間の多型をＰＣＲを利用して検出する方法である。詳細には、比較的短い１０塩基程度の合成オリゴヌクレオチドからなる特異性の低いプライマーを複数種の対象ＤＮＡとそれぞれ混合して、ＰＣＲを行う。もしも、ここで前記ホップのＤＮＡの配列中に混合したプライマーと完全にまたは部分的に相補する配列がある場合には、この完全または部分相補配列とアニールし、プライマー同士に挟まれた領域が増幅される。そして、種間でこのプライマー同士に挟まれた領域の中にＤＮＡの挿入や欠失等の配列の差異がある場合には、種間で異なるサイズのＰＣＲ増幅断片が得られる。また、一方の品種にはプライマーがアニールする配列があり、他方には無い場合、一方の品種のみにＰＣＲ増幅断片が得られる。これを電気泳動等で分画することがで多型を検出することができる。
一方、上記ＲＡＰＤ法は、上記のように本発明における多型を検出する方法以外にも、ＰＣＲにより多型を検出し得るプライマーを選択する方法、すなわち、プライマー設計方法としても利用することができる。
従って、上記ＲＡＰＤ法に基づき検出されるホップＤＮＡの品種間のいかなる多型領域も本発明の対象に含まれる。また、上記ＲＡＰＤ法に基づき検出される多型領域を増幅し得るいかなるプライマーも本発明の品種識別プライマーとして利用することができる。
上記方法に基づき開発される本発明の品種識別プライマーは、１種類の合成オリゴヌクレオチドであっても、または２種以上の合成オリゴヌクレオチドであってもよい。また、この合成オリゴヌクレオチドの所定の鎖長は６〜４０、好ましくは１０〜２１であり、具体的には、配列表の配列番号１〜１４に示した塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
本発明の品種識別プライマーを設計する第二番目の方法としては、以下の工程からなる方法が含まれる。
この設計方法は、先ず、品種識別プライマー（例えば先のＰＡＰＤ法に基づき検出される多型領域を増幅し得るプライマー、以下一次プライマーという）を用いたポリメラーゼ連鎖方法により得られた増幅断片の塩基配列を決定するとともに多型配列を決定する。最終的に、この多型配列を一次プライマーより再現性良くかつ識別し易いような増幅断片を生成し得るように前記多型配列断片内の所定間隔離れた位置の配列とそれぞれ相補する２種の品種識別プライマーを設計して合成する。
すなわち、上記方法は、多型配列及びその周辺の配列に基づき好適な品種識別プライマーを選択して設計することができる。
また、上記の一次プライマーとしては、配列表の配列番号１〜１４に示した塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することができる。
例えば、第一の品種識別プライマーの配列としては、２種のプライマーの一方または両方を前記多型配列の全部又は一部を含むように設計することができる。
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、選択された多型配列を備えた品種では、相補配列を有することからＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きて一定の増幅ＤＮＡが得られ、一方当該多型配列を有していない品種では、相補する配列を有していないため、ＰＣＲを行っても増幅ＤＮＡは生じないことになる。従って、この場合には、増幅断片の有無により品種を識別することが可能となる。
第二の品種識別プライマーの配列として、２種のプライマーが前記多型配列の上流域と下流域のそれぞれに位置するうよに設計することができる。
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、ＰＣＲにより品種間で内部の塩基配列の、場合によってはサイズの異なる増幅ＤＮＡが生成される。ここで生成された増幅ＤＮＡを直接電気泳動により分画するか、または必要に応じて制限酵素で消化した後電気泳動により分画あるいは変性勾配ゲルや温度勾配ゲル電気泳動の泳動パターン等により品種を識別することができる。
第三品種識別プライマーの配列としては、５′末端に一次プライマーの配列を備え、それに続いた該多型領域の塩基配列を５〜２０塩基連結した配列を有するように設計することができる。
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、例えば一次プライマーが相補する位置に多型配列が存在する場合に有用である。すなわち、一次プライマーにさらにそれに続く塩基配列を５〜２０塩基付加することにより、一次プライマーに比して、より特異的に前記多型配列を検出することができるようになる。
さらに、上記設計方法により設計された品種識別プライマーであれば、上記特徴を有する配列以外のいかなるものも、ホップの品種識別プライマーとして好適に使用することができる。
前記方法により設計された品種識別プライマーとして、具体的には配列表の配列番号１５〜４０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドまたはその一部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを適当に２種組み合わせて使用することができる。
また、上記配列以外にも品種識別プライマーとして、配列表の配列番号１５（１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９）に記載の塩基配列がゲノムＤＮＡにアニールする部位と配列番号１６（１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０）に記載の塩基配列がゲノムＤＮＡにアニールする部位の間に存在するゲノムＤＮＡの塩基配列の一部を有する合成オリゴヌクレオチドを用いることもできる。
上記の通り構成された第二の品種識別プライマーの設計方法によれば、多型を示す領域の配列決定に基づいて設計されるため、より確実に品種識別可能なプライマーを提供することが可能である。
以上の通り、本発明の遺伝学的品種識別方法に従い、品種間のＤＮＡ配列の違いを遺伝学的手法に基づき比較解析することにより、採取した環境等の影響に左右されず確実にホップの品種を識別することができる。
以下に、本発明の好適な実施の形態をより詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、第二の品種識別プライマー設計方法において、一次プライマー（１種類のプライマー：Ｂ７２）を用いてHallertauer Tradition（ＨＴ）及び信州早生（ＳＷ）のＤＮＡの一部をそれぞれ増幅し、これら増幅断片を電気泳動で分画した分画パターンを示す写真である。
図２は、第１図において矢印で示す約６００ｂｐ付近に泳動された増幅断片の塩基配列を示す図であり、上段にはＨＴ、下段にはＳＷの塩基配列を示す。なお上段のＨＴと対応する位置の塩基が同一の場合には、黒点（・）として示し、両者の対応する位置に塩基置換がある場合にはその塩基を示す。また、両者間で対応する塩基がない、すなわち、欠失部位には、ハイフン（−）として示す。
また、Ｂ７２ＷＦ２として示す枠内には、配列表の配列番号２７に示す品種識別プライマーとして選択した配列を示す。さらに、Ｂ７２ＷＲ２で示す枠内の配列は、配列表の配列番号２８に示す品種識別プライマーの相補配列を示す。
図３は、図２に示したＢ７２ＷＦ２（配列番号２７）とＢ７２ＷＲ２の相補鎖（配列番号２８）とからなる品種識別プライーを用いてＰＣＲを行った際の増幅断片を電気泳動より分画した結果を示す写真である。
図４は、別の多型増幅断片（ＲＡＰＤマーカー）の塩基配列を示す図である。
図５は、さらに別の多型増幅断片（ＲＡＰＤマーカー）の塩基配列を示す図である。
発明を実施するための最良な形態
本発明のホップの品種識別方法は、品種識別プライマーを用いたＰＣＲにより、品種間でＤＮＡ配列の異なる領域すなわち多型領域を増幅し、増幅断片におけるサイズの差または有無の差を解析することにより品種を識別する方法である。
ホップＤＮＡの採取
検体となるホップＤＮＡは、極少量のホップの葉、毬果やホップペレット等から、採取することができる。
ホップＤＮＡの採取方法は、植物個体からＤＮＡを回収する一般的な方法、例えばNucleic Acids Res.,8,4321（1980）等に記載された通常のＤＮＡ抽出方法により行うことができる。より簡便には、市販のBLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて抽出することもできる。このKITの場合、細胞を溶解した後、陰イオン交換樹脂カラムにＤＮＡを吸脱着する操作があるため、反応阻害物質等の混入による問題を解消することができる。
次に本発明に使用し得る品種識別プライマーの設計方法について説明する。
第一の品種識別プライマー設計方法
この設計方法は、ＤＮＡ配列が未知のホップにおいて、品種間の多型領域または配列をＰＣＲにより検出し得るオリゴヌクレオチドを探索できる方法であればどのような方法を使用してもよいが、好適にはＲＡＰＤ法を利用することである。
先ず、ＲＡＰＤ法を行うために、複数種のプライマーからなるプライマー群を用意する。
通常のＲＡＰＤ法に用いるプライマーは、例えばホスホアミダイド法などを用いるＤＮＡ自動合成機によって得ることができ、ランダムに設計された配列であり、その鎖長は６〜４０、好ましくは１０〜２１である。
また、前記Williamsらが開示した塩基配列（Nucleic Acids Research．第18巻，第6531頁、1990年）を利用することも、また、ベックス社製コモンプライマーやOPERRON社製Operon 10-mer Kits等の市販されている合成オリゴヌクレオチドを利用することもできる。
ここで用意したプライマー群のうち１種または２種以上を用いて、複数種のホップＤＮＡに対して、後に詳述する「ＰＣＲ反応」と同様の条件でＰＣＲを行う。次いで、ＰＣＲにより生成された増幅断片を後述する適当な電気泳動ゲル上で分画して、品種間の増幅断片の泳動度を比較する。比較した結果、品種間で増幅断片の有無またはサイズに差異が見られる断片を多型増幅断片（ＲＡＰＤマーカー）とし、この多型増幅断片を生じさせる前記１種または２種のプライマーを前記プライマー群から選択して、品種識別プライマーとする。
このように選択された品種識別プライマーとしては、配列表の配列番号１〜１４に示した塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドがあり、当然のことながら、これら配列の相補配列も使用することができる。また、ＰＣＲ反応において、ホップＤＮＡ中の任意の多型配列を増幅し得るものであれば、配列表の配列番号１〜１４に示した塩基配列を一部に含むオリゴヌクレオチドを品種識別プライマーとして使用することもできる。さらに、ＰＣＲの反応条件によっては、前記合成オリゴヌクレオチドの塩基配列と近似の塩基配列からなるヌクレオチドも使用することができる。
この第一の設計方法に基づくことにより、配列が未知のホップにおいて多型を検出できる品種識別プライマーを簡便に設計することができる。また、この方法で設計された品種識別プライマーは、後述する実施例において示すが品種識別において十分に機能を発揮する。
第二の品種識別プライマー設計方法
第二の品種識別プライマー設計方法は、第一の品種識別プライマー設計方法において、検出された多型増幅断片（ＲＡＰＤマーカー）を常法に従い回収し塩基配列を決定するとともに多型配列を検出する。
ここで決定された多型増幅断片内の配列から、多型配列を含んだ増幅断片を生成し得るような所定間隔離れた位置の配列を選択して、ここで選択された配列に基づき品種識別プライマーを設計する。
品種識別プライマーの設計にあたっては、通常ＰＣＲに至適とされる（「ＰＣＲテクノロジー」，Henry A.Erlich編，宝酒造株式会社発行など）に記載されるようなプライマーを設計すれば良い。
具体的には、ＤＮＡ増幅バンドがサイズの変化を示すものをＲＡＰＤマーカーとして選定した場合は、ＲＡＰＤマーカーの塩基配列中の挿入および／または欠失部位の両側に位置する配列であり、かつ遺伝子の挿入および／または欠失によるサイズの変化を電気泳動において比較し易いサイズの増幅バンドが得られるような配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして選択する。このような品種識別プライマーの１例として、配列表の配列番号２７，２８に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。
ＲＡＰＤマーカーにおけるサイズの変化は、１ｂｐ〜数百ｂｐに及ぶが、識別により好適には１０ｂｐ〜数十ｂｐである。また、サイズ変化がなくても制限酵素等で識別し得る配列置換があればよい。
電気泳動において識別しやすいサイズの変化は、ゲルの種類や濃度によって異なるが、経験的な目安としては、サイズの変化が全長の１割以上あればよい。例えば、挿入配列が２０ｂｐであれば、ＰＣＲ増幅産物の全長は２００ｂｐ以下になるようにプライマーを設計する。従って、この品種識別プライマーを使用したＰＣＲにより、多型に基づくサイズ変化を見分けやすいような増幅断片が得られる。
あるいは、ＲＡＰＤマーカーが同様に品種間で増幅断片がサイズの変化を示す場合、品種識別プライマーは、ＲＡＰＤマーカーの塩基配列中の挿入部位の内部の配列および／または欠失部位をまたぐような位置の配列を有するオリゴヌクレオチドを選択することができる。従って、この品種識別プライマーを使用したＰＣＲにより、挿入および／または欠失を持つ品種において増幅断片が得られる。
また、ＲＡＰＤマーカーが品種によって特定のＤＮＡ増幅バンドの有無が見られる場合は、ＲＡＰＤマーカー内部の塩基配列からポリメラーゼ連鎖反応に最適な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして選択する。このようなプライマーの１例として、配列表の配列番号３５，３６に記載のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
さらに、一次プライマーのアニールする場所のみに多型があることも予想されるため、５′末端に一次プライマーの配列を持ち、それに続いたＲＡＰＤマーカーの塩基配列を５〜２０塩基連結した配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして選択しても良い。例えば、ＲＡＰＤマーカー内部の塩基配列を有するプライマーを用いた際に、全ての品種で同じサイズのＰＣＲ増幅産物が生じた場合は、上記のようにプライマーを設計することにより特異性を高めることができる。具体例としては、配列表の配列番号１５及び１６のプライマーは５′末端に配列表の配列番号１２の配列を有し、それに続く塩基配列（図５参照）を連結した配列としている。ただし、連結すべきＲＡＰＤマーカー内部の塩基配列の部分が短すぎるとＰＣＲにおいて非特異的な増幅バンドが増えるため多型の検出が不可能になる。また、逆に長過ぎると多型の有無にかかわらず全ての品種においてプライマーがアニールしてＰＣＲ産物が生じてしまい、多型の検出が不可能になる。
また、ＲＡＰＤマーカーの塩基配列中に品種識別が可能となるような制限酵素の認識部位が存在する場合は、ＰＣＲ増幅産物を制限酵素で処理して識別することも可能であるので、制限酵素の認識部位を保持したＰＣＲ増幅産物が得られるようにプライマーを設計すればよい。このようなプライマーの１例として、配列表の配列番号３３，３４に記載のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
このようにして設計されたプライマーは、目的の遺伝子（ＲＡＰＤマーカー）のみが増幅するようにＰＣＲを行う際のアニーリング温度を設定できるため、ＤＮＡ増幅バンドの識別が容易で、かつ再現性の良い結果が得られる。
上記のようにして設計されたプライマーを簡便に得るには、合成オリゴヌクレオチドを用いる。本発明に用いる合成オリゴヌクレオチドは、例えばホスホアミダイド法などを用いる市販のＤＮＡ自動合成機によって得ることができる。
この合成オリゴヌクレオチドの鎖長は１５〜４０、好ましくは２０〜３０であり、配列表の配列番号１〜２２に示した塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
上記以外にも、ホップＤＮＡにおいて、配列表の配列番号１５〜４０に示した塩基配列のうちの二種類（例えば配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、…配列番号３５と３６など）の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドが相補する位置に挟まれた前記ホップＤＮＡの塩基配列の一部を有する合成オリゴヌクレオチドを用いることもできる。
上記の通り第二の設計方法において設計された品種識別プライマーは、多型増幅断片すなわち多型配列の周辺の配列に基づき、適格な品種識別ができるように多型領域を増幅し、かつＰＣＲに適当な配列から構成されているため、当該品種識別プライマーを用いることにより正確に品種識別を実行することができる。
ＰＣＲ反応
次に、上記第一または第二設計方法により設計された品種識別プライマーを用いＰＣＲにより、ホップＤＮＡの多型領域の増幅を行う。
上記の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応は、常法に従い、鋳型ＤＮＡの変性工程、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング工程およびプライマーを開始点としたＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイクルを繰り返して行う工程より構成され、例えばSaikiら、Science，第230巻，1350-1354頁等に記載されている。
上記のＰＣＲ反応の諸条件としては、各品種毎に反応チューブを別々にして、この反応チューブに、１種または２種の合成オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）、鋳型ＤＮＡとなる各品種のホップＤＮＡ及び増幅用緩衝液（約１．０ｍＭから約４．０ｍＭ、好ましくは約１．５ｍＭから約３．０ｍＭの塩化マグネシウムや、塩化カリウム、ゼラチン、牛血清アルブミン、界面活性剤（Tween 20,NP-40,Triton X-100など（いずれも商品名）、ジメチルスルホキシド等を含有）を加えて、反応液を調整する。ここで調整した反応液を含む反応チューブを、任意のサーモサイキュラー等に設置して、上記したＤＮＡ複製サイクルを適当な回数、例えば、約２０回から約５０回、好ましくは約２５回から約４０回、繰り返して行う。
ＰＣＲの各反応工程の条件としては、例えば次のように行うことができる。
変性工程は、通常９０℃から９５℃、好ましくは約９４℃から９５℃で約１分間から約３分間、好ましくは約１分間から約２分間加熱することにより行う。
プライマーのアニーリング工程は、通常３０℃から５０℃、好ましくは約３５℃から約４２℃で約１分間から約３分間、好ましくは約１分間から約２分間プライマーとインキュベートすることにより行う。品種識別プライマーは、適当に１種類で、もしくは２種以上組み合わせて用いることができる。
ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理存在下で、通常約７０℃から約７３℃、好ましくは約７２℃から約７３℃で、約１分間から約４分間、好ましくは約２分間から約３分間行う。この耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、PERKIN ELMER社製の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の市販のものを使用することができる。
上記の各工程を繰り返すことにより目的の増幅ＤＮＡを得ることができる。
増幅断片の解析手段
上記の品種識別プライマーを用いたＰＣＲ反応において生成された増幅ＤＮＡは、通常のＤＮＡを分画する方法である電気泳動法によって分画され、その分画パターンに基づいて品種を判定することができる。
電気泳動法は、一般には、１０００塩基対以下の短いＤＮＡ断片を分画する場合、約３％から約２０％のポリアクリルアミドゲルを、それ以上の長いＤＮＡ断片を分画するには、約０．２％から約２％のアガロースゲルを使用することにより適当な分画パターンを得ることができる。
また、電気泳動に用いる緩衝液としては、Tris-リン酸系（ｐＨ７．５〜８．０）、Tris-酢酸系（ｐＨ７．５〜８．０）、Tris-ホウ酸系（ｐＨ７．５〜８．３）等が挙げられ、好ましくはTris-ホウ酸系である。また、必要に応じてＥＤＴＡ等を添加することもできる。
泳動条件としては、泳動槽のサイズにより異なるが、例えば５０〜３００Ｖ、１０〜１２０分間、好ましくは１５０Ｖ、３０分間であり、対照として同時に泳動するサイズマーカーとしては、例えば100 Base-Pair Ladder（Pharmacia社製）等の市販のものを用いることができる。
増幅ＤＮＡは、例えばエチジウムブロマイド等のフェナントリジン系色素で、かつ核酸と相互作用するような物質を用いる染色法によって、視覚的に検出することができる。該染色法は、泳動槽に予め、例えば最終濃度として約０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド等の物質を加えるか、または、泳動後のゲルを約０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１０分から６０分程度漬ける。ここで染色されたゲルに暗所で２５４ｎｍまたは３６６ｎｍの紫外線を照射することによって、泳動パターンは、ＤＮＡにエチジウムブロマイドが結合した赤色バンドとして検出することができる。もちろん、泳動槽に前記染色液を添加した場合、泳動中でもこの泳動パターンが観察することができる。
この電気泳動法以外にも、前記増幅ＤＮＡの有無またはサイズ等を解析できる手段があれば、その方法に置換して解析することもできる。
品種識別
品種識別は、上記において得られた分画パターンに基づき、品種間での分画パターンの比較解析により実行する。この比較解析は、例えば、品種間での所定の増幅ＤＮＡの存在の有無の差またはサイズの差により行う。
増幅ＤＮＡの存在の有無の差は、特定の品種において、ＰＣＲに使用したプライマーがアニーリングする配列（すなわち相補配列）を備えているか否かを示しており、また、増幅ＤＮＡのサイズの差は、品種によっては、ＰＣＲで増幅される領域内に欠失または挿入配列等の多型配列が存在することを示している。
また、より正確な品種識別を行うためには、一回のＰＣＲの結果だけでなく、異なる１種または２種のオリゴヌクレオチドを品種識別プライマーとして使用した場合の増幅断片の分画パターンを解析し照合することが望ましい。
上記以外にも、ＰＣＲにおけるアニーリング工程の温度、反応用緩衝液中のマグネシウム濃度等の諸条件を変化させた場合の挙動を検討することにより、品種同定の精度、品種間の識別能力を向上させることもできる。
本発明のホップの品種識別方法は、上記した一連の操作を行うことにより、正確に品種を識別することができる。
応用
本発明の品種識別方法は、ホップペレット等のホップ製品に用いられているホップの品種の純度検定にも利用することができる。
例えば、標準ホップから得られる増幅ＤＮＡとホップペレットから得られる増幅ＤＮＡとの差異を調べ、その結果標準ホップから得られる増幅ＤＮＡ以外の増幅ＤＮＡが検出された場合、該ホップペレットには他品種が混入していると判断できる。
また、他品種の混入が予想された場合、その際の増幅ＤＮＡの量を、例えば、前記エチジウムブロマイドによる発色の強度によって測定することにより、他品種の混入の程度等の純度を測定することができる。
なお、この場合も本発明の合成オリゴヌクレオチドを２種以上併用することにより、純度検査の精度を高めることができる。
なお、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホップ以外の他の植物（例えば桑、いちぢく、桜等）の品種同定にも適用できることが期待される。近縁種において塩基配列が異なる箇所は、ＤＮＡ中の変異の起こり易い箇所であるので、限定される。例えば、ｒＤＮＡをコードする場所は細菌（大腸菌、乳酸菌）や植物（イネ、オレンジ）の品種識別に利用できることが報告されている。したがって、本発明において、近縁種で差異のあった箇所は他の植物においても品種同定にも適用できるものと思われる。
以上の通り、本発明の品種識別方法は、品種間の配列の多型に基づいて解析するものであるため、環境的な影響を受けずに正確にホップの品種を識別することができる。また、本発明の品種識別方法は、品種識別の目的だけでなく製品中の各ホップの品種の純度をも測定することができるため、純度検定にも利用することができる。
実施例
まず、第一の品種識別プライマー設計方法により設計された品種識別プライマーを用いたホップの品種識別を実施例１から１２に示す。
実施例１
ゲノムＤＮＡの抽出
ホップ品種として、Brewer,s Gold（以下、品種番号１と記す）、Northern Brewer（以下、品種番号２と記す）、Tettnanger（以下、品種番号３と記す）、Saazer（以下、品種番号４と記す）、Hersbrucker spaet（以下、品種番号５と記す）、Spalter select（以下、品種番号６と記す）、Hallertauer tradition（以下、品種番号７と記す）、信州早生（以下、品種番号８と記す）、フラノエース（以下、品種番号９と記す）を用いた。
上記の各種ホップ品種の緑葉組織（生重量１ｇ）を細かく切り刻んで、該組織片を液体窒素中に浸し、凍結させた。該凍結物をポリトロンを用いて液体窒素中で粉末状にした後、得られた粉末５０ｍｇをBLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて、プロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。
その結果、最終的に、各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを１０〜２０μｇ得た。
実施例２
プライマーとして３３ピコモルの配列番号１および２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチド（サワディー・テクノロジー社製委託製造物）を用いて１ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（和光純薬製）、２０ナノモルの４種類の塩基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）および実施例１で調製した０．１μｇの各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを加えた。５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％Triton X-100を含有する１０ｍＭ Tris-塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応液量は３０μｌとし、反応液の蒸発を防ぐために約２０μｌのミネラルオイルを添加した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応における各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で３分間保持した後、変性工程は９４℃で１分間加熱し、プライマーのアニーリング工程は３５℃で１分間インキュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、７２℃で２分間耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理するサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保持後、４℃で保存した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた増幅ゲノムＤＮＡは、５％のポリアクリルアミドゲルを用いて、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ Tris-ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１５０Ｖ、３０分間電気泳動して分離した。その際に、サイズマーカーとしては100 Base-Pair Ladder （Pharmacia社製）を用いた。
電気泳動終了後にゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１０分間浸漬してから暗所で２５４ｎｍの紫外線をゲルに照射することによって、ＤＮＡとエチジウムブロマイドの結合体の赤色バンドを検出した。得られた結果を第１表に示した。
表から明らかなように、プライマーとして配列番号１および２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約５２０ｂｐ、約５３０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例３
プライマーとして配列番号３および４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を４０℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第１表に示した。
プライマーとして配列番号３および４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約７５０ｂｐ、約８５０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを４タイプに識別することができた。
実施例４
プライマーとして配列番号５および６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を４０℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第１表に示した。
プライマーとして配列番号５および６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約２７０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例５
プライマーとして配列番号７および８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第１表に示した。
プライマーとして配列番号７および８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約３７０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例６
プライマーとして配列番号９に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を４０℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第１表に示した。
プライマーとして配列番号９に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約９５０ｂｐ、約１２００ｂｐの２種類のの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを３タイプに識別することができた。
実施例７
プライマーとして配列番号１０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第２表に示した。
プライマーとして配列番号１０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約６５０ｂｐ、約７００ｂｐ、約１２００ｂｐの３種類のの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを４タイプに識別することができた。
実施例８
プライマーとして配列番号１１に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第２表に示した。
プライマーとして配列番号１１に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約１４００ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例９
プライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第２表に示した。
プライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約５５０ｂｐ、約８００ｂｐの２種類のの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを４タイプに識別することができた。
実施例１０
プライマーとして配列番号１３に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第３表に示した。
プライマーとして配列番号１３に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約５００ｂｐ、６４０ｂｐ、６５０ｂｐ、１４００ｂｐの４種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを５タイプに識別することができた。
実施例１１
プライマーとして配列番号１４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第３表に示した。
プライマーとして配列番号１４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約５４０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例１２
品種番号８の品種として販売されているホップペレット（サッポロビール株式会社委託岩手県北ホップ農業協同組合製）を乳鉢で粉砕し、得られた粉末２０ｍｇから、BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて、プロトコールに従いゲノムＤＮＡを約５μｇ抽出した。得られたＤＮＡを用いて、プライマーとして配列番号１，２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例２に準じて実施した。
検出される増幅ゲノムＤＮＡと品種番号８の標準ホップより得た増幅ゲノムＤＮＡとの差異を調べ、純度を検査した。
次に、第二の品種識別プライマー設計方法により設計された品種識別プライマーを用いたホップの品種識別を実施例１３から３０に示す。
実施例１３
ゲノムＤＮＡの抽出
ホップ品種として、Hallertauer tradition（以下、ＨＴと記す）、信州早生（以下、ＳＷと記す）を用いた。
上記の各種ホップ品種の緑葉組織（生重量１ｇ）を細かく切り刻んで、該組織片を液体窒素中に浸し、凍結させた。該凍結物をポリトロンを用いて液体窒素中で粉末状にした後、得られた粉末５０ｍｇをBLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて、プロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。
その結果、最終的に、各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを１０〜２０μｇ得た。
実施例１４
ＲＡＰＤマーカーの選択
プライマーとして０．３４μＭのプライマーＢ７２（図２参照）を用いた。
さらに、０．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン社製）、２００μＭの４種類の各塩基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）および実施例１３で調製した１７．５ｎｇの各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを加えた、５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．１％Triton X-100を含有する１０ｍＭ Tris-塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応液量は１０μｌとした。
上記のポリメラーゼ連鎖反応における各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で１分間保持した後、変性工程は９４℃で３０秒間加熱し、プライマーのアニーリング工程は３３℃で１分間インキュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、７２℃で３０秒間処理するサイクルを３５回行い、７２℃で１分間保持した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた増幅ゲノムＤＮＡは、５％のポリアクリルアミドゲルを用いて、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ Tris−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１５０Ｖ，３０分間電気泳動して分離した。その際に、サイズマーカーとしては、ニッポンジーン社製マーカー９を用いた。
電気泳動終了後にゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１０分間浸漬してから暗所で２５４ｎｍの紫外線をゲルに照射することによって、ＤＮＡとエチジウムブロマイドの結合体の赤色バンドを検出した。得られた結果を図１に示した。
図１から、矢印で示した位置のバンドのサイズがＨＴとＳＷで異なることがわかる。この矢印で示した位置のバンドをＲＡＰＤマーカーとした。
実施例１５
実施例１４で調製したＲＡＰＤマーカーを電気泳動ゲルから切り出し、透析チューブに入れて電圧をかけ、ゲルから溶出させた。
得られたＲＡＰＤマーカーを「ＰＣＲテクノロジー」（Henry A.Erlich編，宝酒造株式会社発行）に記載の方法に準じて、制限酵素ＢｇｌIIやＰｓｔＩの認識配列を付加した。この制限酵素認識配列を利用してｐＵＣプラスミドへサブクローニングした後、ダイデオキシ法によって塩基配列を決定し、図２に示した。なお、図中の・は上段と同一の塩基を示し、−は塩基の欠失を示す。また、下線部はプライマーＢ７２の塩基配列であり、□で囲んだ塩基配列は後記実施例１６で参照した塩基配列を示す。
こうして各バンドのシーケンスを行った結果、図２に示したように、ＳＷにおいて３２ｂｐの塩基配列の挿入が観察された。
実施例１６
実施例１５で得られたＲＡＰＤマーカーのうち、図２に示した□で囲んだ塩基配列Ｂ７２ＷＦ２を参照して得られた配列表の配列番号２７記載の塩基配列およびＢ７２ＷＲ２の相補的な配列から得られた配列表の配列番号２８記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを設計した（サワディー・テクノロジー社に製造を委託）。
これら合成オリゴヌクレオチドをプライマーセットとして０．３４μＭを用い、０．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン社製）、２００μＭの４種類の（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）および実施例１３で調製した１７．５ｎｇの各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを加えた５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％Triton X-100を含有する１０ｍＭ Tris−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中でＰＣＲを行った。反応液量は１０μＬとした。
上記のＰＣＲにおける各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で１分間保持した後、変性工程は９４℃で３０秒間加熱し、プライマーのアニーリング工程は６０℃で１分間インキュベートし、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、７２℃で３０秒間処理するサイクルを３５回行った。
上記のＰＣＲにより得られた増幅ゲノムＤＮＡは、５％のポリアクリルアミドゲルを用いて、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ Tris−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１５０Ｖ、３０分間電気泳動して分離した。その際に、サイズマーカーとしてはニッポンジーン社製マーカー９を用いた。
電気泳動終了後にゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１０分間浸漬してから暗所で２５４ｎｍの紫外線をゲルに照射することによって、ＤＮＡとエチジウムブロマイドの結合体の赤色バンドを検出した。得られた結果を図３に示した。
また、他の品種についても、同様に実施し、結果を図３に示した。他の品種としては、Fuggle（FU）,Cascade（CC）,Brewer′s Gold（BG）,Northern Brewer（NB）,Tettnanger（TE）,Saazer（SA）,Hersbrucker spaet（HE）,Perle（PE）,Spalter select（SS），フラノエース（FA）を用いた。
図から明らかなように、挿入部位を含む３２９ｂｐのフラグメント（矢印）の増幅が、ＢＧ，ＮＢ，ＴＥ，ＳＷ，ＦＡにおいて観察された。また、挿入部位を含まない２９９ｂｐのフラグメントが全ての品種において観察された。また、６００ｂｐ、７００ｂｐ、７１０ｂｐの品種特異的なフラグメントの増幅が観察された。これらのフラグメントは識別しやすく、再現性よく観察された。
実施例１７
プライマーとして配列番号１５および１６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１６と同様の条件で実施した。得られた結果を第４表に示す。
表から明らかなように、プライマーとして配列番号１５および１６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約５００ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例１８
プライマーとして配列番号１７および１８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を６２℃で行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号１７および１８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約２６０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例１９
プライマーとして配列番号１９および２０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を６５℃で行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号１９および２０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約５００ｂｐと約５５０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２０
プライマーとして配列番号２１および２２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いたこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号２１および２２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約７１０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２１
プライマーとして配列番号２３および２４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号２３および２４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約３３０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２２
プライマーとして配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲを行った後、さらに反応液１μｌを鋳型ＤＮＡとして先のＰＣＲと同じ条件で２０サイクル行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約１６０ｂｐと約２００ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２３
プライマーとして配列番号２９および３０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を５７℃で行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。プライマーとして配列番号２９および３０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約３５０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２４
プライマーとして配列番号３１および３２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつ２度のＰＣＲを行った後、さらにこの反応液を制限酵素Ｎ１ａＩＩＩ（第一化学薬品株式会社製）にて処理したこと以外は、実施例２２と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号３１および３２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約２２０ｂｐと約３６０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを４タイプに識別することができた。
実施例２５
プライマーとして配列番号３３および３４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を６７℃で行い、さらにこの反応液を制限酵素ＴａｑＩ（ベーリンガーマンハイム社製）にて処理したこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号３３および３４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約２２０ｂｐと約２７０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを３タイプに識別することができた。
実施例２６
プライマーとして配列番号３５および３６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を５８℃で３０サイクル行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号３５および３６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約４００ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２７
プライマーとして３３ピコモルのベックス社製コモンプライマー（A25;5′-GGTCAGGCACCA-3′）を用いて実施例１４と同様にＰＣＲ及び電気泳動を行った結果、約200から2000bpに渡って十数本の増幅ゲノムバンドが検出され、そのうち、品種によって増幅の有無が観察された約500bpのバンドをＲＡＰＤマーカーとした。このマーカーの塩基配列を調べたところ図４に示す結果が得られた。
図４において四角で囲んだ配列Ａ及びＢで示した配列に基づく配列番号１９及び２０、図４において下線Ｃ及びＤにて示した配列に基づく３７及び３８の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを設計した。これらプライマーの設計方法は、３７及び３８は請求項の範囲８の方法に相当し、５及び６は請求項の範囲１２の方法に相当する。
プライマーとして１９及び２０の場合はアニーリング工程を65℃で35サイクル、３７及び３８の場合は60℃で30サイクル行った以外は、実施例１６と同様に実施した結果、プライマーとして１９及び２０を用いた場合は第１表に示したような５００ｂｐと５５０ｂｐのバンドが、プライマーとして３７と３８を用いた場合は４５９ｂｐの増幅ゲノムバンドが観察され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２８
プライマーとして３３ピコモルのベックス社製コモンプライマー（C16;5′-CGCCCTGCAGTA-3′）を用いて実施例１４と同様にＰＣＲ及び電気泳動を行った結果、約200から2000bpに渡って十数本の増幅ゲノムバンドが検出され、そのうち、品種によって増幅の有無が観察された約500bpのバンドをＲＡＰＤマーカーとした。このマーカーの塩基配列を調べたところ図５に示す結果が得られた。
図５において四角で囲んだＡ及びＢで示す配列をもとに配列番号１５及び１６、図５において下線Ｃ及びＢにて示した配列をもとに３９及び４０の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを設計した。
プライマーとして、３９及び４０を用いて60℃で35サイクル行った結果、全ての品種において約500bpの増幅ゲノムバンドが観察され、品種の識別はできなかったが、プライマーとして、１５及び１６を用いて同様に実施した結果、第４表に示したような増幅ゲノムバンドが観察され、そのバンドの有無により１１品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２９
実施例１６〜２８において行ったタイプ分けをまとめた第４表を総合的に評価することにより、１２種類全てのホップ品種を識別することが可能となった。
なお、フラグメントサイズを記載したものは品種識別の基準となるもので、制限酵素処理したものは（ ）で示した。
実施例３０
ホップ品種として信州早生（ＳＷ）のホップペレット（サッポロビール株式会社委託岩手県北ホップ農業協同組合製）を乳鉢で粉砕し、得られた粉末２０ｍｇから、BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて、プロトコールに従いゲノムＤＮＡを約５μｇ程度抽出した。得られたＤＮＡを用いて、プライマーとして配列番号１５〜４０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例２９に準じて純度を検査した。
この際に、非特異的な増幅バンドの出現が少なく、目的とするマーカーを容易に見極めることができた。また、再度の純度検定においても、再現性の高い結果が得られた。
産業上の利用性
本発明の遺伝学的品種識別方法によれば、環境等の影響に左右されずにホップの品種識別を正確かつ簡便に行うことができる。また、本発明の遺伝学的品種識別方法は、ホップを原料とする製品の純度検定にも有効に利用することができる。
従って、本発明の遺伝学的品種識別方法は、ホップの品種識別などを通じて、ホップを含む製品における一定の品質の維持または品質の向上を図ることができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：８
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：９
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１０
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１１
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１２
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１３
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１４
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１５
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１６
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１８
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：１９
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２１
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２２
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２３
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２４
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２５
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２８
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：２９
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３１
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３２
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３３
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３４
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３５
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３６
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３７
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３８
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：３９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列番号：４０
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
本発明は、ホップの品種識別方法、特に遺伝子工学技術を利用した品種識別方法に関する。
背景技術
ホップは、ビールに独特な芳香と苦味を与えると共に、過剰なタンパク質を沈殿・分離させたり、雑菌の繁殖を抑える等の作用を有している。しかし、これらの作用の程度等は、主にホップの品種によって差異があるため、一定の品質のビールの製造や新たなビールの開発にはホップの品種を識別した上で使用する必要がある。
このホップの品種識別方法としては、従来、ホップの含有成分、例えば苦味成分（α酸／β酸cohumulone/humulone,colupulone/lupulone）、精油成分（farnesene,caryophyllene）差異に基づいて行っていた。
しかしながら、上記の苦味成分や精油成分の差異による識別方法は、各種成分の測定に多大な労力を必要とする上に、同一品種であっても収穫の地域や年度により各種成分が大きく変動することから、上記方法では正確な品種判定が行えなかった。
一方、近年の遺伝子工学の進歩により、生物種によっては染色体等の配列の解明が試みられ、ここで解明された塩基配列に基づき、生物種間または同一生物の品種間での遺伝情報の差異、すなわち、ＤＮＡ配列の多型から種の識別が行われようとしていている。このような多型に基づく品種の識別は、ＤＮＡ配列自身が環境的な影響を受けにくく変化することが殆どないため、確実なる識別を行うことができる。
そこで、本発明は、上記のような遺伝学的な手法を用いて、正確かつ簡便なホップの品種識別方法を提供する。
発明の開示
本発明のホップの品種識別方法は、品種間のＤＮＡ配列の違いすなわち多型に基づき、この多型を遺伝学的な手法で検出して識別する方法であり、詳細には、被検体であるホップのＤＮＡのうち品種間で多型を含む領域を品種識別プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという）により増幅し、この増幅ＤＮＡを解析することにより品種を識別する。
上記の方法を達成するためには、ホップにおける品種間のＤＮＡ配列上の多型を知る必要がある。
この多型とは、具体的には、挿入、欠失、置換などに由来する配列上の編成の違いを含み、また、多型に関与する配列の長さは１ｂｐであってもよく、または数十ｂｐ以上であってもよいが、望ましくは数ｂｐから数十ｂｐである。
上記のような品種間の配列上の多型を検出する方法としては、品種毎に染色体ＤＮＡの対応する部分の配列を決定し、ここで決定した配列を比較解析して、多型を検出することもできるが、より簡便には、Williamsら（Nucleic Acids Research．第18巻，第6531頁、1990年）により開発されたＲＡＰＤ（Random amplified polymorphic DNA）法を利用することができる。
このＲＡＰＤ法は、配列が未知のＤＮＡ間の多型をＰＣＲを利用して検出する方法である。詳細には、比較的短い１０塩基程度の合成オリゴヌクレオチドからなる特異性の低いプライマーを複数種の対象ＤＮＡとそれぞれ混合して、ＰＣＲを行う。もしも、ここで前記ホップのＤＮＡの配列中に混合したプライマーと完全にまたは部分的に相補する配列がある場合には、この完全または部分相補配列とアニールし、プライマー同士に挟まれた領域が増幅される。そして、種間でこのプライマー同士に挟まれた領域の中にＤＮＡの挿入や欠失等の配列の差異がある場合には、種間で異なるサイズのＰＣＲ増幅断片が得られる。また、一方の品種にはプライマーがアニールする配列があり、他方には無い場合、一方の品種のみにＰＣＲ増幅断片が得られる。これを電気泳動等で分画することがで多型を検出することができる。
一方、上記ＲＡＰＤ法は、上記のように本発明における多型を検出する方法以外にも、ＰＣＲにより多型を検出し得るプライマーを選択する方法、すなわち、プライマー設計方法としても利用することができる。
従って、上記ＲＡＰＤ法に基づき検出されるホップＤＮＡの品種間のいかなる多型領域も本発明の対象に含まれる。また、上記ＲＡＰＤ法に基づき検出される多型領域を増幅し得るいかなるプライマーも本発明の品種識別プライマーとして利用することができる。
上記方法に基づき開発される本発明の品種識別プライマーは、１種類の合成オリゴヌクレオチドであっても、または２種以上の合成オリゴヌクレオチドであってもよい。また、この合成オリゴヌクレオチドの所定の鎖長は６〜４０、好ましくは１０〜２１であり、具体的には、配列表の配列番号１〜１４に示した塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
本発明の品種識別プライマーを設計する第二番目の方法としては、以下の工程からなる方法が含まれる。
この設計方法は、先ず、品種識別プライマー（例えば先のＰＡＰＤ法に基づき検出される多型領域を増幅し得るプライマー、以下一次プライマーという）を用いたポリメラーゼ連鎖方法により得られた増幅断片の塩基配列を決定するとともに多型配列を決定する。最終的に、この多型配列を一次プライマーより再現性良くかつ識別し易いような増幅断片を生成し得るように前記多型配列断片内の所定間隔離れた位置の配列とそれぞれ相補する２種の品種識別プライマーを設計して合成する。
すなわち、上記方法は、多型配列及びその周辺の配列に基づき好適な品種識別プライマーを選択して設計することができる。
また、上記の一次プライマーとしては、配列表の配列番号１〜１４に示した塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することができる。
例えば、第一の品種識別プライマーの配列としては、２種のプライマーの一方または両方を前記多型配列の全部又は一部を含むように設計することができる。
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、選択された多型配列を備えた品種では、相補配列を有することからＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きて一定の増幅ＤＮＡが得られ、一方当該多型配列を有していない品種では、相補する配列を有していないため、ＰＣＲを行っても増幅ＤＮＡは生じないことになる。従って、この場合には、増幅断片の有無により品種を識別することが可能となる。
第二の品種識別プライマーの配列として、２種のプライマーが前記多型配列の上流域と下流域のそれぞれに位置するうよに設計することができる。
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、ＰＣＲにより品種間で内部の塩基配列の、場合によってはサイズの異なる増幅ＤＮＡが生成される。ここで生成された増幅ＤＮＡを直接電気泳動により分画するか、または必要に応じて制限酵素で消化した後電気泳動により分画あるいは変性勾配ゲルや温度勾配ゲル電気泳動の泳動パターン等により品種を識別することができる。
第三品種識別プライマーの配列としては、５′末端に一次プライマーの配列を備え、それに続いた該多型領域の塩基配列を５〜２０塩基連結した配列を有するように設計することができる。
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、例えば一次プライマーが相補する位置に多型配列が存在する場合に有用である。すなわち、一次プライマーにさらにそれに続く塩基配列を５〜２０塩基付加することにより、一次プライマーに比して、より特異的に前記多型配列を検出することができるようになる。
さらに、上記設計方法により設計された品種識別プライマーであれば、上記特徴を有する配列以外のいかなるものも、ホップの品種識別プライマーとして好適に使用することができる。
前記方法により設計された品種識別プライマーとして、具体的には配列表の配列番号１５〜４０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドまたはその一部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを適当に２種組み合わせて使用することができる。
また、上記配列以外にも品種識別プライマーとして、配列表の配列番号１５（１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９）に記載の塩基配列がゲノムＤＮＡにアニールする部位と配列番号１６（１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０）に記載の塩基配列がゲノムＤＮＡにアニールする部位の間に存在するゲノムＤＮＡの塩基配列の一部を有する合成オリゴヌクレオチドを用いることもできる。
上記の通り構成された第二の品種識別プライマーの設計方法によれば、多型を示す領域の配列決定に基づいて設計されるため、より確実に品種識別可能なプライマーを提供することが可能である。
以上の通り、本発明の遺伝学的品種識別方法に従い、品種間のＤＮＡ配列の違いを遺伝学的手法に基づき比較解析することにより、採取した環境等の影響に左右されず確実にホップの品種を識別することができる。
以下に、本発明の好適な実施の形態をより詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、第二の品種識別プライマー設計方法において、一次プライマー（１種類のプライマー：Ｂ７２）を用いてHallertauer Tradition（ＨＴ）及び信州早生（ＳＷ）のＤＮＡの一部をそれぞれ増幅し、これら増幅断片を電気泳動で分画した分画パターンを示す写真である。
図２は、第１図において矢印で示す約６００ｂｐ付近に泳動された増幅断片の塩基配列を示す図であり、上段にはＨＴ、下段にはＳＷの塩基配列を示す。なお上段のＨＴと対応する位置の塩基が同一の場合には、黒点（・）として示し、両者の対応する位置に塩基置換がある場合にはその塩基を示す。また、両者間で対応する塩基がない、すなわち、欠失部位には、ハイフン（−）として示す。
また、Ｂ７２ＷＦ２として示す枠内には、配列表の配列番号２７に示す品種識別プライマーとして選択した配列を示す。さらに、Ｂ７２ＷＲ２で示す枠内の配列は、配列表の配列番号２８に示す品種識別プライマーの相補配列を示す。
図３は、図２に示したＢ７２ＷＦ２（配列番号２７）とＢ７２ＷＲ２の相補鎖（配列番号２８）とからなる品種識別プライーを用いてＰＣＲを行った際の増幅断片を電気泳動より分画した結果を示す写真である。
図４は、別の多型増幅断片（ＲＡＰＤマーカー）の塩基配列を示す図である。
図５は、さらに別の多型増幅断片（ＲＡＰＤマーカー）の塩基配列を示す図である。
発明を実施するための最良な形態
本発明のホップの品種識別方法は、品種識別プライマーを用いたＰＣＲにより、品種間でＤＮＡ配列の異なる領域すなわち多型領域を増幅し、増幅断片におけるサイズの差または有無の差を解析することにより品種を識別する方法である。
ホップＤＮＡの採取
検体となるホップＤＮＡは、極少量のホップの葉、毬果やホップペレット等から、採取することができる。
ホップＤＮＡの採取方法は、植物個体からＤＮＡを回収する一般的な方法、例えばNucleic Acids Res.,8,4321（1980）等に記載された通常のＤＮＡ抽出方法により行うことができる。より簡便には、市販のBLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて抽出することもできる。このKITの場合、細胞を溶解した後、陰イオン交換樹脂カラムにＤＮＡを吸脱着する操作があるため、反応阻害物質等の混入による問題を解消することができる。
次に本発明に使用し得る品種識別プライマーの設計方法について説明する。
第一の品種識別プライマー設計方法
この設計方法は、ＤＮＡ配列が未知のホップにおいて、品種間の多型領域または配列をＰＣＲにより検出し得るオリゴヌクレオチドを探索できる方法であればどのような方法を使用してもよいが、好適にはＲＡＰＤ法を利用することである。
先ず、ＲＡＰＤ法を行うために、複数種のプライマーからなるプライマー群を用意する。
通常のＲＡＰＤ法に用いるプライマーは、例えばホスホアミダイド法などを用いるＤＮＡ自動合成機によって得ることができ、ランダムに設計された配列であり、その鎖長は６〜４０、好ましくは１０〜２１である。
また、前記Williamsらが開示した塩基配列（Nucleic Acids Research．第18巻，第6531頁、1990年）を利用することも、また、ベックス社製コモンプライマーやOPERRON社製Operon 10-mer Kits等の市販されている合成オリゴヌクレオチドを利用することもできる。
ここで用意したプライマー群のうち１種または２種以上を用いて、複数種のホップＤＮＡに対して、後に詳述する「ＰＣＲ反応」と同様の条件でＰＣＲを行う。次いで、ＰＣＲにより生成された増幅断片を後述する適当な電気泳動ゲル上で分画して、品種間の増幅断片の泳動度を比較する。比較した結果、品種間で増幅断片の有無またはサイズに差異が見られる断片を多型増幅断片（ＲＡＰＤマーカー）とし、この多型増幅断片を生じさせる前記１種または２種のプライマーを前記プライマー群から選択して、品種識別プライマーとする。
このように選択された品種識別プライマーとしては、配列表の配列番号１〜１４に示した塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドがあり、当然のことながら、これら配列の相補配列も使用することができる。また、ＰＣＲ反応において、ホップＤＮＡ中の任意の多型配列を増幅し得るものであれば、配列表の配列番号１〜１４に示した塩基配列を一部に含むオリゴヌクレオチドを品種識別プライマーとして使用することもできる。さらに、ＰＣＲの反応条件によっては、前記合成オリゴヌクレオチドの塩基配列と近似の塩基配列からなるヌクレオチドも使用することができる。
この第一の設計方法に基づくことにより、配列が未知のホップにおいて多型を検出できる品種識別プライマーを簡便に設計することができる。また、この方法で設計された品種識別プライマーは、後述する実施例において示すが品種識別において十分に機能を発揮する。
第二の品種識別プライマー設計方法
第二の品種識別プライマー設計方法は、第一の品種識別プライマー設計方法において、検出された多型増幅断片（ＲＡＰＤマーカー）を常法に従い回収し塩基配列を決定するとともに多型配列を検出する。
ここで決定された多型増幅断片内の配列から、多型配列を含んだ増幅断片を生成し得るような所定間隔離れた位置の配列を選択して、ここで選択された配列に基づき品種識別プライマーを設計する。
品種識別プライマーの設計にあたっては、通常ＰＣＲに至適とされる（「ＰＣＲテクノロジー」，Henry A.Erlich編，宝酒造株式会社発行など）に記載されるようなプライマーを設計すれば良い。
具体的には、ＤＮＡ増幅バンドがサイズの変化を示すものをＲＡＰＤマーカーとして選定した場合は、ＲＡＰＤマーカーの塩基配列中の挿入および／または欠失部位の両側に位置する配列であり、かつ遺伝子の挿入および／または欠失によるサイズの変化を電気泳動において比較し易いサイズの増幅バンドが得られるような配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして選択する。このような品種識別プライマーの１例として、配列表の配列番号２７，２８に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。
ＲＡＰＤマーカーにおけるサイズの変化は、１ｂｐ〜数百ｂｐに及ぶが、識別により好適には１０ｂｐ〜数十ｂｐである。また、サイズ変化がなくても制限酵素等で識別し得る配列置換があればよい。
電気泳動において識別しやすいサイズの変化は、ゲルの種類や濃度によって異なるが、経験的な目安としては、サイズの変化が全長の１割以上あればよい。例えば、挿入配列が２０ｂｐであれば、ＰＣＲ増幅産物の全長は２００ｂｐ以下になるようにプライマーを設計する。従って、この品種識別プライマーを使用したＰＣＲにより、多型に基づくサイズ変化を見分けやすいような増幅断片が得られる。
あるいは、ＲＡＰＤマーカーが同様に品種間で増幅断片がサイズの変化を示す場合、品種識別プライマーは、ＲＡＰＤマーカーの塩基配列中の挿入部位の内部の配列および／または欠失部位をまたぐような位置の配列を有するオリゴヌクレオチドを選択することができる。従って、この品種識別プライマーを使用したＰＣＲにより、挿入および／または欠失を持つ品種において増幅断片が得られる。
また、ＲＡＰＤマーカーが品種によって特定のＤＮＡ増幅バンドの有無が見られる場合は、ＲＡＰＤマーカー内部の塩基配列からポリメラーゼ連鎖反応に最適な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして選択する。このようなプライマーの１例として、配列表の配列番号３５，３６に記載のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
さらに、一次プライマーのアニールする場所のみに多型があることも予想されるため、５′末端に一次プライマーの配列を持ち、それに続いたＲＡＰＤマーカーの塩基配列を５〜２０塩基連結した配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして選択しても良い。例えば、ＲＡＰＤマーカー内部の塩基配列を有するプライマーを用いた際に、全ての品種で同じサイズのＰＣＲ増幅産物が生じた場合は、上記のようにプライマーを設計することにより特異性を高めることができる。具体例としては、配列表の配列番号１５及び１６のプライマーは５′末端に配列表の配列番号１２の配列を有し、それに続く塩基配列（図５参照）を連結した配列としている。ただし、連結すべきＲＡＰＤマーカー内部の塩基配列の部分が短すぎるとＰＣＲにおいて非特異的な増幅バンドが増えるため多型の検出が不可能になる。また、逆に長過ぎると多型の有無にかかわらず全ての品種においてプライマーがアニールしてＰＣＲ産物が生じてしまい、多型の検出が不可能になる。
また、ＲＡＰＤマーカーの塩基配列中に品種識別が可能となるような制限酵素の認識部位が存在する場合は、ＰＣＲ増幅産物を制限酵素で処理して識別することも可能であるので、制限酵素の認識部位を保持したＰＣＲ増幅産物が得られるようにプライマーを設計すればよい。このようなプライマーの１例として、配列表の配列番号３３，３４に記載のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
このようにして設計されたプライマーは、目的の遺伝子（ＲＡＰＤマーカー）のみが増幅するようにＰＣＲを行う際のアニーリング温度を設定できるため、ＤＮＡ増幅バンドの識別が容易で、かつ再現性の良い結果が得られる。
上記のようにして設計されたプライマーを簡便に得るには、合成オリゴヌクレオチドを用いる。本発明に用いる合成オリゴヌクレオチドは、例えばホスホアミダイド法などを用いる市販のＤＮＡ自動合成機によって得ることができる。
この合成オリゴヌクレオチドの鎖長は１５〜４０、好ましくは２０〜３０であり、配列表の配列番号１〜２２に示した塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
上記以外にも、ホップＤＮＡにおいて、配列表の配列番号１５〜４０に示した塩基配列のうちの二種類（例えば配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、…配列番号３５と３６など）の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドが相補する位置に挟まれた前記ホップＤＮＡの塩基配列の一部を有する合成オリゴヌクレオチドを用いることもできる。
上記の通り第二の設計方法において設計された品種識別プライマーは、多型増幅断片すなわち多型配列の周辺の配列に基づき、適格な品種識別ができるように多型領域を増幅し、かつＰＣＲに適当な配列から構成されているため、当該品種識別プライマーを用いることにより正確に品種識別を実行することができる。
ＰＣＲ反応
次に、上記第一または第二設計方法により設計された品種識別プライマーを用いＰＣＲにより、ホップＤＮＡの多型領域の増幅を行う。
上記の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応は、常法に従い、鋳型ＤＮＡの変性工程、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング工程およびプライマーを開始点としたＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイクルを繰り返して行う工程より構成され、例えばSaikiら、Science，第230巻，1350-1354頁等に記載されている。
上記のＰＣＲ反応の諸条件としては、各品種毎に反応チューブを別々にして、この反応チューブに、１種または２種の合成オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）、鋳型ＤＮＡとなる各品種のホップＤＮＡ及び増幅用緩衝液（約１．０ｍＭから約４．０ｍＭ、好ましくは約１．５ｍＭから約３．０ｍＭの塩化マグネシウムや、塩化カリウム、ゼラチン、牛血清アルブミン、界面活性剤（Tween 20,NP-40,Triton X-100など（いずれも商品名）、ジメチルスルホキシド等を含有）を加えて、反応液を調整する。ここで調整した反応液を含む反応チューブを、任意のサーモサイキュラー等に設置して、上記したＤＮＡ複製サイクルを適当な回数、例えば、約２０回から約５０回、好ましくは約２５回から約４０回、繰り返して行う。
ＰＣＲの各反応工程の条件としては、例えば次のように行うことができる。
変性工程は、通常９０℃から９５℃、好ましくは約９４℃から９５℃で約１分間から約３分間、好ましくは約１分間から約２分間加熱することにより行う。
プライマーのアニーリング工程は、通常３０℃から５０℃、好ましくは約３５℃から約４２℃で約１分間から約３分間、好ましくは約１分間から約２分間プライマーとインキュベートすることにより行う。品種識別プライマーは、適当に１種類で、もしくは２種以上組み合わせて用いることができる。
ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理存在下で、通常約７０℃から約７３℃、好ましくは約７２℃から約７３℃で、約１分間から約４分間、好ましくは約２分間から約３分間行う。この耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、PERKIN ELMER社製の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の市販のものを使用することができる。
上記の各工程を繰り返すことにより目的の増幅ＤＮＡを得ることができる。
増幅断片の解析手段
上記の品種識別プライマーを用いたＰＣＲ反応において生成された増幅ＤＮＡは、通常のＤＮＡを分画する方法である電気泳動法によって分画され、その分画パターンに基づいて品種を判定することができる。
電気泳動法は、一般には、１０００塩基対以下の短いＤＮＡ断片を分画する場合、約３％から約２０％のポリアクリルアミドゲルを、それ以上の長いＤＮＡ断片を分画するには、約０．２％から約２％のアガロースゲルを使用することにより適当な分画パターンを得ることができる。
また、電気泳動に用いる緩衝液としては、Tris-リン酸系（ｐＨ７．５〜８．０）、Tris-酢酸系（ｐＨ７．５〜８．０）、Tris-ホウ酸系（ｐＨ７．５〜８．３）等が挙げられ、好ましくはTris-ホウ酸系である。また、必要に応じてＥＤＴＡ等を添加することもできる。
泳動条件としては、泳動槽のサイズにより異なるが、例えば５０〜３００Ｖ、１０〜１２０分間、好ましくは１５０Ｖ、３０分間であり、対照として同時に泳動するサイズマーカーとしては、例えば100 Base-Pair Ladder（Pharmacia社製）等の市販のものを用いることができる。
増幅ＤＮＡは、例えばエチジウムブロマイド等のフェナントリジン系色素で、かつ核酸と相互作用するような物質を用いる染色法によって、視覚的に検出することができる。該染色法は、泳動槽に予め、例えば最終濃度として約０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド等の物質を加えるか、または、泳動後のゲルを約０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１０分から６０分程度漬ける。ここで染色されたゲルに暗所で２５４ｎｍまたは３６６ｎｍの紫外線を照射することによって、泳動パターンは、ＤＮＡにエチジウムブロマイドが結合した赤色バンドとして検出することができる。もちろん、泳動槽に前記染色液を添加した場合、泳動中でもこの泳動パターンが観察することができる。
この電気泳動法以外にも、前記増幅ＤＮＡの有無またはサイズ等を解析できる手段があれば、その方法に置換して解析することもできる。
品種識別
品種識別は、上記において得られた分画パターンに基づき、品種間での分画パターンの比較解析により実行する。この比較解析は、例えば、品種間での所定の増幅ＤＮＡの存在の有無の差またはサイズの差により行う。
増幅ＤＮＡの存在の有無の差は、特定の品種において、ＰＣＲに使用したプライマーがアニーリングする配列（すなわち相補配列）を備えているか否かを示しており、また、増幅ＤＮＡのサイズの差は、品種によっては、ＰＣＲで増幅される領域内に欠失または挿入配列等の多型配列が存在することを示している。
また、より正確な品種識別を行うためには、一回のＰＣＲの結果だけでなく、異なる１種または２種のオリゴヌクレオチドを品種識別プライマーとして使用した場合の増幅断片の分画パターンを解析し照合することが望ましい。
上記以外にも、ＰＣＲにおけるアニーリング工程の温度、反応用緩衝液中のマグネシウム濃度等の諸条件を変化させた場合の挙動を検討することにより、品種同定の精度、品種間の識別能力を向上させることもできる。
本発明のホップの品種識別方法は、上記した一連の操作を行うことにより、正確に品種を識別することができる。
応用
本発明の品種識別方法は、ホップペレット等のホップ製品に用いられているホップの品種の純度検定にも利用することができる。
例えば、標準ホップから得られる増幅ＤＮＡとホップペレットから得られる増幅ＤＮＡとの差異を調べ、その結果標準ホップから得られる増幅ＤＮＡ以外の増幅ＤＮＡが検出された場合、該ホップペレットには他品種が混入していると判断できる。
また、他品種の混入が予想された場合、その際の増幅ＤＮＡの量を、例えば、前記エチジウムブロマイドによる発色の強度によって測定することにより、他品種の混入の程度等の純度を測定することができる。
なお、この場合も本発明の合成オリゴヌクレオチドを２種以上併用することにより、純度検査の精度を高めることができる。
なお、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホップ以外の他の植物（例えば桑、いちぢく、桜等）の品種同定にも適用できることが期待される。近縁種において塩基配列が異なる箇所は、ＤＮＡ中の変異の起こり易い箇所であるので、限定される。例えば、ｒＤＮＡをコードする場所は細菌（大腸菌、乳酸菌）や植物（イネ、オレンジ）の品種識別に利用できることが報告されている。したがって、本発明において、近縁種で差異のあった箇所は他の植物においても品種同定にも適用できるものと思われる。
以上の通り、本発明の品種識別方法は、品種間の配列の多型に基づいて解析するものであるため、環境的な影響を受けずに正確にホップの品種を識別することができる。また、本発明の品種識別方法は、品種識別の目的だけでなく製品中の各ホップの品種の純度をも測定することができるため、純度検定にも利用することができる。
実施例
まず、第一の品種識別プライマー設計方法により設計された品種識別プライマーを用いたホップの品種識別を実施例１から１２に示す。
実施例１
ゲノムＤＮＡの抽出
ホップ品種として、Brewer,s Gold（以下、品種番号１と記す）、Northern Brewer（以下、品種番号２と記す）、Tettnanger（以下、品種番号３と記す）、Saazer（以下、品種番号４と記す）、Hersbrucker spaet（以下、品種番号５と記す）、Spalter select（以下、品種番号６と記す）、Hallertauer tradition（以下、品種番号７と記す）、信州早生（以下、品種番号８と記す）、フラノエース（以下、品種番号９と記す）を用いた。
上記の各種ホップ品種の緑葉組織（生重量１ｇ）を細かく切り刻んで、該組織片を液体窒素中に浸し、凍結させた。該凍結物をポリトロンを用いて液体窒素中で粉末状にした後、得られた粉末５０ｍｇをBLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて、プロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。
その結果、最終的に、各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを１０〜２０μｇ得た。
実施例２
プライマーとして３３ピコモルの配列番号１および２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチド（サワディー・テクノロジー社製委託製造物）を用いて１ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（和光純薬製）、２０ナノモルの４種類の塩基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）および実施例１で調製した０．１μｇの各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを加えた。５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％Triton X-100を含有する１０ｍＭ Tris-塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応液量は３０μｌとし、反応液の蒸発を防ぐために約２０μｌのミネラルオイルを添加した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応における各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で３分間保持した後、変性工程は９４℃で１分間加熱し、プライマーのアニーリング工程は３５℃で１分間インキュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、７２℃で２分間耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理するサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保持後、４℃で保存した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた増幅ゲノムＤＮＡは、５％のポリアクリルアミドゲルを用いて、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ Tris-ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１５０Ｖ、３０分間電気泳動して分離した。その際に、サイズマーカーとしては100 Base-Pair Ladder （Pharmacia社製）を用いた。
電気泳動終了後にゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１０分間浸漬してから暗所で２５４ｎｍの紫外線をゲルに照射することによって、ＤＮＡとエチジウムブロマイドの結合体の赤色バンドを検出した。得られた結果を第１表に示した。
表から明らかなように、プライマーとして配列番号１および２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約５２０ｂｐ、約５３０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
プライマーとして配列番号３および４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を４０℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第１表に示した。
プライマーとして配列番号３および４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約７５０ｂｐ、約８５０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを４タイプに識別することができた。
実施例４
プライマーとして配列番号５および６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を４０℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第１表に示した。
プライマーとして配列番号５および６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約２７０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例５
プライマーとして配列番号７および８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第１表に示した。
プライマーとして配列番号７および８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約３７０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例６
プライマーとして配列番号９に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を４０℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第１表に示した。
プライマーとして配列番号９に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約９５０ｂｐ、約１２００ｂｐの２種類のの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを３タイプに識別することができた。
実施例７
プライマーとして配列番号１０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第２表に示した。
プライマーとして配列番号１０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約６５０ｂｐ、約７００ｂｐ、約１２００ｂｐの３種類のの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを４タイプに識別することができた。
プライマーとして配列番号１１に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第２表に示した。
プライマーとして配列番号１１に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約１４００ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例９
プライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第２表に示した。
プライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約５５０ｂｐ、約８００ｂｐの２種類のの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを４タイプに識別することができた。
実施例１０
プライマーとして配列番号１３に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第３表に示した。
プライマーとして配列番号１３に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約５００ｂｐ、６４０ｂｐ、６５０ｂｐ、１４００ｂｐの４種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを５タイプに識別することができた。
プライマーとして配列番号１４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーのアニーリング工程を３８℃で行ったこと以外は、実施例２と同様に実施した。結果を第３表に示した。
プライマーとして配列番号１４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約５４０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により９品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例１２
品種番号８の品種として販売されているホップペレット（サッポロビール株式会社委託岩手県北ホップ農業協同組合製）を乳鉢で粉砕し、得られた粉末２０ｍｇから、BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて、プロトコールに従いゲノムＤＮＡを約５μｇ抽出した。得られたＤＮＡを用いて、プライマーとして配列番号１，２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例２に準じて実施した。
検出される増幅ゲノムＤＮＡと品種番号８の標準ホップより得た増幅ゲノムＤＮＡとの差異を調べ、純度を検査した。
次に、第二の品種識別プライマー設計方法により設計された品種識別プライマーを用いたホップの品種識別を実施例１３から３０に示す。
実施例１３
ゲノムＤＮＡの抽出
ホップ品種として、Hallertauer tradition（以下、ＨＴと記す）、信州早生（以下、ＳＷと記す）を用いた。
上記の各種ホップ品種の緑葉組織（生重量１ｇ）を細かく切り刻んで、該組織片を液体窒素中に浸し、凍結させた。該凍結物をポリトロンを用いて液体窒素中で粉末状にした後、得られた粉末５０ｍｇをBLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて、プロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。
その結果、最終的に、各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを１０〜２０μｇ得た。
実施例１４
ＲＡＰＤマーカーの選択
プライマーとして０．３４μＭのプライマーＢ７２（図２参照）を用いた。
さらに、０．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン社製）、２００μＭの４種類の各塩基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）および実施例１３で調製した１７．５ｎｇの各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを加えた、５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．１％Triton X-100を含有する１０ｍＭ Tris-塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応液量は１０μｌとした。
上記のポリメラーゼ連鎖反応における各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で１分間保持した後、変性工程は９４℃で３０秒間加熱し、プライマーのアニーリング工程は３３℃で１分間インキュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、７２℃で３０秒間処理するサイクルを３５回行い、７２℃で１分間保持した。
上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた増幅ゲノムＤＮＡは、５％のポリアクリルアミドゲルを用いて、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ Tris−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１５０Ｖ，３０分間電気泳動して分離した。その際に、サイズマーカーとしては、ニッポンジーン社製マーカー９を用いた。
電気泳動終了後にゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１０分間浸漬してから暗所で２５４ｎｍの紫外線をゲルに照射することによって、ＤＮＡとエチジウムブロマイドの結合体の赤色バンドを検出した。得られた結果を図１に示した。
図１から、矢印で示した位置のバンドのサイズがＨＴとＳＷで異なることがわかる。この矢印で示した位置のバンドをＲＡＰＤマーカーとした。
実施例１５
実施例１４で調製したＲＡＰＤマーカーを電気泳動ゲルから切り出し、透析チューブに入れて電圧をかけ、ゲルから溶出させた。
得られたＲＡＰＤマーカーを「ＰＣＲテクノロジー」（Henry A.Erlich編，宝酒造株式会社発行）に記載の方法に準じて、制限酵素ＢｇｌIIやＰｓｔＩの認識配列を付加した。この制限酵素認識配列を利用してｐＵＣプラスミドへサブクローニングした後、ダイデオキシ法によって塩基配列を決定し、図２に示した。なお、図中の・は上段と同一の塩基を示し、−は塩基の欠失を示す。また、下線部はプライマーＢ７２の塩基配列であり、□で囲んだ塩基配列は後記実施例１６で参照した塩基配列を示す。
こうして各バンドのシーケンスを行った結果、図２に示したように、ＳＷにおいて３２ｂｐの塩基配列の挿入が観察された。
実施例１６
実施例１５で得られたＲＡＰＤマーカーのうち、図２に示した□で囲んだ塩基配列Ｂ７２ＷＦ２を参照して得られた配列表の配列番号２７記載の塩基配列およびＢ７２ＷＲ２の相補的な配列から得られた配列表の配列番号２８記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを設計した（サワディー・テクノロジー社に製造を委託）。
これら合成オリゴヌクレオチドをプライマーセットとして０．３４μＭを用い、０．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン社製）、２００μＭの４種類の（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）および実施例１３で調製した１７．５ｎｇの各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを加えた５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％Triton X-100を含有する１０ｍＭ Tris−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中でＰＣＲを行った。反応液量は１０μＬとした。
上記のＰＣＲにおける各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で１分間保持した後、変性工程は９４℃で３０秒間加熱し、プライマーのアニーリング工程は６０℃で１分間インキュベートし、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、７２℃で３０秒間処理するサイクルを３５回行った。
上記のＰＣＲにより得られた増幅ゲノムＤＮＡは、５％のポリアクリルアミドゲルを用いて、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ Tris−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１５０Ｖ、３０分間電気泳動して分離した。その際に、サイズマーカーとしてはニッポンジーン社製マーカー９を用いた。
電気泳動終了後にゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１０分間浸漬してから暗所で２５４ｎｍの紫外線をゲルに照射することによって、ＤＮＡとエチジウムブロマイドの結合体の赤色バンドを検出した。得られた結果を図３に示した。
また、他の品種についても、同様に実施し、結果を図３に示した。他の品種としては、Fuggle（FU）,Cascade（CC）,Brewer′s Gold（BG）,Northern Brewer（NB）,Tettnanger（TE）,Saazer（SA）,Hersbrucker spaet（HE）,Perle（PE）,Spalter select（SS），フラノエース（FA）を用いた。
図から明らかなように、挿入部位を含む３２９ｂｐのフラグメント（矢印）の増幅が、ＢＧ，ＮＢ，ＴＥ，ＳＷ，ＦＡにおいて観察された。また、挿入部位を含まない２９９ｂｐのフラグメントが全ての品種において観察された。また、６００ｂｐ、７００ｂｐ、７１０ｂｐの品種特異的なフラグメントの増幅が観察された。これらのフラグメントは識別しやすく、再現性よく観察された。
実施例１７
プライマーとして配列番号１５および１６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１６と同様の条件で実施した。得られた結果を第４表に示す。
表から明らかなように、プライマーとして配列番号１５および１６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約５００ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例１８
プライマーとして配列番号１７および１８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を６２℃で行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号１７および１８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約２６０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例１９
プライマーとして配列番号１９および２０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を６５℃で行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号１９および２０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約５００ｂｐと約５５０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２０
プライマーとして配列番号２１および２２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いたこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号２１および２２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約７１０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２１
プライマーとして配列番号２３および２４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号２３および２４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約３３０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２２
プライマーとして配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲを行った後、さらに反応液１μｌを鋳型ＤＮＡとして先のＰＣＲと同じ条件で２０サイクル行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約１６０ｂｐと約２００ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２３
プライマーとして配列番号２９および３０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を５７℃で行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。プライマーとして配列番号２９および３０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、約３５０ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２４
プライマーとして配列番号３１および３２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつ２度のＰＣＲを行った後、さらにこの反応液を制限酵素Ｎ１ａＩＩＩ（第一化学薬品株式会社製）にて処理したこと以外は、実施例２２と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号３１および３２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約２２０ｂｐと約３６０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを４タイプに識別することができた。
実施例２５
プライマーとして配列番号３３および３４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を６７℃で行い、さらにこの反応液を制限酵素ＴａｑＩ（ベーリンガーマンハイム社製）にて処理したこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号３３および３４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約２２０ｂｐと約２７０ｂｐの２種類の増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを３タイプに識別することができた。
実施例２６
プライマーとして配列番号３５および３６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、かつＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング工程を５８℃で３０サイクル行ったこと以外は、実施例１６と同様に実施した。結果を第４表に示した。
プライマーとして配列番号３５および３６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合、約４００ｂｐの増幅ゲノムバンドが検出され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２７
プライマーとして３３ピコモルのベックス社製コモンプライマー（A25;5′-GGTCAGGCACCA-3′）を用いて実施例１４と同様にＰＣＲ及び電気泳動を行った結果、約200から2000bpに渡って十数本の増幅ゲノムバンドが検出され、そのうち、品種によって増幅の有無が観察された約500bpのバンドをＲＡＰＤマーカーとした。このマーカーの塩基配列を調べたところ図４に示す結果が得られた。
図４において四角で囲んだ配列Ａ及びＢで示した配列に基づく配列番号１９及び２０、図４において下線Ｃ及びＤにて示した配列に基づく３７及び３８の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを設計した。これらプライマーの設計方法は、３７及び３８は請求項の範囲８の方法に相当し、５及び６は請求項の範囲１２の方法に相当する。
プライマーとして１９及び２０の場合はアニーリング工程を65℃で35サイクル、３７及び３８の場合は60℃で30サイクル行った以外は、実施例１６と同様に実施した結果、プライマーとして１９及び２０を用いた場合は第１表に示したような５００ｂｐと５５０ｂｐのバンドが、プライマーとして３７と３８を用いた場合は４５９ｂｐの増幅ゲノムバンドが観察され、そのバンドの有無により１２品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２８
プライマーとして３３ピコモルのベックス社製コモンプライマー（C16;5′-CGCCCTGCAGTA-3′）を用いて実施例１４と同様にＰＣＲ及び電気泳動を行った結果、約200から2000bpに渡って十数本の増幅ゲノムバンドが検出され、そのうち、品種によって増幅の有無が観察された約500bpのバンドをＲＡＰＤマーカーとした。このマーカーの塩基配列を調べたところ図５に示す結果が得られた。
図５において四角で囲んだＡ及びＢで示す配列をもとに配列番号１５及び１６、図５において下線Ｃ及びＢにて示した配列をもとに３９及び４０の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを設計した。
プライマーとして、３９及び４０を用いて60℃で35サイクル行った結果、全ての品種において約500bpの増幅ゲノムバンドが観察され、品種の識別はできなかったが、プライマーとして、１５及び１６を用いて同様に実施した結果、第４表に示したような増幅ゲノムバンドが観察され、そのバンドの有無により１１品種のホップを２タイプに識別することができた。
実施例２９
実施例１６〜２８において行ったタイプ分けをまとめた第４表を総合的に評価することにより、１２種類全てのホップ品種を識別することが可能となった。
なお、フラグメントサイズを記載したものは品種識別の基準となるもので、制限酵素処理したものは（ ）で示した。
ホップ品種として信州早生（ＳＷ）のホップペレット（サッポロビール株式会社委託岩手県北ホップ農業協同組合製）を乳鉢で粉砕し、得られた粉末２０ｍｇから、BLOOD AND CELL CULTURE DNA KIT（QIAGEN社製）を用いて、プロトコールに従いゲノムＤＮＡを約５μｇ程度抽出した。得られたＤＮＡを用いて、プライマーとして配列番号１５〜４０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例２９に準じて純度を検査した。
この際に、非特異的な増幅バンドの出現が少なく、目的とするマーカーを容易に見極めることができた。また、再度の純度検定においても、再現性の高い結果が得られた。
産業上の利用性
本発明の遺伝学的品種識別方法によれば、環境等の影響に左右されずにホップの品種識別を正確かつ簡便に行うことができる。また、本発明の遺伝学的品種識別方法は、ホップを原料とする製品の純度検定にも有効に利用することができる。
従って、本発明の遺伝学的品種識別方法は、ホップの品種識別などを通じて、ホップを含む製品における一定の品質の維持または品質の向上を図ることができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２０
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配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
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配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２８
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配列
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
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配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
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配列
配列の長さ：２４
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配列
配列の長さ：２４
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配列
配列の長さ：２１
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配列
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配列
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配列
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
Claims (1)
- 被検体であるホップのＤＮＡを、品種間における塩基配列上の多型を含む領域を増幅し得るように設計された品種識別プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記多型領域を増幅し、増幅ＤＮＡ断片を解析することにより品種を識別する遺伝学的品種識別方法であって、
品種識別プライマーが、配列表の配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０、配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４、配列番号３５及び３６、又は、配列番号３７及び３８、の塩基配列からなるプライマー対である、遺伝学的品種識別方法。
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