SK284231B6 - Method of genetic varietal differentiation of hop - Google Patents
Method of genetic varietal differentiation of hop Download PDFInfo
- Publication number
- SK284231B6 SK284231B6 SK41797A SK41797A SK284231B6 SK 284231 B6 SK284231 B6 SK 284231B6 SK 41797 A SK41797 A SK 41797A SK 41797 A SK41797 A SK 41797A SK 284231 B6 SK284231 B6 SK 284231B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- dna
- primer
- hop
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález sa týka spôsobu identifikácie odrôd chmeľu a predovšetkým identifikačnej metódy, ktorá využíva technológiu genetického inžinierstva.
Doterajší stav techniky
Chmeľ dáva pivu unikátnu arómu a horkosť a pomáha vysedimentovaniu prebytočných bielkovín a potláča bakteriálnu proliferáciu. Akokoľvek, miera účinku chmeľu sa v tomto smere líši hlavne podľa odrody chmeľu, preto je nutné identifikovať odrody chmeľu, na udržanie výroby piva rovnakej kvality, a na vývoj nových pív.
Obvykle, identifikácia odrôd chmeľu je založená na ich základných zložkách, t. j. horkých zložkách (a kyseliny/β kyseliny kohumulónovej/humulónovej, kolupulón/lupulón) a esenciálnych olejových zložkách (famezén, karyofylén).
Okrem faktu, že identifikačná metóda založená na horkosti a olejoch si vyžaduje namáhavé merania všetkých komponentov, tiež nie je schopná presne stanoviť odrody, pretože tieto zložky dokonca v tej istej odrode závisia od pestovateľskej oblasti a roku.
Súčasný progres v genetickom inžinierstve, množstvo pokusov uskutočnených na vyriešení sekvencie chromozómov závisiacej od druhu rastlín, a založenej na zistenej bázovej sekvencii, umožnil identifikovať odrody s rôznou genetickou informáciou medzi rôznymi rastlinami, alebo odrodami tej istej rastliny, t. j. z polymorfizmu DNA sekvencie.
Identifikácia rastlinných odrôd podľa tohto typu polymorfizmu jc spoľahlivá, pretože samotná DNA sekvencia ťažko podlieha vplyvom prostredia, a preto je nemeniteľná.
Z tohto hľadiska predkladaný vynález poskytuje spoľahlivý a jednoduchý spôsob identifikácie chmeľových odrôd použitím uvedenej genetickej techniky.
Podstata vynálezu
Podstata spôsobu identifikácie chmeľovej odrody pomocou náhodne polymorfnej DNA (RAPD), spočíva v tom, že sa pripraví chmeľová odroda a prvý primér (priméry) na amplifikáciu oblasti, ktorá je charakteristická polymorfizmom DNA chmeľovej odrody, pričom prvý primér obsahuje nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúce z SEKV. IČ: 1 až IČ: 8 a IČ: 10 až IČ: 14, alebo prvý primér obsahuje nukleotidovú sekvenciu obsahujúcu komplementárnu sekvenciu uvedenej vybranej nukleotidovej sekvencie a potom sa DNA z odrody izoluje a následne sa uskutoční polymerázová reakcia použitím DNA a prvého priméru (primárov), čim vznikne DNA molekula; potom sa Stanovi sekvencia DNA molekuly, na čo sa zostavia druhé priméry obsahujúce sekvenciu obsiahnutá v DNA molekule, pričom druhý primér obsahuje nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej z SEKV. IČ: 15 až SEKV. IČ: 38, alebo druhý primér obsahuje nukleotidovú sekvenciu obsahujúcu komplementárnu sekvenciu k uvedenej vybranej nukleotidovej sekvencii; následne sa uskutočni polymerázová reťazová reakcia použitím DNA molekuly a druhých primérov; a stanoví sa, či polymerázovou reťazovou rekciou vznikla alebo nevznikla DNA molekula (molekuly); a nakoniec sa uskutoční identifikácia odrody na základe toho, či DNA molekula (molekuly) vznikli, alebo DNA molekula (molekuly) nevznikli.
Podstata vynálezu spočíva aj v tom, že sa pripraví pluralita prvých primérov a polymerázová reťazová reakcia sa uskutoční použitím plurality týchto prvých primérov. Primárom je pritom syntetický oligonukleotid.
Podľa výhodného spôsobu uskutočnenia druhé priméry obsahujú nukleotidové sekvencie vybrané zo skupiny pozostávajúcej z kombinácií SEKV. IČ: 15 a 16, SEKV. IČ: 17 a 18, SEKV. IČ: 19 a 20, SEKV IČ: 20 a 21, SEKV IČ: 21 a 22, SEKV. IČ: 23 a 24, SEKV. IČ: 25 a 26, SEKV. IČ: 27 a 28, SEKV. IČ: 29 a 30, SEKV IČ: 31 a 32, SEKV. IČ: 33 a 34, SEKV. IČ: 35 a 36 a SEKV. IČ: 37 a 38.
Spôsob identifikácie chmeľovej odrody podľa vynálezu geneticky detekuje tento polymorfizmus založený na rôznych medzidruhových sekvenciách DNA. Menovite, časti DNA sekvencie chmeľu, ktoré majú polymorfizmus, sú amplifikované polymerázovou reťazovou reakciou (ďalej ako PCR) použitím identifikujúceho priméru, a odrody sú potom identifikované analýzou tejto amplifikovanej DNA.
Na použitie uvedeného spôsobu je dôležité poznať polymorfizmus DNA medzi rôznymi odrodami chmeľu.
Pojem polymorfizmus špecificky zaháňa rozdiel v genetike sekvencie spôsobenej inzerciou, deléciou alebo substitúciou. Dĺžka takejto sekvencie môže byť 1 bp alebo niekoľko desiatok a viac bp, ale zvyčajne v medziach niekoľko bp až niekoľko desiatok bp.
Tento sekvenčný polymorfizmus môže byť detekovaný stanovením sekvencie časti zodpovedajúcej chromozomálnej DNA každej odrody, a potom prevedením porovnávacej analýzy sekvencii. Jednoduchý spôsob jc použitie RAPD (Náhodná amplifikovaná polymorfná DNA) techniky vyvinutej Williamsom a spol. (Nucleic Acids Research, Vol. 18, p. 6531,1990).
Táto RAPD technika detekuje polymorfizmus medzi neznámymi DNA sekvenciami použitím PCR. Menovite, priméry nízkej špecificky, zahrnujúce relatívne krátke syntetické nukleotidy, okolo 10 báz, sú zmiešané s mnohými typmi DNA, a vykoná sa PCR.
Keď DNA sekvencie chmeľu obsahujú sekvencie, ktoré sú plne alebo čiastočne komplementárne k primárom, priméry tepelne hybridizujú s plnou alebo čiastočnou komplementárnou sekvenciou, a časť ohraničená primármi je syntetizovaná a amplifikovaná. Ak sú rozdiely v sekvenciách, takých ako inverzia alebo delécia v DNA v časti medzi primármi, v PCR sa získajú amplifikované fragmenty rôznych veľkostí v závislosti od odrody. Ďalej, ak porovnáme sekvenciu jednej odrody, ktorá tepelne hybridizuje s primárom, a druhá odroda nemá, tak získame len PCR fragmenty prvej odrody. Polymorfizmus môže byť potom detekovaný frakcionáciou, napr. elektroforézou.
RAPD metóda môže byť použitá nielen detekciou polymorfizmu podľa tohto opísaného vynálezu, ale tiež výberom primérov, ktoré môžu potom detekovať polymorfizmus s PCR, t. j. ako primér určujúca metóda.
Predmetom spôsobu podľa tohto vynálezu sú všetky polymoríné oblasti DNA chmeľových odrôd detekované s RAPD metódou. Teda, všetky priméry, ktoré môžu amplifikovať polymorfnú oblasť detekovanú s RAPD metódou, môžu sa použiť ako identifikujúce priméry podľa tohto vynálezu.
Priméry podľa tohto vynálezu vyvinuté uvedeným spôsobom môžu byť jeden typ syntetického nukleotidu alebo dva, alebo viac typov syntetických nukleotidov.
Dĺžka syntetického nukleotidu je v rozsahu 6 - 40, výhodnejšie 10 - 21. Menovite, je vhodné používať nukleotidy obsahujúce bázové sekvencie ukázané v SEKV. IČ: 1 -14 v sekvenčnom zozname.
Druhý spôsob na určenie identifikačných primérov podľa tohto vynálezu zahrnuje nasledovné stupne.
Tento spôsob najprv stanovuje bázovú sekvenciu amplikovaných fragmentov obdržaných polymerázovou reťazovou reakciou použitím priméru (t. j. priméru, ktorý môže amplifikovať polymorfnú oblasť detekovanú uvedenou metódou RAPD, ďalej uvedené ako primér). Konečne, sú syntetizované dva identifikujúce priméry, ktoré jednotlivo doplňujú pozíciu vopred určeného intervalu uvedeného fragmentu polymorfnej sekvencie, to znamená produkujú amplifikovaný fragment, ktorý umožňuje identifikáciu polymorfnej sekvencie s primárnym primérom, s vysokou reprodukovateľnosťou a jednoduchosťou.
Inými slovami, podľa uvedeného spôsobu, primér môže byť selektívne určený na základe polymorfnej sekvencie a okolitých sekvencii.
Uvedený primárny primér môže byť oligonukleotid zložený z bázovej sekvencie opísanej v SEKV. IČ. 1 - 14 v sekvenčnom zozname.
Napríklad, prvá sekvencia priméru môže sa určiť tak, že ďalšie alebo obidva priméry obsahujú celú, alebo časť uvedenej polymorfnej sekvencie.
Keď je vykonaná identifikácia rodu s predtým uvedenými primérmi, a je použitá odroda, ktorá obsahuje vybranú polymorfnú sekvenciu, s PCR amplifikáciami DNA odrody, je obdržaná špecifická amplifikovaná DNA, keďže odroda neobsahuje komplementárnu sekvenciu. V tomto prípade je možná identifikácia odrody podľa prítomnosti, alebo neprítomnosti amplifikovaného fragmentu.
Sekvencia druhého identifikačného priméru môže sa určiť tak, že dva typy primérov sú umiestnené, jeden nad a druhý pod zodpovedajúcou polymorfnou sekvenciou.
Ak identifikácia odrody je vykonaná použitím uvedených primérov, s PCR je produkovaná amplifikovaná DNA, majúca rôzne vnútorné bázové sekvencie závislé od odrody a v niektorých prípadoch aj rôzny počet báz. Odroda môže byť identifikovaná z pohyblivosti vzorky obdržanej frakcionáciou amplifikovanej DNA elektroforézou, ak je potrebné elektroforézou po štiepení reštrikčnými enzýmami, denaturačnou gradientovou elektroforézou alebo teplotnou gradientovou gélovou elektroforézou.
Tretí identikačný primér sa môže určiť tak, aby obsahovalo sekvenciu priméru na 5' konci, bázovú sekvenciu v polymorfnej časti pripojenú k tejto sekvencii obsahujúcu 5-20 báz viazaných spolu. Identifikácia odrody použitím tohto priméru je vhodná, keď je napríklad polymorfná sekvencia pri mieste, ku ktorému je primér komplementárny. Inými slovami, polymorfná sekvencia môže sa detekovať s vyššou špecifitou než so samotným primérom pripojením sekvencie 5 - 20 báz k nemu.
Ďalej, ak iný primér neobsahujúce tento typ sekvencie, môže sa tiež vhodne použiť ako primér chmeľu, v prípade, že je určený podľa uvedeného spôsobu.
Špecificky, primér určený podľa uvedeného spôsobu, môže byť syntetický oligonukleotid obsahujúci bázovú sekvenciu v SEKV. IČ 15 - 40 sekvenčného zoznamu, alebo vhodná kombinácia dvoch syntetických oligonukleotidov, z ktorých každá obsahuje časť tejto bázovej sekvencie, ak je vhodnejšia.
Alternatívne, identifikačný primér môže byť syntetický nukleotid, ktorý obsahuje časť bázovej sekvencie genómovej DNA medzi miestom, kde bázová sekvencia s SEKV. IČ: 15 (17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39) je hybridizovaná ku genómovej DNA, a miestom, kde bázová sekvencia SEKV. IČ: 16 (18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40) je hybridizovaná ku genómovej DNA.
Podľa tohto spôsobu určenia priméru (t. j. s týmto zložením), je možné stanoviť bázovú sekvenciu úseku, ktorý predstavuje polymorfizmus, a teda spôsob poskytuje primér, ktorý môže spoľahlivejšie identifikovať odrodu.
Takto, vykonaním porovnávacej analýzy DNA medzi odrodami, založenej na genetickej technike podľa spôsobu identifikácie odrody podľa tohto vynálezu, chmeľové odrody môžu sa spoľahlivo identifikovať bez účinku prostredia, v ktorom boli pestované.
V spôsobe identifikácie chmeľovej odrody podľa tohto vynálezu, polymorfné oblasti, t. j. časti DNA, v ktorých DNA sekvencia je odlišná v rôznych odrodách chmeľu, sú amplifikované s PCR použitím priméru, a odrody sú identifikované analýzou rozdielnosti medzi jednotlivými amplifikovanými fragmentmi.
Zber DNA chmeľu
Chmeľová DNA môže sa na štúdium zbierať z malého množstva chmeľových listov, plodov a zrniek.
Chmeľová DNA môže sa zbierať metódou všeobecne používanou na získanie DNA z rastlinných vzoriek, napr. typická metóda extrakcie DNA je udaná v Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980), alebo jednoduchšie uskutočnená extrakcia použitím komerčnej súpravy pre DNA krvi a bunkovej kultúry (QLAGEN Inc.). Pri použití súpravy je DNA absorbovaná na negatívny ión ionomeničovej živicovej kolóny a znovu uvoľnená, takže problém spôsobený prímesou látok, ktoré môžu interferovať s reakciou môže sa vyriešiť.
Teraz budú opísané niektoré spôsoby určenia priméru, ktoré sa môže použiť v tomto vynáleze.
Prvý spôsob určenia priméru
Na určenie priméru sa môže použiť hociktorá metóda, ktorá hľadá nukleotidy, ktoré detekujú polymorfnú časť, alebo sekvenciu rôznych odrôd s PCR, ale obzvlášť vhodná je RAPD metóda.
Na uskutočnenie RAPD metódy, najprv sa pripraví skupina primérov obsahujúca rôzne priméry.
Priméry použité v bežnej RAPD metóde sa môžu obdržať z DNA použitím automatickej syntetickej súpravy, napr. fosfoamididovou technikou. Majú náhodné sekvencie a ich dĺžka je 6-40 nukleotidov alebo výhodnejšie 10-21 nukleotidov.
Tiež sa môže použiť bázová sekvencia objavená Williamsom a spol. (Nucleic Acids Research, Vol. 18, p. 6531, 1990), podľa Becka spoločné priméry, alebo komerčné nukleotidy z Operon 10 - mer súprav vyrobených OPERON Co. PCR je potom vykonaná s rôznymi typmi chmeľovej DNA, pričom je použitý jeden alebo viac primérov z uvedenej skupiny, za tých istých podmienok, ktoré budú ďalej opísané v,,PCR reakcii“.
Ďalej, fragmenty amplifikované s PCR sú frakcionované na vhodnom elektroforetickom géli, a sú porovnávané stupne pohyblivosti amplifíkovaných fragmentov medzi odrodami.
Ak výsledkom uvedeného porovnávania sú nájdené rozdielne amplifikované fragmenty alebo fragmenty s rôznou veľkosťou medzi odrodami, vezmú sa ako polymorfné amplifikované fragmenty (RAPD markery) a jeden alebo dva priméry produkujúce tieto fragmenty sú vybrané z uvedenej skupiny primérov, aby sa použili ako identifikačné priméry.
Príkladom touto cestou vybraného priméru je syntetický nukleotid obsahujúci bázovú sekvenciu opísanú v Sekv. IČ: 1-14 sekvenčného zoznamu, a samozrejme tieto sekvencie sa môžu použiť ako komplementárne sekvencie.
Hociktorý nukleotid obsahujúci časť bázovej sekvencie ukázanej v SEKV IČ:1 - 14 sekvenčného zoznamu môže sa použiť v PCR reakcii ako primér, ktorý môže amplifikovať hociktorú vybratú polymorfnú sekvenciu chmeľovej DNA.
Ďalej, v závislosti od reakčných podmienok PCR reakcie, môže sa použiť hociktorý nukleotid obsahujúci sekvenciu podobnú uvedeným syntetickým oligonukleotidom.
Podľa prvej určovacej metódy sa ľahko určuje primér, ktorý môže detekovať polymorfizmus v chmeli obsahujúcom neznámu sekvenciu.
Okrem toho, týmto spôsobom vybraný primcr plní svoju funkciu veľmi dobre, ako bude ukázané v nasledujúcich prípadoch.
Druhý spôsob určenia priméru
Druhý spôsob určenia priméru stanovuje bázovú sekvenciu polymorfhých amplifikovaných fragmentov (RAPD markerov) zistených prvým spôsobom určenia priméru a zistí polymorfné sekvencie.
Sekvencie, ktoré môže produkovať amplifikovaný fragment obsahujúci polymorfnú sekvenciu, sú vybraté ako priméry zo sekvencie v tu stanovených polymorfhých amplifikovaných fragmentoch.
Primér sa môže určiť z typového zoznamu „PCR technology“ ed. Henry A. Erlich, Takara Shuzo Co. Ltd., ktorý je často citovaný v PCR.
Špecificky, keď vybratá sekvencia priméru z DNA amplifikovaného fragmentu je rôzne veľká od RAPD markera, je vybratá ľubovoľná bázová sekvencia oligonukleotidov obsahujúca sekvenciu uloženú na strane inzercie, alebo na strane delécie v RAPD markeri.
Príklad takéhoto priméru je kombinácia oligonukleotidov obsahujúcich bázovú sekvenciu opísanú v sekv. IČ: 27, 28 sekvenčného zoznamu.
Veľkosť RAPD markerov je od 1 bp k niekoľko sto bp, ale veľkosť okolo 10 bp až niekoľko desiatok bp je na identifikáciu obvyklejšia. Tiež tam môže byť párová substitúcia, ktorá môže byť identifikovaná reštrikčnými enzýmami alebo podobne ak tam aj nie je rôzna veľkosť.
Veľkosť, ktorá môže byť ľahko rozlíšená elektroforézou závisí od typu a koncentrácie použitého gélu, ale ako pravidlo môže byť 1/10 alebo viac z celkovej dĺžky. Napríklad, primér je určený tak, že keď sekvencia inzertu je 20 bp, celá dĺžka amplifikovaného produktu je 200 bp alebo menej. Preto, použitím takéhoto typu priméru pre PCR, sú obdržané amplifikované fragmenty, ktorých veľkosť umožňuje ľahšie rozlíšenie polymorfizmu.
Alternatívne, ak amplifikované fragmenty medzi odrodami majú rôznu veľkosť, môžu byť vybraté oligonukleotidy, ktoré obsahujú vnútornú sekvenciu na strane inzertu, a sekvenciu pri mieste, ktoré spája miesta, kde bola delécia. Preto použitím PCR s týmto typom priméru sa získajú fragmenty s rôznou veľkosťou inzercie alebo delécie.
Ak môže byť RAPD markerom identifikovaná prítomnosť alebo neprítomnosť špecifických pásov amplifikovanej DNA v závislosti od odrody, ako primér je vybratý z vnútornej bázovej sekvencie RAPD markera oligonukleotid, obsahujúci optimálnu sekvenciu pre polymerázovú reťazovú reakciu. Príkladom takéhoto priméru sú nukleotidy obsahujúce bázovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 35, 36 sekvenčného zoznamu.
Ďalej, ak sa ukazuje, že polymorfizmus je len v mieste, kde sa primáme očko hybridizuje, môže sa vybrať syntetický nukleotid obsahujúci sekvenciu priméru pri 5' konci a obsahujúci 5-20 bázových sekvencií RAPD markera.
Napríklad, keď je použitý primér obsahujúci vnútornú bázovú sekvenciu RAPD markera, a s CR sú touto cestou produkované amplifikované produkty tej istej veľkosti pre všetky odrody, môže sa výberom priméru zvýšiť špecificita. Ako špecifický príklad, je primér obsahujúci bázovú sekvenciu v SEKV. IČ: 15 a 16 sekvenčného zoznamu, môže tiež obsahovať bázovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 12 sekvenčného zoznamu, ktorá je pripojená k bázovej sekvencií pri 5' konci (obr. 5). Ale, ak bázová sekvencia ktorá je pripojená v RAPD markeri, je príliš krátka, zvýši sa v PCR nešpecifická amplifikácia pásov, ktorá robí detekciu polymorfizmu nemožnou. Na druhej strane, keď je príliš dlhá, priméry hybridizujú s každou odrodou, bez ohľadu na prítomnosť alebo neprítomnosť polymorfizmu sú produkované produkty PCR, a detekcia polymorfizmu je znovu nemožná.
Ak sú rozpoznávacie miesta pre reštrikčné enzýmy v bázovej sekvencií RAPD markera, ktorá by umožnila identifikovať odrodu, tak môže byť na obdržanie amplifíkovaných produktov určený primér, ktorý má zachované tieto enzýmom rozpoznávacie miesta. Príklad takéhoto priméru sú nukleotidy obsahujúce bázovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 33, 34 sekvenčného zoznamu.
Keď je primér určený touto cestou, hybridizačná teplota sa môže určiť tak, že vykonanou PCR sú amplifikované len cieľové fragmenty (RAPD marker). Identifikácia DNA amplifikovaných pásov je preto ľahká a získali sa spoľahlivé výsledky.
Syntetické nukleotidy poskytujú jednoduchý spôsob obdržania primárov určených ďalej opísanou cestou. Syntetické priméry použité v tomto vynáleze sa môžu získať použitím komerčného DNA autosyntetizujúceho prístroja, s napr. fosfoamididovou metódou.
Dĺžka reťazca takýchto oligonukleotidov je 15 - 40, vhodnejšie 20 - 30. Vhodne môžu byť použité hociktoré nukleotidy, ktoré obsahujú bázovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 1 - 40 sekvenčného zoznamu.
Okrem toho ďalej, môžu sa použiť syntetické oligonukleotidy obsahujúce časť bázovej sekvencie chmeľovej DNA medzi miestom, ku ktorému sú komplementárne iné syntetické nukleotidy obsahujúce dva druhy bázových sekvencií spomedzi bázových sekvencií opísaných v SEKV. IČ: 15 - 40 sekvenčného zoznamu (napr. 15 a 16, 17 a 18, 35 a 36, AT).
Priméry, podľa predtým uvedeného druhého určovacieho spôsobu amplifikácie polymorfnej oblasti, umožňujú vhodnú identifikáciu založenú na polymorfhých amplifikovaných fragmentoch, t. j. sekvencií obklopujúcej polymorfnú sekvenciu, a tiež obsahujúcich sekvenciu vhodnú na PCR. Použitím týchto primérov môže sa preto uskutočniť presná identifikácia odrody.
PCR reakcia
Ďalej, polymorfná oblasť DNA chmeľu je amplifikovaná s PCR použitím priméru určeného podľa uvedeného prvého alebo druhého určovacieho spôsobu.
PCR reakcia je napr. opísaná Saiki a spol., Science, vol. 230, p. 1350 - 1354. Špecificky, reakcia pozostáva s nasledujúcich krokov: stupeň denaturácie matrice DNA, stupeň hybridizácie priméru s DNA matricou, a stupeň na splnenie replikačného cyklu DNA obsahujúceho predlžovací stupeň s DNA polymerázou s primárom ako štartovacím bodom.
PCR sa uskutočnila tak, že sa spracovala každá odroda v samostatnej reakčnej skúmavke. Reakčný roztok sa pripravil pridaním jedného alebo dvoch typov syntetických nukleotidov, DNA polymerázy, 4 druhov deoxyribonukleotidov (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), DNA z každej odrody chmeľu ako matrica DNA, a amplifikačný tlmivý roztok (obsahujúci okolo 1,0 μ M až 4,0 μΜ, ale vhodnejšie okolo
1,5 μΜ až 3,0 μΜ chloridu horečnatého, chlorid draselný,
SK 284231 Β6 želatínu, hovädzie sérum albumín a povrchovo aktívnu látku (napr. Tween 20, NP-40, Triton X-100 (všetko komerčné názvy) a dimetylsulfoxid). Reakčná skúmavka, obsahujúca reakčný roztok, sa vložila do termocyklovača alebo podobne, a uskutočnil sa vhodný počet cyklov predtým spomenutého DNA replikačného cyklu, napr. okolo 20 až 50 cyklov, ale najvýhodnejšie 25 až 40 cyklov.
PCR reakčné stupne sa môžu uskutočniť, napr. za nasledovných podmienok.
Denaturačný krok sa normálne uskutoční zahriatím od 90 °C do 95 °C, ale výhodnejšie od 94 °C do 95 °C, približne od 1 min. do približne 3 min., ale výhodnejšie od približne 1 min. do približne 2 min.
Stupeň tepelnej hybridizácie priméru sa vykoná inkubáciou s primárom pri 30 °C až 50 °C, ale výhodnejšie pri 35 °C až 42 °C, 1 min. až 3 min., ale výhodnejšie 1 min. až 2 min. Primér môže byť jedného typu alebo kombináciou dvoch, alebo viac typov, podľa priania.
Predlžovací stupeň s DNA polymerázou sa uskutoční v prítomnosti termostabilnej DNA polymerázy, normálne pri 70 °C až 73 °C, ale výhodnejšie pri 72 °C až pri 73 °C, a 1 min. až 4 min., ale výhodnejšie 2 min. až 3 min. Táto termostabilná DNA polymeráza môže byť komerčná termostabilná DNA polymeráza vyrobená PERKIN ELMER s.r.o.
Žiadaná amplifikovaná DNA sa môže získať opakovaním predchádzajúcich stupňov.
Analýza amplifikovaných fragmentov
Amplifikovaná DNA produkovaná PCR reakciou použitím priméru, je frakcionovaná elektroforézou, ktorá je zvyčajnou metódou frakcionácie DNA.
Odroda sa môže identifikovať na základe pohyblivosti obdržaných pásov.
V eíektroforéze, vhodná pohyblivosť pásov sa môže získať použitím 3 % až 20 % polyakrylového gélu pre DNA fragmenty s veľkosťou 1000 párov a menej, a pre dlhšie fragmenty v 0,2 % až 2 % agarózovom géli.
Pre elektroforézu sa môže použiť ako elektroforetický tlmivý roztok Tris - kys. fosforečná systém (pH 7,5 - 8,0), Tris - kyselina octová systém (pH 7,5 - 8,0), Tris - kyselina boritá systém (pH 7,5 - 83), ale výhodnejší je systém Tris - kyselina fosforečná. Ak je potrebné, môže sa pridať EDTA.
Podmienky elektroforézy sú rôzne, a závisia od veľkosti elektroforetickej aparatúry, ale môže byť napr. 50 - 300 V, 10 - 120 min., ale výhodnejšie 150 V, 30 min. Na porovnanie veľkosti sa súčasne dávajú na elektroforézu markery, môžu sa použiť komerčné markery, také ako 100 Base-Pair Ladder (Pharmacia Inc.).
Amplifikovaná DNA môže sa vizualizovať detekovaním s látkami ako jc fenantridínové farbivo, napr. etídium bromid, ktoré môže reagovať s nukleovými kyselinami. Vyfarbovacia technika sa uskutočni alebo pridaním takej látky ako je etídium bromid, aby bola jeho konečná koncentrácia približne 0,5 mg/ml, alebo sa gél po elektroforéze ponorí do vodného roztoku etídium bromidu približne 0,5 mg/ml na približne 10 až 60 min. Keď sa vyfarbený gél ožiari UV svetlom pri 254 nm alebo 366 nm v tmavej miestnosti, môže sa pohyblivosť vzorky detekovať ako červené pásy DNA, ktorá je spojená s etídium bromidom. Cení sa, ak sa pridá farbiaci roztok do elektroforetickej aparatúry, pretože pohyblivosť vzorky sa môže pozorovať dokonca aj počas elektroforézy. Okrem tejto elektroforetickej metódy, amplifikovaná DNA sa môže analyzovať hoci čím, čo môže detekovať jej prítomnosť alebo neprítomnosť, alebo veľkosť.
Identifikácia odrody
Odroda sa môže identifikovať porovnávacou analýzou pohyblivosti vzorky obdržanej ako bolo opísané skôr. Porovnávacia analýza medzi druhmi sa môže vykonať tak, že napr., je založená na rôznej prítomnosti, alebo neprítomnosti, alebo rôznej veľkosti predurčenej amplifikovanej DNA.
Prítomnosť alebo neprítomnosť amplifikovanej DNA v určitých odrodách ukazuje, či primér použitý pre PCR obsahuje sekvenciu pre tepelnú hybridizáciu (t. j. komplementárnu sekvenciu), a množstvo rozdielov amplifikovanej DNA ukazuje, ktoré sú polymorfné sekvencie, tak ako delécia alebo inzercia v častiach amplifikovaných s PCR , ktoré závisia od odrody.
Na presnejšiu identifikáciu odrôd je vhodnejšie nespoliehať sa len na výsledky PCR, ale porovnať pohyblivosť vzorky amplifikovaných fragmentov, keď je použitý ako primér jeden alebo dva rôzne oligonukleotidy.
Okrem toho presnosť, s ktorou sa môže odroda identifikovať, a kapacita na rozlíšenie medzi nimi môže byť dokonalejšia pozorovaním výsledkov obdržaných pri rôznych podmienkach PCR, napr. hybridizačnej teplote, koncentrácii horčíka v reakčnom tlmivom roztoku atď.
Spôsob identifikácie chmeľových odrôd podľa tohto vynálezu, vykonaná predchádzajúcimi postupnými operáciami, môže jasne rozlíšiť rôzne odrody.
Aplikácie
Spôsob identifikácie odrôd podľa tohto vynálezu sa môže aplikovať na overenie čistoty odrôd chmeľu na použitie produktov chmeľu, takých ako chmeľové pelety.
Napr. štúdium urobené na základe rozdielu medzi amplifikovanými DNA obdržanými zo štandardných chmeľov a amplifikovanými DNA obdržanými z chmeľových peletov. Ak je amplifikovaná DNA je detekovaná iná ako tá, ktorá je obdržaná zo štandardného chmeľu, môže sa stanoviť, že iné odrody alebo druhy sú zmiešané so štandardným chmeľom do peletu.
Ak je očakávaná prítomnosť iných odrôd alebo druhov, časť amplifikovanej DNA, množstvo, ku ktorému z iných odrôd alebo druhov patrí, t. j. čistota, môže sa merať pozorovaním, napr. intenzity vyfarbenia s etídium bromidom, ako to bolo opísané.
V tomto prípade tiež presnosť odhadu čistoty sa môže zvýšiť použitím dvoch alebo viac syntetických oligonukleotidov spolu, podľa tohto vynálezu .
Môže sa očakávať, že nukleotidy tohto vynálezu sa môžu aplikovať na identifikáciu iných druhov rastlín ako chmeľu (napr. moruše, jahôd, čerešní atď.). Miesta, kde sekvencia deoxyribonukletidov je v blízkych druhoch rôzna, sú miesta, kde sa zjavujú ľahko mutácie DNA, a preto sú obmedzené. Napr. je opísané, že miesto kódujúce rDNA sa môže použiť na identifikáciu druhov baktérii (E.coli, baktérie mliečneho kvasenia) alebo rastlín (semienok ryže, pomarančov). Preto miesta, ktoré boli podľa tohto vynálezu nájdené ako rôzne v blízkych druhoch, môžu byť pravdepodobne použité tiež na identifikáciu odrôd v iných rastlinách.
Spôsob identifikácie odrody podľa tohto vynálezu vykonáva analýzu založenú na polymorfizme sekvencii medzi druhmi, a preto môže presne rozlíšiť odrody chmeľu bez vplyvu prostredia. Ďalej, identifikačná metóda odrôd podľa toho istého vynálezu môže nielen identifikovať druhy, ale tiež merať čistotu rôznych odrôd chmeľu v chmeľových produktoch.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 je fotografia ukazujúca pohyb vzorky obdržanej, keď časti z DNA Hallertauer Tradition (HT) a Shinshu Wase (SW) boli jednotlivo amplifikované s použitím primárneho priméru (jeden typ priméru: B72), a amplifikované fragmenty boli elektroforézované (podľa spôsobu určenia druhého priméru.)
Obr. 2 je diagram, ktorý ukazuje bázovú sekvenciu amplifikovaných fragmentov vystavených elektroforéze v okoli 600 bp ukázaných šípkou na obr. 1; horná skupina ukazuje bázovú sekvenciu HT a spodná skupina ukazuje bázovú sekvenciu SW. Identické bázové miesta patriace ku HT v hornej skupine sú ukázané čiernymi bodkami (°), a kde je bázová substitúcia v miestach patriacim obidvom, bázy sú ukázané. Miesta, ktoré nepatria k bázam ani jedného typu, t. j. chýbajúce miesta, sú ukázané mínusovou značkou (-).
Orámovaná B72WF2 obsahuje bázovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 27 sekvenčnom zozname, ktorá je vybraná ako identifikačné očko. Rám uzatvárajúci B72WR2 obsahuje bázovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 28 sekvenčného zoznamu, ktorá je komplementárna sekvencia k identifikačnému priméru.
Obr. 3 je fotografia, ktorá ukazuje výsledky elektroforézy frakcionácie amplifikovaných fragmentov, keď PCR je vykonaná použitím priméru obsahujúceho B72WF2 (SEKV. IČ: 27) a komplementárnu sekvenciu B72WR2 (SEKV. IČ: 28) ukázanú na obr. 2.
Obr. 4 je výkres ukazujúci bázovú sekvenciu iného polymorfného amplifikovaného fragmentu (RAPD marker).
Obr. 5 je výkres ukazujúci bázovú sekvenciu ešte iných polymorfných amplifikovaných fragmentov (RAPD marker).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklady 1-12 ukazujú identifikáciu odrody chmeľu pri použití priméru určeného prvým určovacím spôsobom identifikačného priméru.
Príklad 1
Extrakcia genómovej DNA
Použil sa chmeľ Brewer's Gold (ďalej označený ako odroda č. 1), Nothem Brevver (ďalej označený ako odroda č. 2), Tettnanger (ďalej označený ako odroda č. 3), Saazer (ďalej označený ako odroda č. 4), Hersbrucker spaet (ďalej označený ako odroda č. 5), Spalter select (ďalej označený ako odroda č. 6), Hallertauer tradition (ďalej označený ako odroda č. 7), Shinshu Wase (ďalej označený ako odroda č. 8) a Furano Ace (ďalej označený ako odroda č. 9).
Tkanivo zelených listov (surová hmotnosť 1 g) z uvedených odrôd bolo jemne nasekané, a fragmenty tkaniva zmrazené ponorením do tekutého dusíka. Po zmene zmrazených látok na prášok v tekutom dusíku pri použití Polytronu, bola genómová DNA extrahovaná z 50 mg prášku pomocou Súpravy pre DNA krvi a bukových kultúr (QIAGEN Inc.). Nakoniec sa obdržalo 10 -20 mg genómovej DNA.
Príklad 2
Klasifikácia chmeľových odrôd sa vykonala pomocou PCR, ako primér sa použili oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ.l a 2. Polymerázová reťazová reakcia sa uskutočnila v mikroskúmavkách obsahujúcich 50 μΜ MgCl2 a
1,5 μΜ Tris - HCI tlmivý roztok (pH 8,8) obsahujúci 0,1 %
Triton X-100. Do skúmavky sa pridala jedna jednotka termostabilnej DNA polymerázy (Wako Pure Chemicals), 20 nmólov štyroch báz (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 0,1 mg genómovej DNA z každej odrody chmeľu pripraveného podľa príkladu 1, a ako primér sa pridalo 33 ptnólov oligonukleotidov opísaných v SEKV. IČ: 1 a 2. Konečný objem reakcie bol 30 μΐ a ku každej skúmavke sa pridalo približne 20 pml minerálneho oleja, aby sa zabránilo odparovaniu reakčnej zmesi.
Uvedená polymerázová reťazová reakcia sa uskutočnila za nasledovných podmienok. Najprv, po udržaní teploty 94 °C počas 3 minút sa uskutočnil denaturačný stupeň zahriatím pri 94 °C počas 1 minúty a stupeň teplotnej hybridizácie s primérom sa uskutočnil pri 35 °C počas 1 minúty. Predlžovací stupeň s DNA polymerázou sa vykonal uskutočnením 35 cyklov s termostabilnou DNA polymerázou, každý pri 72 °C počas 2 minút a udržaním teploty 72 °C počas 10 minút. Produkt sa uskladnil pri 4 °C.
Amplifikovaná DNA získaná uvedenou polymerázovou reťazovou reakciou sa separovala elektroforézou pri 150 V, počas 30 minút v 100 μΜ Tris - kyselina boritá tlmivom roztoku (pH 8,0), obsahujúcom 2 μΜ EDTA pri použití 5 % polyakrylového gélu. Ako marker veľkosti sa použil 100- Base-Pair Ladder (Pharmacia Inc.).
Po elektroforéze sa gél ponoril do 0,5 mg/ml vodného roztoku etídium bromidu na 10 min., a ožiarený s UV svetlom pri 254 nm, v tmavej miestnosti. Červené pásy, ktoré boli detekované, patrili zlúčeninám DNA s etídium bromidom. Obdržané výsledky sú znázornené v tabuľke 1.
Z tabuľky je jasné, že keď sa použili ako priméry oligonukleotidy obsahujúce deoxyribonukleovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 1 a 2, detekovali sa dva amplifikované genómové pásy s veľkosťou približne 520 bp a približne 530 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov sa chmeľové odrody klasifikovali do dvoch kategórií.
TABUĽKA 1
Príklad 3
Spôsob bol identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako priméry sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 3 a 4, a tepelný hybridizačný stupeň v polymcrázovej reťazovej reakcii sa uskutočnil pri 40 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 1. Keď sa použili ako priméry syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ 3 a 4, detekovali sa dva amplifikované genómové pásy s veľkosťou približne 750 bp a približne 850 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov sa deväť chmeľových odrôd klasifikovalo do štyroch kategórií.
Príklad 4
Spôsob bol identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako priméry sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 5 a 6, a tepelný hybridizačný stupeň v polymerázovej reťazovej reakcii sa uskutočnil pri 40 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 1.
Keď sa použili ako priméry syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ 5 a 6, detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás s veľkosťou približne 270 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu bolo deväť chmeľových odrôd klasifikovaných do dvoch kategórií.
Príklad 5
Spôsob bol identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako priméry sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 7 a 8.
Keď sa použili ako priméry syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ 7 a 8, detekoval sa jeden amplifikovaný génomový pás s veľkosťou približne 370 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu, bolo deväť chmeľových odrôd klasifikovaných do dvoch kategórií.
Príklad 6
Spôsob bol identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako primér sa použil syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 9 a tepelný hybridizačný stupeň v polymerázovej reťazovej reakcii sa uskutočnil pri 40 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 1.
Keď sa použil ako primér syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 9 detckovali sa dva amplifíkované genómové pásy s veľkosťou približne 950 bp a približne 1200 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov bolo deväť chmeľových odrôd klasifikovaných do troch kategórii.
Príklad 7
Spôsob bola identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako primér sa použil syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 10 a tepelný hybridizačný stupeň v polymerázovej reťazovej reakcii sa uskutočnil pri 38 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 2.
Keď sa použil ako primér syntetický oligonukleotid opisaný v SEKV. IČ: 10 detekovali sa tri amplifíkované genómové pásy s veľkosťou približne 650 bp, približne 700 bp a približne 1200 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov bolo deväť chmeľových odrôd klasifikovaných do štyroch kategórii.
TABUĽKA 2
| SEKV. IČ; | 10 | 11 | 12 | |||
| Amplifikovaná DNA (bp) | 650 | 700 | 1200 | 1400 | 550 | 800 |
| Odroda chmeľu | ||||||
| č. | O | O | O | O | ||
| 2 | O | O | ||||
| 3 | O | o | ||||
| 4 | 0 | |||||
| 5 | 0 | |||||
| 6 | 0 | |||||
| 7 | 0 | O | ||||
| 8 | O | O | 0 | 0 | O | |
| 9 | 0 | 0 | O |
Príklad 8
Spôsob bol identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako primér sa použil syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 11 a tepelný hybridizačný stupeň v polymerázovej reťazovej reakcii sa uskutočnil pri 38 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 2.
Keď sa použil ako primér syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 11 detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás s veľkosťou približne 1400 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu bolo deväť chmeľových odrôd klasifikovaných do dvoch kategórií.
Príklad 9
Spôsob bol identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako primér sa použil syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 12 a tepelný hybridizačný stupeň v polymerázovej reťazovej reakcii sa uskutočnil pri 38 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 2.
Keď sa použil ako primér syntetický oligonukleotid opisaný v SEKV. IČ: 12, detekovali sa dva amplifíkované genómové pásy s veľkosťou približne 550 bp a približne 800 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov bolo deväť chmeľových odrôd klasifikovaných do štyroch kategórii.
Príklad 10
Spôsob bol identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako primér sa použil syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 13 a tepelný hybridizačný stupeň v polymerázovej reťazovej reakcii sa uskutočnil pri 38 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 3.
Keď sa použil ako primér syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 13, detekovali sa štyri amplifíkované genómové pásy s veľkosťou približne 500 bp, 640 bp, 650 bp a približne 1400 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov bolo deväť chmeľových odrôd klasifikovaných do piatich kategórií.
Príklad 11
Spôsob bol identický ako v príklade 2, okrem toho, že ako primér sa použil syntetický oligonukleotid opísaný v SEKV. IČ: 14 a tepelný hybridizačný stupeň v polymerázovej reťazovej reakcií sa uskutočnil pri 38 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 3.
Keď sa použil ako primér syntetický oligonukleotid opisaný v SEKV. IČ: 14, detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás s veľkosťou približne 540 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu bolo deväť chmeľových odrôd klasifikovaných do dvoch kategórii.
TABUĽKA 3
| SEKV.IČ: | 13 | 14 | |||
| Amplifikovaná DNA (bp) | 500 | 640 | 650 | 1400 | 540 |
| Odroda chmeľu | |||||
| č. 1 | O | O | O | O | |
| 2 | O | O | O | ||
| 3 | O | 0 | |||
| 4 | O | ||||
| 5 | O | 0 | |||
| 6 | 0 | 0 | |||
| 7 | 0 | 0 | 0 | ||
| 8 | O | 0 | 0 | ||
| 9 | 0 | 0 | 0 |
Príklad 12
Chmeľový pelet, predávaný ako odroda č. 8 (vyrábaný Northem Hop Agricaltural Cooperative, Iwate-ken v licencii Sapporo Breweries Ltd.) bol v mažiari roztlačený na prášok a z 20 mg prášku sa extrahovalo približne 5 mg genómovej DNA s použitím Súpravy pre DNA krvi a bukových kultúr (QIAGEN Inc.). Aplikoval sa ten istý postup ako v príklade 2, ako primér sa použil syntetický oligonukleotid obsahujúci deoxyribonukleotidovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 1 a 2.
Na overenie čistoty sa stanovil rozdiel medzi detekovanou amplifikovanou genómovou DNA a amplifikovaným genómom zo štandardnej odrody č. 8.
Ďalej, identifikácia chmeľovej odrody použitím priméru určeného podľa druhého identifikačného spôsobu určenia priméru, bude opísaná v príkladoch 13-30.
Príklad 13
Extrakcia genómu DNA
Tkanivo zelených listov (surová váha 1 g) z uvedených odrôd sa jemne nasekalo a fragmenty tkaniva sa zmrazili ponorením do tekutého dusíka. Po zmene zmrazených látok na prášok v tekutom dusíku pri použití Polytronu, sa genómová DNA extrahovala z 50 mg prášku pomocou Súpravy pre DNA krvi a bukových kultúr (QIAGEN Inc.). Nakoniec sa získalo 10 -20 mg genómovej DNA.
Príklad 14
Výber RAPD markera
Na obdržanie RAPD markera sa uskutočnila PCR s 0,34 μΜ primérom - B72 (obr. 2).
Polymerázová reťazová reakcia sa uskutočnila v mikroskúmavke obsahujúcej 50 μΜ MgCl2 a 1,5 μΜ Tris - HCI tlmivý roztok (pH 8,8) obsahujúci 0,1 % Triton X-100. Do skúmavky sa pridalo 0,25 jednotiek Taq DNA polymerázy (Nippon Gene K.K.), 200 pmólov každej zo štyroch báz (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 17,5 ng genómovej DNA z každej odrody chmeľu pripravenej podľa príkladu 13. Konečný objem reakcie bol 10 μΐ.
Uvedená polymerázová reťazová reakcia sa realizovala za nasledovných podmienok. Najprv, po udržaní teploty 94 °C počas 1 min., sa uskutočnil denaturačný stupeň zahriatím pri 94 °C počas 30 sekúnd a stupeň teplotnej hybridizácie s primérom sa uskutočnil pri 33 °C počas 1 min. Predlžovací stupeň s DNA polymerázou sa vykonal uskutočnením 35 cyklov s termostabilnou DNA polymerázou, každý pri 72 °C počas 30 sekúnd a udržaním teploty 72 °C počas 1 minúty.
Amplifikovaná DNA získaná uvedenou polymerázovou reťazovou reakciou bola separovaná elektroforézou pri 150 V, počas 30 minút v 100 μΜ Tris - kyselina boritá tlmivom roztoku (pH 8,0), obsahujúcom 2 μΜ EDTA pri použití 5 % polyakrylového gélu. Ako signálny znak veľkosti sa použil Marker 9 (Nippon Gene).
Po elektroforéze sa gél ponoril do 0,5 mg/ml vodného roztoku etídium bromidu na 10 min. a ožiaril s UV svetlom pri 254 nm, v tmavej miestnosti. Červené pásy, ktoré boli detekované, patrili zlúčeninám DNA s etídium bromidom. Získané výsledky sú ukázané na obr. 1.
Z obr. 1 je vidieť, že veľkosť pásov na mieste ukázanom šípkou je rôzna pre HT a SW. Pozícia pásu ukázaného šípkou zodpovedá RAPD markeru.
Príklad 15
RAPD marker pripravený v príklade 14 sa vyrezal z elektrofoTetického gélu, vložený do dializačnej skúmavky, vystavený voltom a eluovaný z gélu.
Ku RAPD markeru obdržaného spôsobom opísaným v „PCR Technology“ (ed., Henry A. Erlich, pub. Takara Shuzo Co., Ltd.) sa pridala rozpoznávacia sekvencia pre reštrikčné enzýmy Bg III alebo Pstl. Po subklonovaní s pUC plazmidom, pri použití týchto sekvencii rozpoznávajúcich reštrikčnými enzýmami, sa stanovila deoxyribonukleotidová sekvencia s dideoxy metódou, a je ukázaná na obr. 2. Na obrázku, bodkový symbol (°) ukazuje tie isté deoxyribonukleotidy ako v hornom rade a čiarky (-) ukazujú chýbajúce bázy. Podčiarknutá časť je deoxyribonukleotidová sekvencia priméru B 72 a deoxyribonukleotidová sekvencia uzavretá rámikom je deoxyribonukleotidová sekvencia, ktorá bude opísaná v ďalšom príklade 16.
Príklad 16
Určili sa RAPD markery získané v príklade 15, syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ 27 v sekvenčnom zozname obdržane prisudzovaním ku deoxyribonukleotidovej sekvencii B72WF2 uzavretej v rámiku, ukázanej na obr. 2 a deoxyribonukleotidová sekvencia opísaná v SEKV IČ: 28 obdržaná z komplementárnej sekvencie B72WR2 (produkcia Sawady Technology).
Tieto syntetické nukleotidy sa použili ako súprava primárov v nasledovnej PCR reakcii. PCR sa vykonala v 10 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 50 μΜ MgCl2 a 1,5 μΜ Tris - HCI tlmivý roztok (pH 8,8) obsahujúci 0,1 % Triton X-100 a 0,25 jednotiek Taq DNA polymerázy (Nippon Gene K.K.), 200 μΜ z každej zo štyroch báz (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 17,5 ng genómovej DNA z každej odrody chmeľu pripravenej podľa príkladu 13, a 0,34 μΜ syntetických oligonukleotidov.
Uvedená polymerázová reťazová reakcia sa uskutočnila za nasledovných podmienok. Najprv, po udržaní teploty 94 °C počas I minúty sa uskutočnil denaturačný stupeň zahriatím pri 94 °C počas 1 minúty a stupeň teplotnej hybridizácie s primérom sa uskutočnil pri 60 °C počas 1 min. Predlžovací stupeň s DNA polymerázou sa vykonal uskutočnením 35 cyklov s termostabilnou DNA polymerázou, každý pri 72 °C počas 30 sek.
Amplifikovaná DNA získaná uvedenou polymerázovou reťazovou reakciou sa separovala elektroforézou pri 150 V počas 30 min. v 100 μΜ Tris - kyselina boritá tlmivom roztoku (pH 8,0), obsahujúcom 2 μΜ EDTA pri použití 5 % polyakrylového gélu. Ako signálny znak veľkosti sa použil Marker 9 (Nippon Gene).
Po elektroforéze sa gél ponoril do 0,5 mg/ml vodného roztoku etídium bromidu na 10 min. a ožiaril s UV svetlom pri 254 nm, v tmavej miestnosti. Červené pásy, ktoré sa detekovali, patrili zlúčeninám DNA s etídium bromidom. Obdržané výsledky sú ukázané na obr. 3.
Ten istý postup sa uskutočnil s inými odrodami a výsledky sú ukázané na obr. 3. Odrody, ktoré sa použili: Fuggle (FU), Cascade (CC), Brcwer's Gold (BG), Northem Brewer (NB), Tettnanger (TE), Saazer (SA), Hersbrucker spaet (HE), Perle (PE), Spatter select (SS) a Furano Ace (FA).
Ak je vidieť z obrázka, pre BG, NB, TE, SW a FA sa pozorovala amplifikácia 329 bp fragmentu (šípka), ktorý obsahuje inzertné miesto. Pri všetkých druhoch bol pozorovaný 299 bp fragment, ktorý inzertné miesto neobsahoval. Tiež sa pozorovali druhovo-špecifické fragmenty 600 bp, 700 bp, 710 bp. Fragmenty sú ľahko identifikovateľné a pozorovala sa vysoká reprodukcia.
Príklad 17
Spôsob je identický s metódou uvedenou v príklade 16, ale ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 15 a 16. Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Z tabuľky je vidieť, že keď sa ako primér použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 15 a 16, detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás približne 500 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu, dvanásť chmeľových odrôd bolo klasifikovaných do dvoch kategórií.
Príklad 18
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 16, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 17 a 18 a stupeň tepelnej hybridizácie v PCR sa uskutočnil pri 62 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 17 a 18, detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás približne 260 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu, dvanásť chmeľových odrôd sa klasifikovalo do dvoch kategórií.
Príklad 19
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 16, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 19 a 20 a stupeň tepelnej hybridizácie v PCR sa uskutočnil pri 65 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 19 a 20, detekovali sa dva amplifikované genómové pásy približne 500 bp a približne 550 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov, dvanásť chmeľových odrôd sa klasifikovalo do dvoch kategórií.
Príklad 20
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 16, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opisané v SEKV. IČ: 21 a 22 . Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak sa ako primér použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 21 a 22, detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás približne 710 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu, dvanásť chmeľových odrôd bolo klasifikovaných do dvoch kategórií.
Príklad 21
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 16, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 23 a 24 . Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak sa ako primér použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 21 a 22, detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás približne 330 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu, dvanásť chmeľových odrôd bolo klasifikovaných do dvoch kategórií.
Príklad 22
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 16, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 25 a 26, a po PCR sa uskutočnilo 20 cyklov PCR, ktoré sa vykonali za tých istých podmienok ako v predchádzajúcej PCR použitím 1 μί reakčného roztoku ako templátu DNA. Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak sa ako primér použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 25 a 26, detekovali sa dva amplifikované genómové pásy približne 160 bp a približne 200 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov, dvanásť chmeľových odrôd bolo klasifikovaných do dvoch kategórii.
Príklad 23
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 16, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 29 a 30 a stupeň tepelnej hybridizácie v PCR sa uskutočnil pri 57 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak sa ako primér použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 29 a 30, detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás približne 350 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu, dvanásť chmeľových odrôd sa klasifikovalo do dvoch kategórií.
Príklad 24
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 22, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy obsahujúce ako deoxyribonukleotidovú sekvenciu opísané v SEKV. IČ: 30 a 31, PCR sa vykonala dvakrát, a reakčný roztok sa vystavil pôsobeniu reštrikčného enzýmu NIalII (Daiichi Pure Chemicals). Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak sa ako primér použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ; 31 a 32, detekovali sa dva amplifikované genómové pásy približne 220 bp a približne 360 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov, dvanásť chmeľových odrôd bolo klasifikovaných do štyroch kategórií.
Príklad 25
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 16, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 33 a 34, stupeň tepelnej hybridizácie v PCR sa vykonal pri 67 °C a reakčný roztok sa vystavil pôsobeniu reštrikčného enzýmu Taq I (Boehringer Mannheim). Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak sa ako primér použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 33 a 34, detekovali sa dva amplifikované genómové pásy približne 220 bp a približne 270 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov, dvanásť chmeľových odrôd bolo klasifikovaných do troch kategórii.
Príklad 26
Spôsob bol identický s metódou uvedenou v príklade 16, len ako primér sa použili syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 35 a 36 a stupeň tepelnej hybridizácie v PCR sa vykonal pri 58 °C. Výsledky sú ukázané v tabuľke 4.
Ak sa ako primér použili syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 35 a 36, detekoval sa jeden amplifikovaný genómový pás približne 440 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti tohto pásu, dvanásť chmeľových odrôd bolo klasifikovaných do dvoch kategórií.
Príklad 27
PCR a elektroforeza sa uskutočnili tou istou cestou ako v príklade 14 s použitím 33 pmólov Beckovho priméru (A25; 5'-GGTTCAAGGCACCA-3'). Ako výsledok sa pozorovalo viac ako desať pásov približne 200 až 2000bp, a pás približne 500 bp, ktorého prítomnosť alebo neprítomnosť bola závislá od druhu, sa použil ako RAPD marker. Výsledky stanovenia deoxyribonukleotidovej sekvencie tohto RAPD markera sú ukázané na obr. 4.
Syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV IČ: 19 a 20 boli podľa sekvencií označených ako A a B uzavreté v rámčeku na obr. 4. Oligonukleotidy opísané v SEKV. ID 37 a 38 boli určené podľa sekvencií označených ako C a D, ktoré sú na obr. 4 podčiarknuté. Tieto oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ: 37 a 38 obsahovali časť RAPD markera.
Oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ 19 a 20 obsahovali primárnu sekvenciu na 5' konci.
Postup bol identický ako v príklade 16 okrem toho, že sa realizovalo 35 tepelných hybridizačných cyklov pri 65 °C s použitím SEKV. IČ: 19 a 20 ako priméru a 30 tepelných hybridizačných cyklov pri 60 °C s použitím SEKV. IČ: 37 a 38 ako priméru. Pri použití SEKV. IČ: 19 a 20 ako priméru sa pozorovali pásy 500 bp a 550 bp ukázané v tabuľke 4, a keď sa použila ako primér SEKV. IČ: 37 a 38, pozoroval sa pás 459 bp. Z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov, dvanásť chmeľových odrôd sa klasifikovalo do dvoch kategórií.
Príklad 28
PCR a elektroforéza sa uskutočnili rovnako ako v príklade 14 s použitím 33 pmólov Beckovho priméru (C16; 5'-CGCCCTGCCAGTA-3'). Ako výsledok sa pozorovalo viac ako desať pásov približne 200 až 2000bp a pás približne 500 bp, ktorého prítomnosť alebo neprítomnosť bola závislá od druhu, sa použil ako RAPD marker. Výsledky stanovenia deoxyribonukleotidovej sekvencie tohto RAPD markera sú ukázané na obr. 5.
Syntetické oligonukleotidy opísané v SEKV IČ: 15 a 16 boli založené na sekvenciách označených ako A a B uzavretých v rámčeku na obr. 4. Oligonukleotidy opísané v SEKV. IČ 39 a 40 boli založené na sekvenciách označených ako C a D, ktoré sú na obr. 5 podčiarknuté.
Sekvencie IČ: 39 a 40 boli použité ako primér a uskutočnilo sa 30 tepelných hybridizačných cyklov pri 60 °C. Amplifikovaný genómový pás 500 bp bol pozorovaný vo všetkých odrodách, ale odrody nemôžu byť identifikované. Na druhej strane, keď nasledoval identický postup s použitím 15 a 16, amplifikované génomové pásy sú ukázané v tabuľke 4, z prítomnosti alebo neprítomnosti týchto pásov, dvanásť chmeľových odrôd bolo klasifikovaných do dvoch kategórií.
Príklad 29
Zo všeobecného pohľadu na tabuľku 4, ktorá sumarizuje typy v príkladoch 16-28, je vidieť, že sa dá rozlíšiť všetkých 12 odrôd chmeľu.
Príklady, kde je urobený zoznam počtu fragmentov, sa vzali ako odporúčanie na identifikáciu odrôd, a príklady, kde sa vykonalo opracovanie s reštrikčnými enzýmami, sú ukázané v zátvorkách ().
TABUĽKA 4
| SadA primár ov SEKV IČ | 0>p) | FU | CC | BG | N B | Odr oda TE | SA | HE | PE | ss | HT | SW | F A |
| 15/16 | 500 | O | 0 | 0 | 0 | ||||||||
| 17/18 | 260 | O | 0 | O | O | O | O | O | 0 | 0 | 0 | ||
| 19/20 | 500 | 0 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | 0 | |||||
| 19/20 | 550 | 0 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | 0 | |||||
| 21/22 | 710 | 0 | 0 | ||||||||||
| 23/24 | 330 | 0 | 0 | ||||||||||
| 25/26 | 200 | 0 | 0 | 0 | 0 | O | 0 | O | O | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 25/26 | 160 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | |||||||
| 27/28 | 710 | 0 | |||||||||||
| 27/28 | 700 | 0 | |||||||||||
| 27/28 | 600 | 0 | 0 | O | 0 | ||||||||
| 27/28 | 329 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||
| 27/28' | 299 | 0 | 0 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | O | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 29/30 | 350 | 0 | 0 | o | O | o | O | 0 | 0 | 0 | |||
| 31/32 | 360 | ||||||||||||
| (NlalII) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||||||
| 31/32 | 220 (NlalII) | 0 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | 0 | |||||
| 33/34 | 270 | ||||||||||||
| (Taql) | 0 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | |||||||
| 33/34 | 220 | ||||||||||||
| α«ιη | 0 | 0 | O | 0 | 0 | o | 0 | 0 | 0 | ||||
| 35/36 | 400 | 0 | |||||||||||
| 37/38 | 459 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||
| 39/40 | 500 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Príklad 30
Shinshu Wase chmeľový pelet (vyrobený Northen Hop Agricultural Cooperatíve, Iwate-ken s licenciou od Sapporo K.K.) sa v mažiari roztlačil na prášok, a z 20 mg prášku sa extrahovalo približne 5 mg genómovej DNA s použitím Súpravy pre DNA krvi a bukových kultúr (QIAGEN Inc.). Čistota získanej DNA sa stanovila tým istým postupom ako je to v príklade 29, s použitím syntetického oligonukleotidu obsahujúceho deoxyribonukleotidovú sekvenciu opísanú v SEKV. IČ: 14 až 40.
Objavilo sa niekoľko nešpecifických pásov a určený marker sa mohol ľahko overiť. Tiež sa dosiahla vysoká reprodukčnosť opakovaných testov čistoty.
Priemyselná využiteľnosť
Podľa genetického identifikačného spôsobu podľa tohto vynálezu sa môže uskutočniť presná a jednoduchá identifikácia odrôd chmeľu, ktorá nie je ovplyvnená prostredím ani inými podmienkami. Genetická identifikačná metóda podľa tohto vynálezu sa môže tiež efektívne použiť na stanovenie čistoty produktov, v ktorých chmeľ je ako surovina.
A tak, s identifikáciou chmeľových odrôd, genetický identifikačný spôsob podľa tohto vynálezu sa môže použiť na udržanie kvality produktov obsahujúcich chmeľ na konštantnej úrovni alebo na zdokonalenie ich kvality.
SEKVENČNÝ ZOZNAM
SEKV. IČ: 1
Dĺžka sekvencie: 19
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1 Topológia: Lineárna Typ sekvencie: Syntetická DNA Opis sekvencie:
CTATTCTGGCTAGTTCTGC
SEKV. IČ: 2
Dĺžka sekvencie: 19
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CTATTTTGGCCAGTTTTGT
SEKV. IČ: 3 Dĺžka sekvencie: 20
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
AGCTGAGCAAGCTTCTTTGG
SEKV. IČ: 4 Dĺžka sekvencie: 20
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CCCTTTATATACACTGCCGA
SEKV. IČ: 5
DÍžka sekvencie: 20
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
TAGCATCGGTAATCTCTCTCGC
SEKV. IČ: 6
DÍžka sekvencie: 20
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
AACATGCTGGGCAACTCCCA
SEKV. IČ: 7
DÍžka sekvencie: 20
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GGAGACATCATCGAATCAGA
SEKV. IČ: 8
DÍžka sekvencie: 21
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
AACCAGAGCAGCCATGTTAGT
SEKV. IČ: 9
DÍžka sekvencie: 10
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNÁ
Opis sekvencie:
CAATCGCCGT
SEKV. IČ: 10
DÍžka sekvencie: 12
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA Opis sekvencie: GCCAGCTGTACG
SEKV. IČ: 11
DÍžka sekvencie: 12
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie: AGGTACGCCCGA
SEKV. IČ: 12
DÍžka sekvencie: 12
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CGCCCTGCAGTA
SEKV. IČ: 13
Dĺžka sekvencie: 12
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CCATCCGCACGA
SEKV. IČ: 14
DÍžka sekvencie: 12
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GGTCAGGCACCA
SEKV. IČ: 15
DÍžka sekvencie: 24
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CGCCCTGCAGTACCTTCCTGTAAG
SEKV. IČ: 16
DÍžka sekvencie: 24
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CGCCCTGCAGTAGAGCACTTCTAT
SEKV. IČ: 17
DÍžka sekvencie: 22
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
SEKV. IČ: 18
Dĺžka sekvencie: 25
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CAATCGCCGTTGAGAAAGTTAAGTA
SEKV. IČ: 19
DÍžka sekvencie: 25
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GGTCAGGCACCATGTACTAGCTGGC
SEKV. IC: 20
DÍžka sekvencie: 25
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GGTCAGGCACCAAGGCCACCATCTG
SEKV. IČ: 21
DÍžka sekvencie: 26
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GCCAGCTGTACGATGCCATGACCTTA
SEKV. IČ: 22 dĺžka sekvencie: 24
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GCCAGCTGTACGCCCCGGAAGGAA
SEKV. IČ: 23
DÍžka sekvencie: 23
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
ACTCACCACGCAGAAACCCAGGC
SEKV. IČ: 24 dĺžka sekvencie: 23
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CCTCGACAAGTGAGATGTTGACC
SEKV. IČ: 25 dĺžka sekvencie: 23
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GCCACATTATCAAGGCAATACAC
SEKV. IČ: 26
DÍžka sekvencie: 20
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GGCATGACTCATGCCAGCTG
SEKV. IČ: 27
DÍžka sekvencie: 22
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GTCCCTCCTAGACACCTACATA
SEKV. IČ: 28 dĺžka sekvencie: 21
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GCTCCTGACAGCAAGGTAAGC
SEKV. IČ: 29 dĺžka sekvencie: 22
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
GAATACTGAGATTTTTATGAGG
SEKV. IČ: 30 dĺžka sekvencie: 20
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CAGGTCATGACTCATTGCTAA
SEKV. IČ: 31
DÍžka sekvencie: 28
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
AAGGTGTTGCGGCCCTTAACAACTTCTT
SEKV. IČ: 32 dĺžka sekvencie: 28
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
AAGGTGTTGCGGAGAGTGTTCTAGAACA
SEKV. IČ: 33
DÍžka sekvencie: 23
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
ATCGAGCGAACGTATCAGCTGCG
SEKV. IČ: 34
Dĺžka sekvencie: 24
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CCTTTCCGACGTCACTAATCGTGG
SEKV. IČ: 35
Dĺžka sekvencie: 24
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
TTAAATGACATGATCACCTCTCCC
SEKV. IČ: 36
Dĺžka sekvencie: 24
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
TAACACAGAGGTACCTCACTGTCT
SEKV. IČ: 37
Dĺžka sekvencie: 21
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CTCCCAATGCACACCTATTTC
SEKV. IČ: 38
Dĺžka sekvencie: 21
Sekvencia z: Nukleovej kyseliny
Počet vlákien: 1
Topológia: Lineárna
Typ sekvencie: Syntetická DNA
Opis sekvencie:
CACCATCTGAAGGAGGTCAAG je; na čo sa uskutoční polymerázová reakcia použitím DNA a prvého priméru (primárov), čím vznikne DNA molekula; na čo sa stanoví sekvencia DNA molekuly; na čo sa zostavia druhé priméry obsahujúce sekvenciu obsiahnutú v DNA molekule, pričom druhý primér obsahuje nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej z SEKV. IČ: 15 až SEKV. IČ: 38, alebo druhý primér obsahuje nukleotidovú sekvenciu obsahujúcu komplementárnu sekvenciu k uvedenej vybranej nukleotidovej sekvencií; na čo sa uskutoční polymerázová reťazová reakcia použitím DNA molekuly a druhých primárov; na čo sa stanoví, či polymerázovou reťazovou rekciou vznikla alebo nevznikla DNA molekula (molekuly); a na čo sa uskutoční identifikácia odrody na základe toho, či DNA molekula (molekuly) vznikli alebo DNA molekula (molekuly) nevznikli.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa pripraví pluralita prvých primérov a polymerázová reťazová reakcia sa uskutoční použitím plurality týchto prvých primérov.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m , že primárom je syntetický oligonukleotid.
4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že druhé priméry obsahujú nukleotidové sekvencie vybrané zo skupiny pozostávajúcej z kombinácií SEKV. IČ: 15 a 16, SEKV. IČ: 17 a 18, SEKV. IČ: 19 a 20, SEKV IČ: 20 a 21, SEKV IČ: 21 a 22, SEKV. IČ: 23 a 24, SEKV. IČ: 25 a 26, SEKV. IČ: 27 a 28, SEKV. IČ: 29 a 30, SEKV IČ: 31 a 32, SEKV. IČ: 33 a 34, SEKV. IČ: 35 a 36 a SEKV. IČ: 37 a 38.
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob identifikácie chmeľovej odrody pomocou náhodne polymorfnej DNA (RAPD), vyznačujúci sa t ý m , že sa pripraví chmeľová odroda a prvý primér (priméry) na amplifikáciu oblasti, ktorá je charakteristická polymorfizmom DNA chmeľovej odrody, pričom prvý primér obsahuje nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúce z SEKV. IČ: 1 až IČ: 8 alČ: 10 až IČ: 14, alebo prvý primér obsahuje nukleotidovú sekvenciu obsahujúcu komplementárnu sekvenciu k uvedenej vybranej nukleotidovej sekvencií; na čo sa DNA z odrody izolu-
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21132895 | 1995-07-28 | ||
| JP13058696 | 1996-04-30 | ||
| PCT/JP1996/002121 WO1997005281A1 (fr) | 1995-07-28 | 1996-07-26 | Methode de differentiation genetique des varietes du houblon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK41797A3 SK41797A3 (en) | 1997-10-08 |
| SK284231B6 true SK284231B6 (en) | 2004-11-03 |
Family
ID=26465679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK41797A SK284231B6 (en) | 1995-07-28 | 1996-07-26 | Method of genetic varietal differentiation of hop |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5948650A (sk) |
| EP (1) | EP0785281B1 (sk) |
| JP (1) | JP4097288B2 (sk) |
| CN (1) | CN1152139C (sk) |
| AU (1) | AU707253B2 (sk) |
| CA (1) | CA2201127C (sk) |
| CZ (1) | CZ296930B6 (sk) |
| DE (1) | DE69632520T2 (sk) |
| DK (1) | DK0785281T3 (sk) |
| SK (1) | SK284231B6 (sk) |
| WO (1) | WO1997005281A1 (sk) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0944741A2 (en) * | 1996-12-02 | 1999-09-29 | Biocem S.A. | Vegetal sequences including a polymorphic site and their uses |
| JP4574263B2 (ja) * | 2004-07-23 | 2010-11-04 | アサヒビール株式会社 | マイクロサテライトｄｎａを用いたホップ品種鑑定法 |
| WO2008035702A1 (fr) * | 2006-09-20 | 2008-03-27 | Sapporo Breweries Limited | Procédé pour la sélection d'une souche de houblon, marqueur d'exsudat pour une utilisation dans la sélection d'une souche de houblon et ensemble d'amorces |
| JP5854493B2 (ja) * | 2011-03-16 | 2016-02-09 | 国立大学法人広島大学 | オオイタビｋｎｏｘ品種変異株の識別方法 |
| WO2013183779A1 (ja) | 2012-06-07 | 2013-12-12 | サントリーホールディングス株式会社 | ホップ品種の識別方法 |
| DE102017005000A1 (de) * | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Gvg Genetic Monitoring Gmbh | Methode zur Genotypisierung von Mausstämmen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994001580A1 (en) * | 1992-07-03 | 1994-01-20 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Fingerprinting |
| US5340728A (en) * | 1992-12-09 | 1994-08-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction |
-
1996
- 1996-07-26 EP EP96925112A patent/EP0785281B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-26 AU AU65317/96A patent/AU707253B2/en not_active Ceased
- 1996-07-26 DE DE69632520T patent/DE69632520T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-26 US US08/809,297 patent/US5948650A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-26 CA CA002201127A patent/CA2201127C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-26 CZ CZ0098697A patent/CZ296930B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-07-26 DK DK96925112T patent/DK0785281T3/da active
- 1996-07-26 CN CNB961908289A patent/CN1152139C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-26 WO PCT/JP1996/002121 patent/WO1997005281A1/ja active IP Right Grant
- 1996-07-26 SK SK41797A patent/SK284231B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-07-26 JP JP50746697A patent/JP4097288B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69632520T2 (de) | 2005-06-02 |
| DE69632520D1 (de) | 2004-06-24 |
| EP0785281A4 (en) | 1999-11-24 |
| EP0785281B1 (en) | 2004-05-19 |
| JP4097288B2 (ja) | 2008-06-11 |
| AU707253B2 (en) | 1999-07-08 |
| CA2201127C (en) | 2003-03-25 |
| CA2201127A1 (en) | 1997-02-13 |
| CN1152139C (zh) | 2004-06-02 |
| AU6531796A (en) | 1997-02-26 |
| CZ98697A3 (en) | 1997-09-17 |
| EP0785281A1 (en) | 1997-07-23 |
| US5948650A (en) | 1999-09-07 |
| WO1997005281A1 (fr) | 1997-02-13 |
| DK0785281T3 (da) | 2004-09-06 |
| SK41797A3 (en) | 1997-10-08 |
| CN1159212A (zh) | 1997-09-10 |
| CZ296930B6 (cs) | 2006-07-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lees et al. | Novel microsatellite markers for the analysis of Phytophthora infestans populations | |
| CN106282394A (zh) | 高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒 | |
| KR101979218B1 (ko) | 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물 | |
| KR101858960B1 (ko) | 단일염기다형성 마커를 이용한 양배추 품종식별 방법 및 키트 | |
| CN110656199B (zh) | 与西瓜果实棉子糖卸载能力相关的snp标记及kasp标记 | |
| SK284231B6 (en) | Method of genetic varietal differentiation of hop | |
| Edwards et al. | Discrimination of three Typhlodromalus species (Acari: Phytoseiidae) using random amplified polymorphic DNA markers | |
| KR101955074B1 (ko) | 무 판별용 snp 마커 | |
| KR102458440B1 (ko) | 고추 역병 저항성 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 고추 역병 저항성 판별 방법 | |
| KR101355914B1 (ko) | 한우 및 수입우 판별에 유용한 단일염기다형성마커 및 이의 용도 | |
| KR101955072B1 (ko) | 무 판별용 snp 마커 | |
| KR102535529B1 (ko) | 수박 순도 검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도 | |
| CN116622888B (zh) | 一种与大豆谷氨酸相关的kasp标记及其应用 | |
| KR102412793B1 (ko) | 국산 밀 품종 판별을 위한 snp 유전자 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR102293251B1 (ko) | 인삼 뿌리썩음병원균 길항미생물 검출용 핵산 분자 및 이를 포함하는 검출 키트 | |
| JP4574263B2 (ja) | マイクロサテライトｄｎａを用いたホップ品種鑑定法 | |
| KR101395645B1 (ko) | 고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 ｒａｐｄ 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법 | |
| EP2768839B1 (en) | Materials for detecting the aryloxyalkanoate dioxygenase gene (aad-12) in soybean plants | |
| KR101929340B1 (ko) | 단일염기다형성 분석을 이용한 서양종꿀벌 계통 판별용 프라이머 세트 또는 이를 함유하는 조성물 | |
| CN114836571A (zh) | 番茄抗白粉病相关的kasp分子标记及其应用 | |
| JP2022173818A (ja) | アカマダラカツオブシムシ検出用オリゴヌクレオチド | |
| KR20220169189A (ko) | 수박 덩굴마름병 저항성 개체 선발을 위한 분자마커 및 이의 용도 | |
| JP2022063510A (ja) | ヒメマダラカツオブシムシ検出用オリゴヌクレオチド | |
| CN118006823A (zh) | 与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用 | |
| KR20130082486A (ko) | 실시간 ｐｃｒ 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20090726 |