KR20130082486A - 실시간 ｐｃｒ 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 - Google Patents

실시간 ｐｃｒ 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실시간 PCR 분석법에 의한 인삼 품종과 관련된 DNA 단편을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 및 프로브 세트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼 품종 판별과 관련된 DNA의 특이적 증폭 결과를 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는데 사용 가능한 유전자별 특이 프라이머와 프로브 세트에 관한 것이다.

Description

실시간 ＰＣＲ 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트{Sets of primers and TaqMan MGB probes for real-time PCR-based assays to discriminate ginseng cultivars}
본 발명은 실시간 PCR 분석법에 의한 인삼 품종 판별을 위한 프라이머 및 프로브 세트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼 품종 판별과 관련한 DNA의 특이적 증폭 결과를 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는데 사용 가능한 유전자별 특이 프라이머와 프로브 세트에 관한 것이다.
종래 유전자의 발현을 측정하기 위해 전통적으로 주로 사용되어 왔던 방법은 분석 대상체로부터 분리한 mRNA와 상보성이 있는 방사선 동위원소로 표지된 DNA 프로브를 결합시켜 방사선 동위원소에 의해 감광되어 나타나는 젤 이미지를 비교하여 정량하는 노던블라팅(Nothern blotting) 분석법(Parker와 Barnes, 1999)이 주류를 이루어 왔으나, 특정처리에 의해 발현되는 목적 유전자의 mRNA 양이 적을 경우 그 감광도가 상대적으로 낮아 개체 간 또는 처리 간의 유전자 발현량의 정량 비교를 정확히 수행할 수 없다는 단점을 지니고 있다(Melton 등, 1984).
또한, PCR 반응기법이 발전됨에 따라 개발된 역전사 PCR법(RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction)은 mRNA를 주형으로 하여 PCR에 입각한 역전사 반응을 통해 cDNA를 만들어 그 상대적 증폭 양을 측정하는 방법(Rappolee 등, 1988)으로 노던블라팅 방법을 대체하여 사용되어 왔으나, cDNA 클로닝 등에 많은 시간과 전문적 기술을 요하는 단점이 있다(Bustin, 2000).
Higuchi 등(1992, 1993)은 분석하고자 하는 목적 유전자의 염기서열과 매우 높은 상보성 및 특이성을 DNA 프라이머(primer)를 이용하여 PCR 반응으로 얻어지는 증폭산물을 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)나 기타 형광염료(fluorescent dyes)로 염색하여 이들이 DNA 증폭산물의 2중 나선 구조에 삽입(intercalating)되도록 한 다음, 자외선으로 조사하여 발색되는 형광을 CCD 카메라로 감지하고, 그것을 PCR 반응의 역학적(PCR kinetics) 모델에 따라 정량적으로 측정하는 시스템을 고안하였다. 이후 이 방법은 특정 유전자의 검출, 유전자 발현의 1차산물인 mRNA의 정량 등에 적용할 수 있는 분석 시스템인 "real-time PCR" (실시간 PCR 반응법)으로 불리게 되었다.
그러나 이 방법은 PCR 과정에서 목적 유전자와 비특이적으로 반응하는 산물이 함께 검출되어 실험결과의 재현성 내지 정확성을 떨어뜨리는 결정적인 약점을 가지고 있었다. 이를 해결하기 위한 대안으로 Holland 등(1991)은 PCR 반응에서 DNA를 증폭하는 중합효소인 Taq DNA polymerase의 5' 말단에서 3' 말단 방향으로의 DNA 절단 특성(5' to 3' exonuclease activity)을 이용하여 목적하는 유전자와 특이적으로 결합하는 표지된 프로브와 1쌍의 PCR 프라이머를 PCR 반응에 사용함으로써 종래의 실시간 PCR 반응에서의 비특이적 산물을 대부분 제거하고 목적 유전자의 부위만을 선택적으로 증폭하는 방법을 개발하였다.
또한, Lee 등(1993)에 의해 5' 말단 부위에 형광을 나타내는 형광염료(5'-reporter fluorescent dye)가 표지되고 3' 말단에 이를 제어하는 quencher 염료가 부착된 "fluorogenic probe"가 개발되면서 보다 간편한 실시간 PCR 반응법이 확립되었고, PE Biosystems 사에 의해 상기 fluorogenic probe에 표지될 2가지 형광염료인 SYBR Green I dye와 TaqMan MGB 프로브가 개발되었고, 특히 실시간 정량을 위한 PCR 기자재가 개발되면서 특정 유전자의 선택적 검출, 유전자 발현량의 정량 분석은 보다 정확하고 간편하게 대용량으로 수행될 수 있게 되었다.
그러나 방사선 동위원소를 이용한 노던블라팅의 젤 이미지만으로는 상기 관련 유전자들의 발현량을 수치화하여 계량적으로 측정할 수 없다는 단점이 있으며, 이는 인삼 품종간의 상기 유전자에서의 차이를 정확히 구명할 수 없다는 것은 물론 동일 종내 개체간의 차이를 유전자 발현량에서 구명할 수 없다는 것과 직결되기에 신품종으로 육성하기 위한 육종프로그램에 활용할 수 없다는 한계가 있다.
또한, 본 발명자들이 보고한 문헌[In & Kim et al (2005), Genetic relationships of Panax species by RAPD and ISSR analyses, Korean Journal of Medicinal Crop Science, 13, 249-253]에서도, 고려인삼 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 선풍, 금풍과 국내외 수집종인 자경종, 황숙종, 미마끼, 석주삼, 죽절삼(P. japonicus), 미국삼을 대상으로 RAPD와 ISSR 기법을 이용하여 이들의 유연관계 및 유전양상을 분석하였으나, 이들 기법을 이용하였을 시 품종 간 구분이 힘들었다.
이러한 결과는 임의의 프라이머를 이용하는 기법의 특성으로, 실험결과의 재현성이 낮고 품종 간 다형성을 찾더라도 유전정보의 획득에 제한이 있어 구별성, 재현성 및 안정성을 확보해야 하는 품종의 표지자로 이용하기에는 적합하지 않은 문제가 있다.
다른 문헌[Yang et al (2001), Comparison of ITS and 5.8S rDNA sequences among varieties and cultivars in Panax ginseng, Journal of Photoscience, 8, 55-60]에서는, 고려인삼 품종인 천풍, 연풍과 수집종인 자경종, 청경, 황숙종의 ITS와 5.8S rDNA 염기서열을 비교 분석한 바, 황숙종이 다른 종들과 구분되는 단일염기서열 다형성(Single nucleotide polymorphism)을 나타낸다고 하였다.
한편, 본 발명자들의 문헌[Kim & Bang et al (2007), Molecular authentication of ginseng cultivars by comparison of internal transcribed spacer and 5.8S rDNA sequences, Plant Biotechnology Report, 1, 163-167]에서는, 고려인삼 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 선풍, 금풍과 국내외 수집종인 자경종, 황숙종, 미마끼, 석주삼, 죽절삼, 미국삼의 ITS와 5.8S rDNA 염기서열과 단일염기서열 다형성 부위를 인식하는 제한효소 TaqⅠ을 처리하여 유전양상을 비교 분석한 바, 고풍과 금풍만이 다른 품종 및 국내외 수집종 들과 구분됨을 보고 하였다.
하지만 이들 방법만으로는 개발된 인삼 품종들을 명확하게 구별하기 어려운 단점이 있었다.
한국특허등록 제10-0215084호에는 RAPD 표식에 의한 고려인삼의 산지 판별방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2004-0034331호에는 단일염기다형성을 이용한 산삼과 재배인삼의 판별방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0610312에는 인삼의 종간 유전자 감별 키트가 개시되어 있으나, 본 발명의 프라이머 세트와는 상이하다.
한편, 인삼의 품종을 구분하기 위해서 활용되는 분자생물학적인 기법 중의 하나인 DNA 표지자를 이용하는 방법은, 우선 대상 시료로부터 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 정량하여야 한다. 그 다음 목적하는 DNA를 증폭할 수 있는 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 목적하는 DNA 단편을 증폭한 후에 전기영동을 하여 에티듐 브로마이드에 염색한 후 UV 트란스일루미네이터로 품종별 DNA 밴드를 확인하여야 한다.
특히 단일염기서열의 다형성(SNP)를 탐색하기 위해서는 PCR을 수행하여 목적하는 DNA 단편을 증폭한 후, 추가적으로 증폭산물에 제한효소를 처리하고 전기영동 과정을 거쳐야 품종의 구분성 여부를 확인할 수 있다. 또 다른 단일염기서열의 다형성을 탐색하는 방법으로는 PCR 증폭산물을 유전자 클로닝 과정을 거쳐 염기서열분석을 수행한 후 얻어진 품종 간 염기서열들을 비교 분석하여 품종 간의 차이를 확인할 수 있다.
이에 반해 실시간 PCR 방법은 상기 과정에서 제한효소 처리, 전기영동 및 염기서열 분석 과정을 생략할 수 있으며, PCR 과정 중에 그 결과를 실시간으로 확인할 수 있어 기존의 분석방법보다 빠르고, 안전하며, 정확하다.
따라서, 본 발명과 같이 실시간 PCR에 의해 목적하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 프로브와 프라이머 및 분석대상 목적 DNA의 상대적 정량측정을 위해 사용되어야 할 대조구로서의 프로브와 프라이머가 개발되어야 인삼 품종간 연구가 활성화될 수 있다.
이에 본 발명의 목적은 실시간 PCR 분석법에 의한 인삼 품종 판별과 관련된 DNA 단편을 증폭하기 위한 특이 프라이머와 프로브 세트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인삼 품종 판별과 관련된 목적하는 DNA단편을 특이적으로 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 실시간 PCR 분석법에 의한 인삼 품종 판별과 관련된 목적하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 특이 프라이머와 프로브 세트를 제공한다.
본 발명은 인삼 품종 판별과 관련된 목적하는 DNA 단편을 특이적으로 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명은 인삼 품종, 구체적으로는 고려인삼 5품종에 유의하게 증폭되는 DNA 단편을 실시간 PCR 분석으로 측정하기 위해 필요한 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브의 염기서열을 제공하는데 기술적 특징을 갖는다. 특히 인삼 품종에 있어서 특정 DNA단편에 대해서 염기서열 분석을 수행하여, 이들 DNA 단편의 특정 부위를 프라이머 및 프로브로 확립시켜 실시간 PCR 반응에 입각한 유전자 발현의 정량분석에 사용할 수 있다.
이때 고려인삼 5종에 속하는 수종들은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong), 또는 선풍(Sunpoong)일 수 있으며, 본 발명의 인삼 품종 판별용 프라이머 쌍 및 프로브의 염기서열은 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명은 특이적인 DNA단편의 증폭량을 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.
상기에서, 실시간 PCR 분석은 상기 DNA 단편의 증폭량을 확인할 수 있는 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하여 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는 것이 바람직하다.
이때 상기 프라이머는 각각 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 포함한 3쌍의 프라이머를 제작하였고, 형광프로브는 5' 말단에는 reporter로써 VIC 또는 FAM을 부착하였고 3' 방향에는 TaqMan MGB 프로브와 MGB-NFQ를 모두 부착한다(표 2참조).
상기에서 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는데 있어서, 상대적 증폭량을 정량적으로 산출하기 위하여 PGP74의 경우 서열번호 1 및2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 3 및 4의 염기서열에 VIC 또는 팸(FAM)으로 표지한 프로브로 구성된 유전자 발현 분석 세트를 사용하는 것이 바람직하며, PGP110의 경우 서열번호 5 및6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 7,8의 염기서열에 VIC 또는 팸(FAM)으로 표지한 프로브로 구성된 유전자 발현 분석 세트를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, PGP130의 경우 서열번호 9 및10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 11,12의 염기서열에 VIC 또는 팸(FAM)으로 표지한 프로브로 구성된 특이적 DNA 증폭 분석 세트를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 프라이머와 프로브 세트를 이용하여 인삼 잎에서 추출된 다수의 전체 DNA 중에서 실시간 PCR 반응에 의해 상기 전술한 DNA 단편으로부터 증폭되는 목적하는 DNA만을 신속하고, 정확하게 증폭하며, 그 증폭량을 정량적으로 측정할 수 있다.
따라서 본 발명에 의한 실시간 PCR 분석법에 의한 인삼 품종 판별과 관련된 목적하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머 및 프로브 세트들은 상기 연구 분야는 물론이고, 품종 개발 분야에 직간접적으로 적용, 활용될 수 있다. 필요에 따라서는 상기 특이적인 DNA 증폭 분석 세트를 포함하여 이루어진 키트를 제작할 수도 있다.
본 발명은 인삼 품종, 특히 고려인삼 5품종에 있어 판별관련 목적하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 실시간 PCR 분석법으로 정량 분석하는 방법을 제공함으로써, 품종별 DNA단편의 증폭결과를 실시간 PCR 반응으로 정량 분석하는데 사용되는 품종별 특이 프라이머와 프로브 세트를 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 프라이머와 프로브 세트들은 인삼 품종의 잎에서 추출된 다수의 전체 DNA 중에서 실시간 PCR 반응에 의해 상기 전술한 특정 염기서열 지역의 DNA만을 신속하고, 정확하게 증폭하며, 그 증폭량을 정량적으로 측정할 수 있어, 인삼 5 품종을 확실하게 구분할 수 있다. 따라서, 각 품종의 지적재산권 보호를 위한 품종 보증 표지자로 사용할 수 있다. 또한 품종 보증을 위한 핵산표지인자로 활용이 가능하여 국내 우수 품종 개발자 및 보급자의 대외 지적재산권을 행사하는데 큰 도움이 될 수 있을 것이다.
이뿐 아니라, 인삼재배 시 혼종 및 가공품 제조 시 외국산 수삼의 국내산 둔갑 등으로 야기될 수 있는 유통시장의 혼란을 바로잡기 위한 기반기술로 이용 가능하고, 인삼 육종 시 품종의 유전적 안정성 (순도)을 높이는 데 활용할 수 있어 품종 혼입을 방지하여 순도 높은 종자를 농가에 보급하는 사업에도 활용할 수 있을 것이다.
도 1은 표 2의 PGP74 프로브 조합을 이용한 인삼 5 품종의 단일염기 서열변이(SNP-A 또는 ANP-G) 탐색 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 표 2의 PGP110 프로브 조합을 이용한 인삼 5 품종의 단일염기 서열변이(SNP-A 또는 ANP-G) 탐색 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 표 2의 PGP130 프로브 조합을 이용한 인삼 5 품종의 단일염기 서열변이(SNP-A 또는 ANP-G) 탐색 결과를 나타낸 그래프이다.
다음의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 권리범위가 실시예에서 제시되는 사항들에만 국한되어 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 인삼 시료 준비 및 DNA 분리
대상 재료로는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 인삼과 시험포장에서 재배중인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍의 5개 품종을 대상으로 하였다.
실험에 사용된 재료는 인삼특작부 육종전문가의 도움을 받아 지상부의 형태적 특징을 1차적으로 파악하여 품종 당 5개체씩의 샘플을 채취하였으며, 증거 자료 확보를 위하여 석엽 표본을 제작하여 인삼특작부 내의 Korea Medicinal Herbarium 내에 별도 보관하였다.
유전자에서 실시간 PCR 분석에 의한 유전자별 프로브 및 프라이머 쌍을 규정하기 위해, 인삼의 게놈 DNA를 확보하기 위하여 3년생 잎을 채취하여 세척한 다음 액체질소로 급냉시키고, 막자사발을 이용하여 마쇄한 다음 QIAGEN사의 DNeasy plant mini kit를 사용하여 DNA를 분리하였다.
분리된 DNA는 1% 아가로스 겔에 λDNA와 함께 전기 영동한 후, EtBr(Ethidium Bromide)로 염색하여 UV광에서 DNA 밴드의 밝기를 상대 비교하여 농도를 측정하였다. 농도 측정이 완료된 각 DNA 샘플은 멸균 중류수를 이용하여 최종 DNA 농도를 10 ng/㎕로 조정하여 PCR 반응시 사용하였다.
실시예 2: PCR 및 전기영동 분석
PCR 반응은 본 발명자들에 의해 기 특허출원된 출원번호 제10-2008-0080459호에 개시된 UGFp74, MFGp110A, MFGp130A 의 3쌍의 STS 프라이머를 이용하여 인삼 5 품종을 대상으로 수행하였다.
참고로, 상기 3쌍의 STS 프라이머 조합은 다음 표 1과 같다:
프라이머 서열(5'-3') 특허문헌내 서열번호 Tm(℃)
1
 KGY+0130A
 F-GGAAAGCGTTCAGCTCTTACG 1 65
R-TAAATGCTGTCAAGCCCAGAG 2
2
 KGY+0110A
 F-AGTCCCAACGGAATTTCATC 5 65
R-GTTTTCCGCTTATGTTGCAG 6
3
 KGY-0074
 F-GCGAATTTCACAGAATTAGACG 7 65
R-ACAGGTCTCGAAACAATTGAAG 8
한편, 인삼 품종 간 다형성을 관찰하기 위하여 수행한 PCR 반응 혼합물 (25 ㎕)의 조성은 다음과 같다: 인삼의 게놈 DNA 50ng, 각 프라이머 20pM, dNTP 200μM, 0.5unit DNA 중합효소, 1XPCR 반응 완충용액(Solgent, Korea)을 사용하였다.
이를 이용한 PCR 반응은 TProfessional (Biometra, Germany)를 이용하여 94℃에서 5 분간 초기변성 후, 94℃ 1 분 변성, 60℃ 1 분 결합 및 72℃ 1분 신장을 총 40 사이클로 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 5 분간 최종 신장 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR산물은 1.5% 아가로겔에서 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 이미지분석기에서 품종 간 유전양상을 확인하였으며, 각각의 인삼 5품종에 대한 PCR 산물들을 유전자클로닝한 후, 품종 간의 염기서열을 비교 분석하였다.
결과적으로, MFGp130 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 천풍, 고풍, 금풍의 3품종은 375bp 크기의 DNA 단편이 관찰되었으며 연풍과 선풍은 322bp 크기의 DNA 단편이 관찰되었다.
또한, UFGp74와 MFGp110A의 2종의 프라이머를 이용하였을 때는 각각 639bp와 930bp의 동일한 크기의 DNA 단편 관찰되었다. 한편 상기과정을 통하여 확보된 DNA 단편들은 유전자클로닝 및 염기서열 비교분석을 수행하였다.
그 결과, MFGp130 프라이머를 이용하였을 때에는 53bp가 삽입/결실되었음을 확인할 수 있었고 1개의 염기서열에 변이가 있음을 확인하였다. 또한 MFGp74 프라이머를 이용하였을 때는 2개의 염기서열 변이를 확인하였으며, MFGp110A를 이용하였을 때는 6개의 염기서열에 변이가 있음을 확인하였다.
실시예 3: 실시간 유전자증폭 사용 프라이머 및 형광 프로브 제작
실시간 유전자증폭 시 사용할 프라이머 및 형광 프로브는 상기의 염기서열 정보를 이용하여 품종 간 변이가 있는 부위를 타겟으로 제작하였다. 우선 프라이머는 각각 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 포함한 3쌍의 프라이머를 제작하였고, 형광프로브는 5' 말단에는 reporter로써 VIC 또는 FAM을 부착하였고 3' 방향에는 TaqMan MGB 프로브와 MGB-NFQ를 모두 부착하였다.
본 발명에 사용된 형광프로브 및 프라이머 조합을 하기 표 2로서 정리하였다:
프로브 조합명 프로브 및 프라이머 염기서열(5‘→3’)
PGP74


 Probe G VIC-CGTTTAACGAATCCTC-MGB(서열 3)
Probe A FAM-CGTTTAACAAATCCTC-MGB(서열 4)
Primer F GCTCAAGAATCGTCAGATTCTGACT(서열 1)
Primer R CGGAATCCGTTAACTTGAAATTCACTT(서열 2)
PGP110


 Probe C VIC-CCTCCCCTAG C TACTCT-MGB(서열 7)
Probe T FAM-CCTCCCCTAGTTACTCT-MGB(서열 8)
Primer F GGCCCTTTCATTCTACAACTCTCAA(서열 5)
Primer R GTCGCCTTGTACCGAGTCAA(서열 6)
PGP130


 Probe C VIC-ACCTCTGA C ATCTTG-MGB(서열 11)
Probe A FAM-CCTCTGAAATCTTG-MGB(서열 12)
Primer F GCACCCCCAAAAGGGCTAAA(서열 9)
Primer R TCGATAGGTGGCTCCATACGAT(서열 10)
실시예 4: 실시간 유전자증폭 및 유전자형 분석
실시간 유전자증폭 반응은 ABI Step One Plus System을 이용하여 수행하였다. PCR 반응 혼합 조성물(10ul)은 인삼의 게놈 DNA 50ng, TaqMan? Universal master mix 5ul, 각 프라이머 300nM, 각 MGB 프로브 200nM을 사용하였으며, PCR 반응 조건은 60℃ 30초, 95℃ 10분 반응 후 95℃ 15초, 60℃ 1분의 2단계로 PCR을 40 사이클 수행하였다. 인삼 5품종 간의 유전자형 분석은 상기의 PCR 조건으로 6개의 TaqMan MGB 프로브와 3쌍의 프라이머를 이용하여 분석하였는데, PCR 반응 시 야생(wild) 타입은 VIC 염료가 부착되어 초록색 시그널을 나타냈고 mutant 타입은 FAM 염료가 부착되어 파란색 시그널을 나타냈다. PCR 수행이 끝난 후 결과 분석은 Step OneTM software ver.2.1(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 실시하였으며, 이러한 과정을 통해서 인삼 품종의 유전자형이 결정되었다.
표 2의 PGP74 프로브 조합, PGP110 프로브 조합, 그리고 PGP 130 프로브 조합을 각각 이용한 인삼 5 품종의 단일염기 서열변이(SNP-A 또는 ANP-G) 탐색 결과를 나타낸 도 1 내지 3에 정리하였다.
그 결과, PGP74 조합을 이용하여 인삼 5품종의 유전자형을 확인한 결과, 천풍과 선풍은 SNP-A 타입으로 연풍, 고풍 및 금풍은 SNP-G 타입의 유전자형을 나타내 두 그룹으로 구분되었다. 또한 PGP110 조합을 이용하였을 때는, 천풍과 고풍은 SNP-T 타입으로 연풍, 금풍 및 선풍은 SNP-C 타입으로 구분되었다.
마지막으로 PGP130 조합을 이용하였을 때는, 천풍, 고풍 및 금풍이 SNP-A 타입으로 연풍과 선풍은 SNP-C 타입으로 구분되었다.
결론적으로, 선발된 3종의 프로브 조합(PGP74, PGP110, PGP130)을 이용한 인삼 5품종의 유전자형은 하기 표3에서 보듯이, 천풍은 ‘ATA', 연풍은 ’GCC', 고풍은 ‘GTA', 금풍은 ’GCA', 선풍은 ‘ACC'의 유전자형을 나타내 이들 유전자형으로 고려인삼 5품종을 기존의 분석방법보다 빠르고, 안전하고, 정확하게 판별할 수 있었다.
프로브 조합명
 품종/유전자형
천풍 연풍 고풍 금풍 선풍
PGP74 A G G G A
PGP110 T C T C C
PGP130 A C A A C
유전자형 조합 ATA GCC GTA GCA ACC
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Sets of primers and TaqMan MGB probes for real-time PCR-based assays to discriminate ginseng cultivars <130> pp <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCTCAAGAATCGTCAGATTCTGACT <400> 1 gctcaagaat cgtcagattc tgact 25 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 2 cggaatccgt taacttgaaa ttcactt 27 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan Probe <400> 3 cgtttaacga atcctc 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan Probe <400> 4 cgtttaacaa atcctc 16 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 5 ggccctttca ttctacaact ctcaa 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 6 gtcgccttgt accgagtcaa 20 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan Probe <400> 7 cctcccctag ctactct 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan Probe <400> 8 cctcccctag ttactct 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 9 gcacccccaa aagggctaaa 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 10 tcgataggtg gctccatacg at 22 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan Probe <400> 11 acctctgaca tcttg 15 <210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan Probe <400> 12 cctctgaaat cttg 14

Claims (5)

  1. 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 11의 염기서열에 빅(VIC)으로 표지한 프로브 및 서열번호 12의 염기서열에 팸(FAM)으로 표지한 프로브로 구성된 인삼 품종 판별용 유전자 발현 분석 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인삼 품종은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong) 또는 선풍(Sunpoong)인 것을 특징으로 하는 인삼 품종 판별용 유전자 발현 분석 세트.
  3. 제1항에 있어서, 프라이머 세트 및 프로브의 염기서열은 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 인삼 품종 판별용 유전자 발현 분석 세트.
  4. 인삼 품종 유전자를 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하되, 실시간 PCR 분석은 제1항의 유전자 발현분석 세트를 이용하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인삼 품종은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong) 또는 선풍(Sunpoong)인 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 분석법에 의해 정량적으로 측정하는 방법.
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