CN1152139C

CN1152139C - 啤酒花遗传变种的鉴定方法

Info

Publication number: CN1152139C
Application number: CNB961908289A
Authority: CN
Inventors: ��ľï; 荒木茂树; ��һ; 土屋阳一
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1996-07-26
Publication date: 2004-06-02
Anticipated expiration: 2016-07-26
Also published as: DE69632520T2; CA2201127A1; US5948650A; AU6531796A; AU707253B2; CZ98697A3; EP0785281A4; JP4097288B2; SK41797A3; EP0785281B1; CN1159212A; DK0785281T3; CZ296930B6; EP0785281A1; SK284231B6; CA2201127C; WO1997005281A1; DE69632520D1

Abstract

本发明描述了一种以啤酒花变种遗传序列中的多态性为基础的鉴定啤酒花变种的方法。具体来说，使用设计的鉴定引物通过聚合酶链式反应来扩增啤酒花DNA的多态性区域，并分析扩增的DNA片段，其中所述的鉴定引物设计能够扩增包含在不同变种的碱基序列中的多态性区域。以这种方式，可以简单而准确地鉴定啤酒花变种。

Description

啤酒花遗传变种的鉴定方法

发明领域

本发明涉及一种鉴定啤酒花变种的方法，具体来说，涉及一种利用遗传工程技术的鉴定方法。

发明背景

啤酒花使啤酒具有独特的芳香和苦味，并且还有助于沉淀过量的蛋白质，抑制细菌的增殖。但是，因为啤酒花以此种方式起作用的程度主要随其变种而改变，因此为了制造质量稳定的啤酒和开发新型啤酒有必要鉴定啤酒花的变种。

啤酒花鉴定的传统方法基于其组成成分，例如，苦味成分(α酸/β酸共葎草酮/葎草酮，共葎果酮/葎果酮)和香精油成分(法呢烯，丁子香烯)。

但是，这种以苦味和精油为基础的鉴定方法除了需要大量精力测量所有的成分外，它还不能精确测定变种，因为即使是同种变种，根据收获的地点和时间的不同这些成分变化很大。

由于遗传工程的最新进展，人们进行了各种各样的努力试图阐明植物物种的染色体的序列，并以所发现的碱基序列为基础，根据不同植物或同一植物的不同变种之间的遗传信息的差异，即DNA序列的多态性，来鉴定品种。

这种以多态性为基础的植物变种的鉴定是可靠的，因为DNA序列本身不易受环境的影响，并因此是稳定的。

考虑到这些原因，本发明提供一种利用上述的遗传技术鉴定啤酒花的可靠而简单的方法。

发明描述

本发明的鉴定啤酒花变种的方法是检测以变种之间DNA序列差异为基础的这种多态性。具体来说，使用一个鉴定引物通过聚合酶链式反应(此后用PCR表示)扩增显示多态性的啤酒花DNA序列，然后通过分析这种扩增的DNA来鉴定变种。

本发明提供了一种用于鉴定啤酒花植物品种的随机扩增多态性DNA方法，包括：

(a)提供一个啤酒花植物品种和一个用于扩增该品种啤酒花植物DNA中的多态性特征区域的引物，所述引物包含选自由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：40组成的一组的一种核苷酸序列，或者所述引物包含一种包含前述选定的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列；

(b)从所述品种分离DNA；

(c)用所述DNA和所述引物进行聚合酶链反应；

(d)确定所述聚合酶链反应是否产生一DNA分子；和

(e)鉴定所述品种是否产生该DNA分子，或者鉴定所述品种是否不产生该DNA分子。

为了使用上述方法，有必要理解啤酒花变种之间DNA的多态性。

术语多态性具体包括因插入，缺失或取代引起的遗传序列的不同。所涉及的序列长度可能是1bp，或几十个bp或更多，但优选是从几个bp到几十个bp。

这种变种之间的序列多态性可以通过测定与每个变种的染色体DNA相对应的序列，然后进行序列的比较分析来检测。但是更简单的方法是使用Williams等(Nucleic AcidsResearch，Vol.19，0.6531，1990)改进的RAPD(随机扩增多态性DNA)技术。

这种RAPD技术使用PCR方法检测未知DNA序列之间的多态性。具体来说，将包括一个约10个碱基的相对较短的合成寡聚核苷酸的低特异性引物与多种DNA类型混合，然后进行PCR。

当啤酒花的DNA序列包括一个与引物完全或部分互补的序列时，此引物与此完全或部分互补的序列退火，引物之间界定的部分就被合成并扩增。当引物之间界定的部分的DNA中存在诸如插入或缺失的序列差异时，即获得了依赖于变种的不同大小的PCR扩增片段。另外，当一个变种包含与引物退火的序列而另一个变种不含与引物退火的序列时，只有第一个变种可以获得PCR扩增片段。然后可以通过分离，如通过电泳，来检测此多态性。

RAPD方法不仅可以用于检测上面描述的本发明的多态性，还可以用于选择可以通过PCR方法检测多态性的引物，即作为一种引物设计方法。

因此，本发明进一步提供了一种构建用于鉴定啤酒花植物品种的引物的随机扩增多态性DNA方法，其包括：

(a)提供一个啤酒花植物品种和一种用于扩增该品种啤酒花植物DNA中的多态性特征区域的第一引物，所述第一引物包含选自由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：14组成的一组的一种核苷酸序列，或者所述第一引物包含一种包含选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：14组成的一组的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列；

(b)从所述品种分离DNA；

(c)用所述DNA和所述第一引物进行聚合酶链反应，以产生一DNA分子；

(d)确定所述DNA分子的序列；和

(e)构建一种第二引物，该第二引物包含一种选自由SEQ ID NO：15至SEQ IDNO：40组成的一组的核苷酸序列或包含一种包含选自由SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：40组成的一组的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列，从而构建所述用于鉴定啤酒花品种的引物。

本发明的方法使用了所有通过RAPD方法检测的啤酒花变种DNA中的多态性区域。另外，根据本发明，所有可以扩增由RAPD方法检测出的多态性区域的引物都可以用作鉴定引物。

通过上述方法产生的本发明的鉴定引物可以是一种类型的合成寡聚核苷酸，或两种或多种类型的合成寡聚核苷酸。

这种合成寡聚核苷酸的长度范围是6-40，优选是10-21。具体来说，使用包括序列表的SEQ.ID No.：1-14所示的碱基序列的寡聚核苷酸是很方便的。

根据本发明，设计鉴定引物的第二种方法包括下列步骤。

这种方法首先测定使用一个鉴定引物(如可以扩增通过上述RAPD方法检测的多态性区域的一个引物，此后表示为原始引物(primary primer))通过聚合酶链式方法获得的扩增片段的碱基序列。最后，合成两个相应地互补于上面的多态性序列片段的预定间隔的位置的鉴定引物，以高效且简单地产生一个可以使多态性序列被原始引物鉴定的扩增片段。

换而言之，根据上面的方法，可以以多态性序列和周围序列为基础选择性地设计鉴定引物。

上述的原始引物可以是一个包括序列表的SEQ.ID Nos：1-14中描述的碱基序列的寡聚核苷酸。

例如，可以如此设计第一种鉴定引物的序列，以便使一个引物或两个引物均包括上述多态性序列的全部或部分。

当通过上述的引物进行品种鉴定并使用一个包括所选的多态性序列的品种时，因为此品种包含互补序列，所以DNA扩增因PCR而发生，并获得特异性扩增DNA。另一方面，当使用不含多态性序列的品种时，因为此品种不含互补序列，所以即使进行PCR也不能产生扩增的DNA。因此在这种情况下，有可能根据此扩增片段的存在与否来鉴定品种。

可以如此设计第二种鉴定引物的序列以使两种类型的引物相应地位于多态性序列的上游和下游。

当使用上面的鉴定引物进行品种鉴定时，通过PCR可以产生根据品种不同而具有不同的内部碱基序列并有时是不同大小的扩增DNA。然后通过使用电泳，如果必要在用限制酶消化后进行电泳，变性梯度凝胶电泳或温度梯度凝胶电泳分离扩增的DNA，根据迁移带型来鉴定品种。

可以如此设计第三种鉴定引物的序列以在其5’端包括一个原始引物的序列，以及与这一序列相连的包括相互连接的5-20个碱基的多态性区域的碱基序列。当例如在与原始引物互补的位置存在一个多态性序列时，使用这种鉴定引物进行品种鉴定是很有用的。换而言之，在原始引物上接上5-20碱基的序列比单独使用原始引物检测多态性序列有更高的特异性。

另外，任何不包括这种类型序列的鉴定引物也可以方便地用作啤酒花鉴定引物，条件是其根据上面的方法设计。

具体来说，根据上面的方法设计的鉴定引物可以是一个包括序列表的SEQ.ID Nos.15-40中描述的碱基序列的合成寡聚核苷酸，或者如果需要，两个合成寡聚核苷酸的适当组合(每个包括这种碱基序列的一部分)。

另外，鉴定引物可以是包括基因组DNA碱基序列的一部分的合成寡聚核苷酸，此基因组DNA碱基序列的一部分位于SEQ.ID No：15(17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39)的碱基序列与基因组DNA退火的位置和SEQ.ID No：16(18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40)的碱基序列与基因组DNA退火的位置之间。

根据这种设计第二鉴定引物的方法(即以这种组成)，有可能测定显示多态性的一个区域的碱基序列，并因此本方法提供了一个可以更加可靠地鉴定品种的引物。

以这种方式，根据本发明的品种鉴定方法在遗传技术的基础上通过进行品种间DNA的比较分析，可以可靠地鉴定啤酒花品种而不受收获环境的任何影响。

现在，将以具体的实施例为参考对本发明进行更为详细的描述，但是应该明白本发明绝不仅限于这些实施例。

附图简述

图1是显示当根据第二种鉴定引物设计方法使用一个原始引物(引物的一种：B72)分别扩增Hallertauer Tradition(HT)和Shinshu Wase(SW)的DNA的一部分并将扩增的片段进行电泳获得的迁移带型的照片。

图2是显示图1中用箭头指示的进行电泳的约600bp的扩增片段的碱基序列的图解；上面一组显示HT的碱基序列，下面一组显示SW的碱基序列。与上面一组中的HT相对应的位置上相同的碱基用一个黑点(·)表示，在HT和SW相对应的位置上存在碱基取代的位置，显示了碱基。在两种类型相对应的位置无碱基的位置，即缺失位置，用减号(-)指示。

标记为B72WF2的封闭框架含选作鉴定引物的如序列表的SEQ.ID No：27中描述的碱基序列。标记为B72WR2的封闭框架含序列表的SEQ.ID No：28中描述的碱基序列，其为鉴定引物的互补序列。

图3是显示当使用一个包括图2所示的B72WF2(SEQ.ID No：27)和B72WR2(SEQ.IDNo：28)的互补序列的鉴定引物进行PCR时分离扩增片段的电泳结果的照片。

图4是显示另一个多态性扩增片段(RAPD标记)的碱基序列的图示。

图5是显示又一个多态性扩增片段(RAPD标记)的碱基序列的图示。

实施方案的详细描述

在本发明的啤酒花品种鉴定方法中，通过PCR方法使用鉴定引物扩增多态性区域，即在不同啤酒花变种中DNA序列不同的DNA部分，通过分析扩增片段之间的不同来鉴定品种。

啤酒花DNA的收集

研究用的啤酒花DNA可以从少量的啤酒花叶，球果和饼中收集。

可以通过通常用于从植物样品中回收DNA的任何方法收集啤酒花DNA，例如Nucleic Acids Res.，8，4321(1980)中提供的典型的DNA抽提方法，或使用商品BLOODAND CELL CULTURE DNA KIT(QIAGEN Inc.)更为简单地进行抽提。当使用试剂盒时，将DNA吸收于一个阴离子交换树脂柱上并回收，所以可以解决由可能影响反应的物质的掺入引起的问题。

现在将要描述本发明可以使用的设计鉴定引物的一些方法。

第一种鉴定引物设计方法

为了设计引物，可以使用任何寻找通过PCR检测不同变种中的多态性区域或序列的寡聚核苷酸的方法，但RAPD方法尤为方便。

为了进行RAPD方法，首先制备一组包括多种引物的引物组。

使用例如磷酰胺技术用DNA自动合成试剂盒可以获得普通RAPD方法中使用的引物。它们具有随机序列，其长度为6-40聚体或优选为10-21聚体。

还可以使用Williams等(Nucleic Acids Research，Vol.18，p.6531，1990)披露的碱基序列，Beck’s通用引物或OPERON公司制造的Operon 10-mer Kits中的商品寡聚核苷酸。然后，在与下面描述的“PCR反应”相同的条件下，使用上面制备的引物组中的一个或多个引物对不同类型的啤酒花DNA进行PCR。

接下来，由PCR扩增的片段在适当的电泳凝胶上进行分离，比较品种间的扩增片段的迁移程度。

作为上述比较的结果，将发现在品种间不同或大小不同的扩增片段作为多态性扩增片段(RAPD标记)，从上面引物组中选出产生这些片段的一个或多个引物用作鉴定引物。

以这种方式选择的鉴定引物的例子是包括序列表的SEQ.ID Nos：1-14中描述的碱基序列的合成寡聚核苷酸，当然这些序列也可以用作互补序列。包括序列表SEQ.ID Nos：1-14显示的碱基序列的一部分的任何寡聚核苷酸可以用作PCR反应中的鉴定引物，条件是它可以扩增任何所需的啤酒花DNA多态性序列。另外，根据PCR的反应条件，任何包括与上述合成寡聚核苷酸相似的碱基序列的核苷酸也可以使用。

这种第一设计方法使设计可以检测含有未知序列的啤酒花中的多态性的鉴定引物变得更加容易。还有，正如在下面实施例中所显示的，通过这种方法设计的鉴定引物很好地发挥了其作用。

第二种鉴定引物设计方法

第二种鉴定引物设计方法测定在第一种鉴定引物设计方法中检测的多态性扩增片段(RAPD标记)的碱基序列并检测多态性序列。

从此处测定的多态性扩增片段序列中选择可以产生包含多态性序列的扩增片段的序列作为鉴定引物。

可以设计在PCR中经常引用的”PCR technology”，ed.Henry A.Erlich，Takara ShuzoCo.，Ltd.中列出的引物。

具体来说，当从DNA扩增片段中选择引物序列显示与RAPD标记一样的大小变化时，选择包括位于RAPD标记碱基序列中插入或缺失的两侧的序列的寡聚核苷酸。

这种鉴定引物的一个例子是包括序列表的SEQ.ID Nos.27，28中描述的碱基序列的寡聚核苷酸的组合。

RAPD标记的大小变化是从1bp到几百个bp，但10bp到几十个bp的范围对鉴定更为方便。即使没有大小变化也存在可以被限制酶等鉴定的碱基取代。

可以容易地被电泳区分的大小变化依赖于所用凝胶的类型和浓度，但是总的说来，它可以是全长的1/10或更多。例如，设计引物以使当插入序列为20bp时，扩增产物的全长为200bp或更少。因此通过用这种类型的鉴定引物进行PCR，获得使因多态性引起的大小变化容易区分的扩增片段。

或者，当扩增片段在品种间显示大小变化时，可以选择包括插入位点的内部序列和在跨接缺失位点位置的序列的寡聚核苷酸。因此，通过用这种类型的鉴定引物进行PCR，获得具有插入和/或缺失的变种的扩增片段。

当RAPD标记可以鉴定依赖于品种的特定DNA扩增片段是否存在时，从RAPD标记的内部碱基序列中选择包括对聚合酶链式反应最适的序列的寡聚核苷酸作为引物。这样一种引物的例子是包括序列表的SEQ.ID Nos：35，36中描述的碱基序列的寡聚核苷酸。

另外，当只是在原始引物退火的位置存在多态性时，可以选择在5’末端包括原始引物序列和包括5-20个碱基长的RAPD标记碱基序列的合成寡聚核苷酸。

例如，当使用一个包括RAPD标记的内部碱基序列的引物并且所有的变种产生同样大小的PCR扩增产物时，通过这种方式设计引物可以增强特异性。作为一个具体的例子，包括序列表的SEQ.ID Nos：15和16中描述的碱基序列的引物还可以在5’末端包括连接其上的序列表的SEQ.ID No：12中描述的碱基序列(图5)。但是，当被连接的RAPD标记中的碱基序列太短时，PCR中非特异性扩增条带增加，使得多态性的检测不可能进行。另一方面，当它太长时，不管多态性存在与否，引物与每个品种退火并产生PCR产物，多态性的检测同样不可能进行。

当在RAPD标记碱基序列中存在可以用于变种鉴定的限制酶识别位点时，可以如此设计引物以获得保留这些酶识别位点的PCR扩增产物。这种引物的例子是包括序列表的SEQ.ID Nos：33，34中描述的碱基序列的寡聚核苷酸。

当以这种方式设计引物时，可以调整进行PCR的退火温度以便只扩增目标片段(RAPD标记)。因此DNA扩增条带的鉴定就更容易，并可获得高可靠性的结果。

合成寡聚核苷酸提供了一种获得以上述方式设计的引物的简单方法。本发明中使用的合成寡聚核苷酸可以用例如磷酰胺方法，使用商品DNA自动合成仪获得。

这种寡聚核苷酸的链长为15-40，但优选为20-30。可以方便地使用包括序列表的SEQ.ID Nos：1-40中描述的任一碱基序列的寡聚核苷酸。

除了上述外，在互补于包括序列表的SEQ.ID Nos：15-40所述的碱基序列中的两种碱基序列(如15和16，17和18，…35和36等等)的其他合成寡聚核苷酸的位置之间包括啤酒花DNA碱基序列的一部分的合成寡聚核苷酸也可以使用。

根据上述的第二引物设计方法的鉴定引物扩增多态性区域以进行基于多态性扩增片段即多态性序列周围的序列的合适的鉴定，并且根据第二引物设计方法的鉴定引物还包括适于PCR的序列。因此使用这些引物可以进行精确的品种鉴定。

PCR反应

接下来，使用根据上面的第一和第二设计方法设计的鉴定引物通过PCR扩增啤酒花DNA中的多态性区域。

PCR反应由，例如，Saiki et.al，Science，vol.230，p.1350-1354披露。具体来说，反应包括下列步骤：变性模板DNA步骤，引物与模板DNA退火步骤和进行DNA复制循环步骤，其包括以引物为起点通过DNA聚合酶的延伸步骤。

通过在一个分离的反应小管中处理每个品种进行PCR反应。通过加入一种或两种合成寡聚核苷酸，DNA聚合酶，4种脱氧核糖核苷酸(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，作为模板DNA的每种啤酒花变种的DNA，和扩增缓冲溶液(包括约1.0μM到约4.0μM但优选约1.5μM到约3.0μM的氯化镁，氯化钾，明胶，牛血清白蛋白，一种表面活性剂(如Tween 20，NP-40，Triton X-100(均为商品名))，和二甲亚砜)来制备反应溶液。含有此反应溶液的反应管安装在热循环仪上，进行适当数量的上述DNA复制循环，如约20个循环到约50个循环但优选是约25个循环到约40个循环。

可以在，例如，下列条件下进行PCR反应步骤。

通常，变性步骤通过90℃-95℃但优选是94℃-95℃加热约1分钟到约3分钟但优选是约1分钟到2分钟来进行。

引物退火步骤通常通过与引物在30℃-50℃但优选35℃-42℃温育1-3分钟但优选1-2分钟来进行，根据需要，鉴定引物可以是一种，或两种或更多种的组合。

DNA聚合酶延伸步骤是在存在耐热DNA聚合酶时在约70℃到约73℃但优选是约72℃到73℃温育约1分钟到约4分钟但优选是约2分钟到约3分钟来进行。这种耐热DNA聚合酶可以是由PERKIN ELMER Ltd.制造的商品耐热DNA聚合酶。

通过重复上面的步骤可以获得所需的扩增DNA。

扩增片段的分析

使用上述的鉴定引物通过PCR反应产生的扩增DNA通过电泳分离，电泳是分离DNA的常用方法。然后在所获得的迁移带型的基础上就可以鉴定品种。

在电泳中，对1000个脱氧核糖核苷酸碱基对或更小的DNA片段用约3％到约20％的聚丙烯酰胺凝胶，对更长的DNA片段使用约0.2％到约2％的琼脂糖凝胶可获得适当的迁移带型。

电泳中使用的缓冲溶液可以是Tris-磷酸系统(pH7.5-8.0)，Tris-乙酸系统(pH7.5-8.0)或Tris-硼酸系统(pH7.5-8.3)，但优选是Tris-磷酸系统。如果必要可以加入EDTA。

电泳条件根据电泳装置的不同而不同，但电泳条件可以是，例如，50-300V电泳10-200分钟，优选是150V电泳30分钟。因为电泳的同时要加上大小标记物作为比较，所以可以使用诸如100 Base-Pair Ladder(Pharmacia Inc.)的商品标记物。

用诸如与核酸相互作用的菲啶染料的物质，如溴乙锭染色来检测扩增DNA。染色技术可以是首先加入终浓度约0.5mg/ml的诸如溴乙锭的物质，或者将电泳后的凝胶浸入含有约0.5mg/ml的溴乙锭水溶液中约10到60分钟。当在暗室中用254nm或366nm的紫外线照射染好的凝胶时，迁移带型被检测呈红色条带，其中DNA与溴乙锭相互作用。将染色溶液加到电泳装置上更为合适，这样甚至在电泳过程中也可以观察迁移带型。

除了这种电泳方法外，可以通过能够检测DNA存在与否或DNA大小的其他任何方法来分析扩增的DNA。

品种鉴定

通过按上述获得的迁移带型的比较分析鉴定品种。可以根据例如，变种中预先测定的扩增DNA的存在与否的差异或扩增DNA的大小差异来进行比较分析。

特定变种中扩增DNA的存在与否显示用于PCR的引物是否包括退火的序列(即互补序列)，扩增DNA的大小差异显示依赖于变种的由PCR扩增的区域中存在诸如缺失或插入的多态性序列。

为了进行更为精确的品种鉴定，优选不只依赖于一个PCR的结果，而是比较当使用一个或两个不同的寡聚核苷酸作鉴定引物时扩增片段的迁移带型。

还有，变种能够被鉴定的精度和区分变种的能力可以通过观察当PCR的反应条件如退火温度，反应缓冲溶液中镁的浓度等等改变时获得的结果来改进。

通过上面的顺序操作，本发明的啤酒花变种鉴定方法可以清楚地区分不同的变种。应用

本发明的变种鉴定方法可以用于证实用于啤酒花产品如啤酒花饼的啤酒花变种的纯度。

例如，研究从标准啤酒花获得的扩增DNA和从啤酒花饼获得的扩增DNA的不同。

如果检测从啤酒花饼获得的扩增DNA不同于从标准啤酒花获得的扩增DNA，就可以确定啤酒花饼中的标准啤酒花中掺入了其它变种或物种。

当发现其它变种或物种存在时，可以通过观察，例如，上述的溴乙锭的染色深度来测量扩增DNA的量，这些其它变种或物种存在的程度，即纯度。

也是在这种情况下，纯度检测的精度可以通过联合使用两种或更多种本发明的合成寡聚核苷酸来增强。

可以预料本发明的寡聚核苷酸可以用于除啤酒花之外的其它植物品种(如桑树，草莓，樱桃等等)的鉴定。近缘物种中脱氧核糖核苷酸序列不同的位置是DNA突变容易发生的位置，因此它们是有限的。例如，据报道编码rDNA的位置可以用于鉴定细菌菌种(大肠杆菌，乳酸菌)或植物物种(水稻实生苗，柑橘)。因此，根据本发明，发现近缘物种之间有差异的位置还可能用于鉴定其它植物的品种。

本发明的变种鉴定方法是在变种间的序列多态性的基础上进行分析，因此能够精确区分啤酒花变种而不受环境因素的影响。另外，本发明的变种鉴定方法不仅可以用于鉴定变种，还可以用于测量啤酒花产品中不同啤酒花变种的纯度。

实施方案

实施例1-12显示使用由第一种鉴定引物设计方法设计的鉴定引物对啤酒花品种的鉴定。

实施例1

基因组DNA的提取

所用的啤酒花为Brewer’s Gold(此后用1号品种表示)，Northern Brewer(此后用2号品种表示)，Tettnanger(此后用3号品种表示)，Saazer(此后用4号品种表示)，Hersbrucker spaet(此后用5号品种表示)，Spalter select(此后用6号品种表示)，Hallertauertradition(此后用7号品种表示)，Shinshu Wase(此后用8号品种表示)，和Furano Ace(此后用9号品种表示)。

从上面的变种上仔细剪下绿叶组织(重约1g)，将组织片段浸入液氮中冰冻。使用一个Polytron在液氮中将冰冻物质捣成粉末，使用BLOOD AND CELL CULTURE DNAKIT(QIAGEN Inc.)从50mg的粉末中提取基因组DNA。每个变种最后获得10-20mg的基因组DNA。

实施例2

用SEQ.ID Nos：1和2中描述的寡聚核苷酸作引物通过PCR进行啤酒花变种的分类。在一个含50μM KCl，1.5μM MgCl₂和含0.1％Triton X-100的10μM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.8)的小管中进行聚合酶链式反应。在小管中加入一个单位的耐热DNA聚合酶(Wako Pure Chemicals)，20nmol的四种碱基(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)和0.1mg的例1中制备的每种啤酒花变种基因组DNA，33pmol的SEQ.ID Nos：1和2中描述的寡聚核苷酸作为引物。最终反应溶液的体积为30μl，在小管中加入20μl的矿物油以防止反应溶液的蒸发。

上面的聚合酶链式反应在下列条件下进行。首先，在94℃温育3分钟后，在94℃加热1分钟进行变性步骤，在35℃温育1分钟进行引物退火步骤。在72℃用耐热DNA聚合酶完成35个循环，每个循环2分钟，并在72℃保温10分钟进行DNA聚合酶延伸步骤。将产物贮存于4℃。

通过上面的聚合酶链式反应获得的扩增DNA通过在5％聚丙烯酰胺凝胶上150V电泳30分钟来分离，电泳缓冲溶液为含2μM EDTA的100μM Tris-硼酸(pH8.0)。使用100 Base-Pair Ladder(Pharmacia Inc.)作大小标记物。

电泳结束后，将凝胶浸入0.5mg/ml的溴乙锭水溶液中10分钟，在暗室中用254nm紫外线照射。检测出与DNA和溴乙锭的化合物相对应的红色条带。所获得的结果显示于表1。

表中清楚地显示，当使用包括SEQ.ID Nos：1和2中描述的脱氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作引物时，在约520bp和约530bp处检测出了两条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，9个啤酒花变种被分成两组。

表1

SEQ.ID Nos.	1， 2	3， 4	5，6	7，8	9
SEQ.ID Nos.	1， 2	3， 4	5，6	7，8	9	扩增的DNA(bp)	520 530	750 850	270	370	950 1200
啤酒花品种号123456789	○○○○○○○○○	○○○○○ ○○○○ ○	○○○	○	○○○○○	扩增的DNA(bp)	520 530	750 850	270	370	950 1200

实施例3

除了使用SEQ.ID Nos：3和4中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和聚合酶链式反应中的引物退火步骤是在40℃进行外，方法与实施例2的相同。结果显示于表1。

当使用SEQ.ID Nos：3和4中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约750bp和约850bp处检测出了两条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，9个啤酒花变种被分成四组。

实施例4

除了使用SEQ.ID Nos：5和6中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和聚合酶链式反应中的引物退火步骤是在40℃进行外，方法与实施例2的相同。结果显示于表1。

当使用SEQ.ID Nos：5和6中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约270bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，9个啤酒花变种被分成两组。

实施例5

除了使用SEQ.ID Nos：7和8中描述的合成寡聚核苷酸作为引物外，方法与实施例2的相同。结果显示于表1。

当使用SEQ.ID Nos：7和8中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约370bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，9个啤酒花变种被分成两组。

实施例6

除了使用SEQ.ID Nos：9中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和聚合酶链式反应中的引物退火步骤是在40℃进行外，方法与实施例2的相同。结果显示于表1。

当使用SEQ.ID Nos：9中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约950bp和约1200bp处检测出了两条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，9个啤酒花变种被分成三组。

实施例7

除了使用SEQ.ID Nos：10中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和聚合酶链式反应中的引物退火步骤是在38℃进行外，方法与实施例2的相同。结果显示于表2。

当使用SEQ.ID Nos：10中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约650bp，约700bp和约1200bp处检测出了三条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，9个啤酒花变种被分成四组。

表2

SEQ.ID Nos.	10	11	12
SEQ.ID Nos.	10	11	12	扩增的DNA(bp)	650 700 1200	1400	550 800
啤酒花品种号123456789	○○ ○○ ○○○○○○ ○ ○○	○○○	○ ○○○○	扩增的DNA(bp)	650 700 1200	1400	550 800

实施例8

除了使用SEQ.ID Nos：11中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和聚合酶链式反应中的引物退火步骤是在38℃进行外，方法与实施例2的相同。结果显示于表2。

当使用SEQ.ID Nos：11中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约1400bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，9个啤酒花变种被分成两组。

实施例9

除了使用SEQ.ID Nos：12中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和聚合酶链式反应中的引物退火步骤是在38℃进行外，方法与实施例2的相同。结果显示于表2。

当使用SEQ.ID Nos：12中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约550bp和约800bp处检测出了两条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，9个啤酒花变种被分成四组。

实施例10

除了使用SEQ.ID Nos：13中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和聚合酶链式反应中的引物退火步骤是在38℃进行外，方法与实施例2的相同。结果显示于表3。

当使用SEQ.ID Nos：13中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约550bp，640bp，650bp和1400bp处检测出了四条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，9个啤酒花变种被分成五组。

表3

SEQ.ID Nos.	13	14
SEQ.ID Nos.	13	14	扩增的DNA(bp)	500 640 650 1400	540
啤酒花品种号123456789	○ ○ ○○ ○○○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○ ○	○○○○○	扩增的DNA(bp)	500 640 650 1400	540

实施例11

除了使用SEQ.ID Nos：14中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和聚合酶链式反应中的引物退火步骤是在38℃进行外，方法与实施例2的相同。结果显示于表3。

当使用SEQ.ID Nos：14中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约540bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，9个啤酒花变种被分成两组。

实施例12

将作为8号品种出售的啤酒花饼(经Sapporo Breweries Ltd.许可由Northern HopAgricultural Cooperative，Iwate-ken制造)在研钵中捣成粉末，使用BLOOD AND CELLCULTURE DNA KIT(QIAGEN Inc.)从20mg的粉末中提取了约5mg的基因组DNA。使用包括SEQ.ID Nos.1和2中描述的脱氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作引物，用与实施例2相同的程序处理此DNA。

检查此扩增基因组DNA与从8号品种的标准啤酒花获得的扩增基因组DNA之间的不同以证实纯度。

接下来，使用由第二种鉴定引物设计方法设计的鉴定引物进行的啤酒花品种的鉴定将在实施例13-30中描述。

实施例13

基因组DNA的提取

从上述的变种上仔细剪下绿叶组织(重约1g)，将组织片段浸入液氮中冰冻。使用一个Polytron在液氮中将冰冻物质捣成粉末，使用BLOOD AND CELL CULTURE DNAKIT(QIAGEN Inc.)从50mg的粉末中提取基因组DNA。每个变种最后获得10-20mg的基因组DNA。

实施例14

RAPD标记的选择

为了获得RAPD标记，使用0.34μM的引物B72(图2)作引物进行PCR。

在一个含50μM KCl，1.5μM MgCl₂和含0.1％Triton X-100的10μM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.8)中进行聚合酶链式反应。在小管中加入0.25个单位的Taq DNA聚合酶(Nippon Gene K.K.)，200μM的四种碱基(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)和17.5μg的例13中制备的每种啤酒花变种基因组DNA。最终反应溶液的体积为10μl。

上面的聚合酶链式反应在下列条件下进行。首先，在94℃温育1分钟后，在94℃加热30秒进行变性步骤，在33℃温育1分钟进行引物退火步骤。在72℃用耐热DNA聚合酶完成35个循环，每个循环30秒，在72℃保温1分钟进行DNA聚合酶延伸步骤。

通过上面的聚合酶链式反应获得的扩增DNA通过在5％聚丙烯酰胺凝胶上150V电泳30分钟来分离，电泳缓冲溶液为含2μM EDTA的100μM Tris-硼酸(pH8.0)。使用Marker 9(Nippon Gene)作大小标记物。

电泳结束后，将凝胶浸入0.5mg/ml的溴乙锭水溶液中10分钟，在暗室中用254nm紫外线照射。检测出与DNA和溴乙锭的化合物相对应的红色条带。所获得的结果显示于图1。

从图1可以看出用箭头指示的位置的条带的大小对HT和SW来说是不同的。用箭头指示的条带的位置相应于RAPD标记。

实施例15

从电泳凝胶上切下例14中制备的RAPD标记，将其置于一个透析管中，加电压从凝胶上洗下RAPD标记。

根据“PCR Technology”(ed.Henry A.Erlich，pub.Takara Shuzo Co.，Ltd.)中描述的方法在获得的RAPD标记上加上限制酶BglII或PstI的识别序列。使用限制酶识别序列用pUC质粒进行亚克隆后，通过双脱氧法测定其脱氧核糖核苷酸序列，结果显示于图2。图中黑点(·)指示与上一行相同的脱氧核糖核苷酸，杠(-)指示碱基缺失。有下划线的部分是引物B72的脱氧核糖核苷酸序列，用长方形封闭的脱氧核糖核苷酸序列是后面的实施例16中作为参考的脱氧核糖核苷酸序列。

当对每条带进行序列测定时，如图2所示，SW中观察到了一个32bp脱氧核糖核苷酸序列的插入。

实施例16

由实施例15中获得的RAPD标记，设计以图2所示的由长方形封闭的脱氧核糖核苷酸序列B72WF2为参考获得的序列表的SEQ.ID 27所述的合成寡聚核苷酸，和从互补序列B72WR2获得的SEQ.ID 28所述的脱氧核糖核苷酸序列(分许可Sawaddy Technology生产)。

在下列的PCR反应中，这些合成的寡聚核苷酸被用作一个引物组。在一个10μl的含50μM MgCl₂和含0.1％Triton X-100的10μM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.8)中进行PCR，加入0.25个单位的Taq DNA聚合酶(Nippon Gene Inc.)，200μM的四种碱基(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，17.5μg的例13中制备的啤酒花变种基因组DNA和0.34μM的合成寡聚核苷酸。

上面的聚合酶链式反应在下列条件下进行。首先，在94℃温育1分钟后，在94℃加热1分钟进行变性步骤，在60℃温育1分钟进行引物退火步骤。在72℃用耐热DNA聚合酶完成35个循环进行DNA聚合酶延伸步骤，每个循环30秒。

上述聚合酶链式反应获得的扩增DNA通过在5％聚丙烯酰胺凝胶上150V电泳30分钟来分离，电泳缓冲溶液为含2μM EDTA的100μM Tris-硼酸(pH8.0)。使用Marker9(Nippon Gene)作大小标记物。

电泳结束后，将凝胶浸入0.5mg/ml的溴乙锭水溶液中10分钟，在暗室中用254nm紫外线照射。检测出与DNA和溴乙锭的化合物相对应的红色条带。所获得的结果显示于图3。

对其它的变种进行相同的程序，结果显示于图3。所用的其它品种为Fuggle(FU)，Cascade(CC)，Brewer’s Gold(BG)，Northern Brewer(NB)，Tettnanger(TE)，Saazer(SA)，Hersbrucker spaet(HE)，Perle(PE)，Spatter select(SS)和Furano Ace(FA)。

正如从图中看出的，在BG，NB，TE，SW和FA中观察到了包括插入位置的一个329bp片段(箭头)的扩增。在所有的品种中观察到了不包括插入位置的一个299bp片段。还观察到了品种特异性的片段600bp，700bp，710bp。这些片段易于鉴定且重复性高。

实施例17

除了使用SEQ.ID Nos：15和16中描述的合成寡聚核苷酸作为引物外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

从表中看出，当使用SEQ.ID Nos：15和16中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约500bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例18

除了使用SEQ.ID Nos：17和18中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和PCR中的引物退火步骤是在62℃进行外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

当使用SEQ.ID Nos：17和18中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约260bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例19

除了使用SEQ.ID Nos：19和20中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和PCR中的引物退火步骤是在65℃进行外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

当使用SEQ.ID Nos：19和20中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约500bp和约550bp处检测出了两条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例20

除了使用SEQ.ID Nos：21和22中描述的合成寡聚核苷酸作为引物外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

当使用SEQ.ID Nos：21和22中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约710bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例21

除了使用SEQ.ID Nos：23和24中描述的合成寡聚核苷酸作为引物外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

当使用SEQ.ID Nos：23和24中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约330bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例22

除了使用SEQ.ID Nos：25和26中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和进行PCR后，使用1μl的反应溶液作模板DNA在与前述相同的PCR条件下进行20个PCR循环外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

当使用SEQ.ID Nos：25和26中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约160bp和约200bp处检测出了两条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例23

除了使用SEQ.ID Nos：29和30中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和PCR中的引物退火步骤是在57℃进行外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

当使用SEQ.ID Nos：29和30中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约350bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例24

除了使用包括SEQ.ID Nos：31和32中描述的脱氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作为引物，PCR进行两次，和反应溶液用限制酶NlaIII(Daiichi Pure Chimicals)处理外，方法与实施例22的相同。结果显示于表4。

当使用包括SEQ.ID Nos：31和32中描述的脱氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作引物时，在约220bp和约360bp处检测出了两条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，12个啤酒花变种被分成四组。

实施例25

除了使用SEQ.ID Nos：33和34中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，PCR中的引物退火步骤是在67℃进行，和反应溶液用限制酶TaqI(Boehringer Mannheim)处理外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

当使用SEQ.ID Nos：33和34中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约220bp和约270bp处检测出了两条扩增的基因组条带。根据这些条带的有无，12个啤酒花变种被分成三组。

实施例26

除了使用SEQ.ID Nos：35和36中描述的合成寡聚核苷酸作为引物，和PCR中的引物退火步骤是在58℃进行外，方法与实施例16的相同。结果显示于表4。

当使用SEQ.ID Nos：35和36中描述的合成寡聚核苷酸作引物时，在约400bp处检测出了一条扩增的基因组条带。根据此条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例27

使用33pmol的Beck’s通用引物(A25；5’-GGTCAGGCACCA-3’)以与实施例14相同的方式进行PCR和电泳。结果观察到了超过10个约200-2000bp的扩增基因组条带，使用存在与否依赖于品种的约500bp处的条带作为RAPD标记。当检查此标记的脱氧核糖核苷酸序列时，获得了图4显示的结果。

在图4中SEQ.ID Nos：19和20所述的合成寡聚核苷酸是以A和B标出的长方形封闭的序列。图4中SEQ.ID Nos：37和38所述的寡聚核苷酸是以C和D标出的有下划线的序列。SEQ.ID Nos：37和38中描述的这些寡聚核苷酸包括此RAPD标记的一部分。SEQ.ID Nos：19和20中描述的这些寡聚核苷酸在5’端含有原始引物序列。

除了使用SEQ.ID Nos：19和20作为引物在65℃进行35个退火步骤循环，和使用SEQ.ID Nos：37和38作为引物在60℃进行30个退火步骤循环外，程序与实施例16的相同。结果是当使用SEQ.ID Nos：19和20作引物时，观察到的500bp和550bp条带如表4所示，当使用SEQ.ID Nos：37和38作引物时，观察到了一个459bp的条带。根据这些条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例28

使用33pmol的Beck’s通用引物(A25；5’-GGTCAGGCACCA-3’)以与实施例14相同的方式进行PCR和电泳。结果观察到了超过10个约200-2000bp的扩增基因组条带，使用存在与否依赖于品种的约500bp处的条带作为RAPD标记。当检查此标记的脱氧核糖核苷酸序列时，获得了图5显示的结果。

在图5中SEQ.ID Nos：15和16所述的合成寡聚核苷酸是以用A和B标出的长方形封闭的序列为基础的。图5中SEQ.ID Nos：39和40所述的寡聚核苷酸是以用C和D标出的有下划线的序列为基础的。

使用SEQ.ID Nos：39和40作为引物，在60℃进行30个退火步骤循环。所有的变种都观察到了在500bp处的扩增基因组条带，但这些变种不能够被鉴定。另一方面，当使用SEQ ID Nos：15和16进行相同的程序时，获得了表4所示的扩增基因组条带，这些根据这些条带的有无，12个啤酒花变种被分成两组。

实施例29

从综合实施例16-28的类型的表4可以看出有可能区分12个啤酒花变种。

列出片段大小的例子被作为变种鉴定的参考，用限制酶进行处理的例子用括号()表示。

表4

引物组品种SEQ.ID No. (bp) FU CC BG NB TE SA HE PE SS HT SW FA

15/16 500 ○ ○ ○ ○17/18 260 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○19/20 500 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○19/20 550 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○21/22 710 ○ ○23/24 330 ○ ○25/26 200 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○25/26 160 ○ ○ ○ ○ ○27/28 710 ○27/28 700 ○27/28 600 ○ ○ ○ ○27/28 329 ○ ○ ○ ○ ○27/28 299 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○29/30 350 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○31/32 360(NlaIII) ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○31/32 220(NlaIII) ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○33/34 270(TaqI) ○ ○ ○ ○ ○ ○33/34 220(TaqI) ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○35/36 400 ○37/38 459 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○39/40 500 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

实施例30

在研钵中将Shinshu Wase啤酒花饼(经Sapporo K.K.许可由Northem Hop AgriculturalCooperative，Iwate-ken制造)捣碎，使用BLOOD AND CELL CULTURE DNAKIT(QIAGEN Inc.)从20mg的粉末中提取到了约5mg的基因组DNA。使用包括SEQ.IDNos.15-40中描述的脱氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作引物，用与实施例29相同的程序检查所获得的DNA的纯度。

出现了很少几条非特异性的扩增条带，很容易证实所需的标记。在重复纯度测试中也获得了高重复性的结果。

应用的领域

根据本发明的遗传鉴定方法，可以进行不受环境或其它情况影响的精确而简单的啤酒花变种的鉴定。本发明的遗传鉴定方法对检查以啤酒花为原料的产品的纯度也是有效的。

因此，通过鉴定啤酒花变种，本发明的遗传鉴定方法可以用于保持含有稳定水平啤酒花的产品的质量，或用于提高其质量。

序列表

SEQ.ID No.：1

序列长度：19

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CTATTCTGGCTAGTTCTGC

SEQ.ID No.：2

序列长度：19

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CTATTTTGGCCAGTTTTGT

SEQ.ID No.：3

序列长度：20

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

AGCTGAGCAAGCTTCTTTGG

SEQ.ID No.：4

序列长度：20

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CCCTTTATATACACTGCCGA

SEQ.ID No.：5

序列长度：20

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

TAGCATCGGTAATCTCTCGC

SEQ.ID No.：6

序列长度：20

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

AACATGCTGGGCAACTCCCA

SEQ.ID No.：7

序列长度：20

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GGAGACATCATCGAATCAGA

SEQ.ID No.：8

序列长度：21

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

AACCAGAGCAGCCATGTTAGT

SEQ.ID No.：9

序列长度：10

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CAATCGCCGT

SEQ.ID No.：10

序列长度：12

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GCCAGCTGTACG

SEQ.ID No.：11

序列长度：12

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

AGGTACGCCCGA

SEQ.ID No.：12

序列长度：12

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CGCCCTGCAGTA

SEQ.ID No.：13

序列长度：12

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CCATCCGCACGA

SEQ.ID No.：14

序列长度：12

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GGTCAGGCACCA

SEQ.ID No.：15

序列长度：24

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CGCCCTGCAGTACCTTCCTGTAAG

SEQ.ID No.：16

序列长度：24

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CGCCCTGCAGTAGAGCACTTCTAT

SEQ.ID No.：17

序列长度：22

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CAATCGCCGTCTTGGTAGCGTA

SEQ.ID No.：18

序列长度：25

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CAATCGCCGTTGAGAAAGTTAAGTA

SEQ.ID No.：19

序列长度：25

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GGTCAGGCACCATGTACTAGCTGGC

SEQ.ID No.：20

序列长度：25

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GGTCAGGCACCAAGGCCACCATCTG

SEQ.ID No.：21

序列长度：26

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GCCAGCTGTACGATGCCATGACCTTA

SEQ.ID No.：22

序列长度：24

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GCCAGCTGTACGCCCCGGAAGGAA

SEQ.ID No.：23

序列长度：23

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

ACTCACCACGCAGAAACCCAGGC

SEQ.ID No.：24

序列长度：23

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CCTCGACAAGTGAGATGTTGACC

SEQ.ID No.：25

序列长度：23

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GCCACATTATCAAGGCAATACAC

SEQ.ID No.：26

序列长度：20

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GGCATGACTCATGCCAGCTG

SEQ.ID No.：27

序列长度：22

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GTCCCTCCTAGACACCTACATA

SEQ.ID No.：28

序列长度：21

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GCTCCTGACAGCAAGGTAAGC

SEQ.ID No.：29

序列长度：22

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GAATACTGAGATTTTTATGAGG

SEQ.ID No.：30

序列长度：20

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CAGGTCATGACTCATGCTAA

SEQ.ID No.：31

序列长度：28

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

AAGGTGTTGCGGCCCTTAACAACTTCTT

SEQ.ID No.：32

序列长度：28

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

AAGGTGTTGCGGAGAGTGTTCTAGAACA

SEQ.ID No.：33

序列长度：23

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

ATCGAGCGAACGTATCAGCTGCG

SEQ.ID No.：34

序列长度：24

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CCTTTCCGACGTCACTAATCGTGG

SEQ.ID No.：35

序列长度：24

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

TTAAATGACATGATCACCTCTCCC

SEQ.ID No.：36

序列长度：24

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

TAACACAGAGGTACCTCACTGTCT

SEQ.ID No.：37

序列长度：21

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CTCCCACTGCACACCTATTTC

SEQ.ID No.：38

序列长度：21

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CACCATCTGAAGGAGGTCAAG

SEQ.ID No.：39

序列长度：20

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

CCTTCCTGTAAGGGTTTACA

SEQ.ID No.：40

序列长度：21

序列形式：核酸

链数：1

拓扑结构：线性

序列类型：合成DNA

序列描述：

GAGCACTTCTATCATTTTTCG

Claims

1、一种用于鉴定啤酒花植物品种的随机扩增多态性DNA方法，包括：

(a)提供一个啤酒花植物品种和一个用于扩增该品种啤酒花植物DNA中的多态性特征区域的引物，所述引物包含选自由SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：40组成的一组的一种核苷酸序列，或者所述引物包含一种包含前述选定的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列；

(b)从所述品种分离DNA；

(c)用所述DNA和所述引物进行聚合酶链反应；

(d)确定所述聚合酶链反应是否产生一DNA分子；和

2、如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中提供多个引物，且所述聚合酶链反应用所述多个引物进行。

3、如权利要求1或2所述的方法，其中所述引物是合成的寡核苷酸。

4、如权利要求1所述的方法，其中所述引物包含选自由SEQ ID NO：1至SEQID NO：14组成的一组的一种核苷酸序列，或者所述引物包含一种包含选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：14组成的一组的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列。

5、如权利要求1所述的方法，其中所述引物包含选自由SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：40组成的一组的一种核苷酸序列，或者所述引物包含一种包含选自由SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：40组成的一组的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列。

6、一种构建用于鉴定啤酒花植物品种的引物的随机扩增多态性DNA方法，包括：

(a)提供一个啤酒花植物品种和一种用于扩增该品种啤酒花植物DNA中的多态性特征区域的第一引物，所述第一引物包含选自由SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：14组成的一组的一种核苷酸序列，或者所述第一引物包含一种包含选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：14组成的一组的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列；

(b)从所述品种分离DNA；

(d)确定所述DNA分子的序列；和

(e)构建一种第二引物，该第二引物包含一种选自由SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：40组成的一组的核苷酸序列或包含一种包含选自由SEQID NO：15至SEQ ID NO：40组成的一组的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列，从而构建所述用于鉴定啤酒花品种的引物。

7、如权利要求6所述的方法，其中在步骤(a)中提供多个引物，且所述聚合酶链反应用所述多个第一引物进行。

8、如权利要求6或7所述的方法，其中所述引物是合成的寡核苷酸。