KR102535529B1 - 수박 순도 검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수박 순도 검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 효용성을 확인한 마커세트를 포함하고, 이는 수박 고정도 판별에 활용함으로써 유전적으로 고정된 육성 계통 선발 효율을 높일 수 있다. 빠른 육성 계통의 선발은 신규 품종 육성에 소요되는 시간과 노동력을 단축시켜 수박 육성의 국제적 경쟁력을 높일 수 있다. 또한 판매를 위한 F₁ 종자 생산 시 F₁ 종자의 순도검정에 활용하여 육성계통 종자 유출 및 모본 종자 유출을 방지할 수 있다.

Description

수박 순도 검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도 {SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER SET FOR LINE PURITY CHECKING AND EARLY FIXED LINE SELECTING IN WATERMELON (Citrullus lanatus)}

본 발명은 수박 순도 검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

박과 식물 (Cucurbitaceae) 중 수박속 (Citrullus) 식물은 남아프리카가 원산인 시트루루스 라나투스 (Citrullus lanatus), 북아프리카와 중동 원산인 시트루루스 콜로신디스 (Citrullus colocynthis), 서남 아프리카 원산인 시트루루스 에시어호서스 (Citrullus ecirrhosus) 및 시트루루스 나우디니아누스 (Citrullus naudinianus), 인도 원산인 시트루루스 피스투로서스 (Citrullus fistulosus) 5종으로 분류된다. 우리가 식용으로 먹는 수박은 시트루루스 라나투스 var. 라나투스 (Citrullus lanatus var. lanatus)에 포함되는 것으로 알려져 있다. 또한, 수박은 과형에 따라 타원형계 및 원형계, 생장형에 따라 왜성형 및 포복형으로 구분하고 있다.

한국 수박의 재배면적은 대략 34,000ha에 이르며 메론, 오이, 호박이 속해 있는 박과 작물 중 가장 넓은 지역에서 재배되고 있다. 수박은 한국 전체의 채소 재배면적의 10%에서 재배되고 있으며 이는 고추, 배추, 무에 이어 4위를 차지하고 있다(2001년).

한편, 현재 품종 구별은 전통적인 멘델의 법칙을 적용한 표현형 위주의 형태학적 형질 및 효소나 단백질 변이와 같은 생화학적 특성에 의해 이루어지고 있다. 그러나, 이와 같은 방식은 변이의 빈도가 낮고 전 작물에 대한 적용에 한계가 있으며, 생산자의 재배 조건에 따라 다른 결과를 초래할 수 있어서 정확한 품종 판별이 곤란하기 때문에 분자 수준에서의 품종 구별 방법이 활발하게 연구되고 있다. 예를 들면, 네덜란드에서는 장미 및 토마토에 대해 각 품종별 DNA 프로파일을 데이터베이스화하였고, 일본은 벼 등의 작물에 대한 품종 식별용 분자 마커를 개발하여 품종 보호에 활용하고 있다.

분자표지는 DNA 염기서열의 차이를 대상으로 모든 조직에서 탐지할 수 있으며, 환경적인 영향과 유전자 간의 다면 발현에 의한 영향을 받지 않는다는 장점을 가지고 있다. 현재 주요 작물에 대한 게놈 유전자 지도 작성이 활발하게 진행되고 있고, 분자표지는 육종의 선발 과정에 실제로 활용되고 있다. 식물의 육종 연구에 이용할 수 있는 분자표지가 다양하게 개발되어 왔으며 개발된 분자표지를 대량으로 검증하고 판별할 수 있는 기술과 실험 기자재도 매우 빠르게 개발되고 있다. 시간이 많이 소요되는 기술보다는 PCR을 이용한 RAPD (Random Amplified polymorphic DNA), AFLP (Amplified fragment length polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeat) 및 SNP (Single nucleotide polymorphism) 분석 등 다양한 분자표지 기술이 폭넓게 이용되고 있다. 분자표지 중공 우성 표지 (codominant marker)를 이용하면 유전자의 동형접합 (homozygous) 여부를 판별할 수 있으며, 형질이 발현되기 전에 조사가 가능하여 품종 육성에 있어서 빠른 판별이 가능하다는 장점이 있다.

SNP (Single nucleotide polymorphism)는 개체 간의 DNA에 나타나는 하나의 염기 차이로, 매우 다양한 종의 게놈에 걸쳐서 존재한다. 식물체 게놈에 나타나는 빈번한 SNP는 유전자 지도제작 (mapping), 분자표지 보조 육종 (marker assisted breeding) 및 유전자지도 기반 클로닝 (map-based cloning)을 가능하게 한다. SNP는 게놈 유전자 표지 중 가장 많으며, 이러한 SNP를 검출하기 위해서 실험의 용이성 및 비용을 고려한 다양한 SNP 검출 방 법과 실험장비가 개발되고 있다.

이에 본 발명자들은 SNP와 관련한 수박 순도 검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 마커 세트를 개발한 결과 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2087024 B1

본 발명의 일 목적은 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 목적은 상기 조성물을 포함하는, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 목적은 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기 조성물을 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및 상기 각 증폭된 산물을 분석하여 수박 품종을 판별하는 단계를 포함하는, 수박 품종을 판별하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 조성물을 제공한다.

상기 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)은 DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 말한다. '다형성'이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. "대립유전자"는 한 쌍의 상동염색 체에서 서로 대응하는 부위, 즉 상동하는 유전자자리에 위치하는 대립형질에 대응하는 유전자를 말하며, 같은 염색체 위치 (same chromosomallocus)를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태 (alternative forms) 중 하나를 뜻한다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, CC (A로 표시), CT (H로 표시) 또는 TT (B로 표시)). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 있어서 단일염기다형성은 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 것일 수 있다.

상기 61번째 염기는 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열 상에서 61번째 염기이다. 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열은 각각 수박박의 염색체 상에 존재하는 단일염기다형성 및 측면 서열(Flanking sequence)을 포함한다. 상기 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열에서, 각각의 61번째 염기는 수박의 염색체 상에 존재하는 단일염기다형성으로, 육종에 유용한 형질과 연관되어 있는 것을 선별한 것이다. 상기 단일염기다형성의 대립유전자형을 분석하면 양친과 자손의 염기 차이를 비교하여 원하는 형질을 가지는 수박을 선별하는데 유용할 수 있다.

상기 제제는 선택된 단일염기다형성에 해당하는 염기를 포함하는 연속염기와 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 연속 염기는 5 내지 121개의 염기로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열 중 어느 하나에서, 61번째 위치한 대립유전자 중 어느 하나의 염기 및 이의 측면 서열의 전부 또는 일부로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 상보적인 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 각 서열번호의 염기서열은 61번째 염기에 단일염기다형성이 위치하고, 61번째 염기를 기준으로 상류(upstream) 및 하류(downstream) 방향으로 각각 60bp의 측면 서열(flanking sequence)이 SNP에 연결되어 있다. 각 서열번호의 염기서열에는 1개의 단일염기다형성이 위치한다. 상기 연속 염기의 길이는 SNP 유전자형 판단 방법에 따라 길이가 달라질 수 있다.

일 구체예에 따르면 상기 제제는 검출 또는 증폭하고자 하는 폴리뉴클레오티드에 해당하는 서열번호의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성을 식별하기 위한 것일 수 있다. 상기 제제는 서열번호 중 어느 하나의 61번째 염기에 해당하는 단일염기다형성 대립유전자형 중 어느 하나의 염기 및 이와 연속적인 측면서열의 전부 또는 일부를 포함하는 프라이머일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 제제는 프로브, 프라이머 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.

용어 "프로브"는 특정 표적 서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 프로브는 단일염기다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나 특이적 결합을 이룰 수 있는 것일 수 있다. 상기 프로브는 단일염기다형성의 염기 차이에 따라 결합력의 차이가 있는 것일 수 있다. 상기 프로브는 라벨링(labeling)되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있는 것일 수 있다.

용어 "프라이머"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머는 선택한 SNP 분석 방법에 따라 통상 기술자에게 알려진 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 상기 프라이머 서열은 서열번호 1 내지 219번의 염기서열 중 일부 연속염기와 동일하거나 상보적일 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 다양한 인자, 예를 들어 온도 및 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 HRM(High Resolution Melting) 분석용 프라이머인 경우, 다형성 위치의 염기를 포함하여 HRM 분석에 용이한 크기(예를 들어, 50 내지 500bp 크기)의 증폭산물을 생성할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.

상기 프라이머는 KASP (Kompetitive Allele Specific PCR genotyping system)SNP 분석용 프라이머일 수 있다. KASP 시스템을 이용하면 2 가지 대립유전자형인 SNP를 대량으로 신속히 검출할 수 있다. 상기 시스템은 프라이머로서 LSP(Locus Specific Primer), ASP(Allele Specific Primer) 1, 및 ASP 2를 사용하고 선택적으로 STA(Specific Target Amplification Primer)를 사용한다. 상기 ASP1 및 ASP2는 단일염기다형성의 대립유전자에 대응하여 제작될 수 있다. 상기 ASP1 및 ASP2의 5' 말단 또는 3' 말단은 각각 분석하고자 하는 단일염기다형성의 대립유전자와 동일 또는 상보적인 염기를 가지는 것일 수 있다. SNP 분석은 프로브로서 FAM, HEX를 사용할 수 있다. FAM 및 HEM은 각각 ASP1 및 ASP2 중 어느 하나에 연결된 것일 수 있다. 예를 들면, ASP1 및 ASP2는 SNP의 2개의 대립유전자에 각각 특이적으로 혼성화되어 결과물이 증폭되고, ASP 1 및 ASP2에 연결되어 있는 FAM, HEX 서열의 동반 증폭에 의해 SNP의 유전자형을 확인할 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 제제는 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, 서열번호 8 및 9의 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트, 서열번호 14 및 15의 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트, 서열번호 20 및 21의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 26 및 27의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트, 서열번호 32 및 33의 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 프라이머 세트, 서열번호 38 및 39의 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트, 서열번호 44 및 45의 프라이머 세트, 서열번호 47 및 48의 프라이머 세트, 서열번호 50 및 51의 프라이머 세트, 서열번호 53 및 54의 프라이머 세트, 서열번호 56 및 57의 프라이머 세트, 서열번호 59 및 60의 프라이머 세트, 서열번호 62 및 63의 프라이머 세트, 서열번호 65 및 66의 프라이머 세트, 서열번호 68 및 69의 프라이머 세트, 서열번호 71 및 72의 프라이머 세트, 서열번호 74 및 75의 프라이머 세트, 서열번호 77 및 78의 프라이머 세트, 서열번호 80 및 81의 프라이머 세트, 및 서열번호 83 및 84의 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80 및 83 의 서열은 FAM 형광 물질을 활용하는 프라이머 서열이고 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81 및 84의 서열은 HEX 형광 물질을 활용하는 프라이머 서열이다.

상기 서열번호 1 내지 84의 염기서열은 아래와 같다:

Assays ID	Chr.	SNP Pos (bp)	Sequence	Primer Seq Allele X (FAM)	Primer Seq Allele Y (HEX)	Primer Seq common
Cl-01-7372	Cla97Chr01	7371662	TTTTTTAAAA AATAAAAAAT AGTTTTTTTT GCATTGTGAT ATTTAGGTTA ATATTTTGGG [C/T]CCAATTACT ATATATTTGC AACTACCCAA AAACTTTAGT TACTACTAGC AGGGTTGCAA C (서열번호 1)	CATTGTGATATTTAGGTTAATATTTTGGGC (서열번호 2)	GCATTGTGATATTTAGGTTAATATTTTGGGT (서열번호 3)	TGCAACCCTGCTAGTAGTAACTAAAGTTT
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본 발명의 다른 일 양상은 상기 조성물을 포함하는, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 키트는 PCR 키트, 마이크로어레이, 또는 플루이다임 SNP 분석용 키트일 수 있다.

상기 PCR 키트는 상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 PCR 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 완충 용액을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 DNA 중합효소는 예를 들면, E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우(klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파아지 T7 중합효소인 것일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유하는 것일 수 있다. 또한 상기 PCR 키트는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분을 포함할 수 있다. 상기 PCR 키트는 안내서를 포함하는 것일 수 있다. 상기 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충 용액 제조방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물일 수 있다.

상기 마이크로어레이(microarray)는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 프로브가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것일 수 있다.

상기 플루이다임 SNP 분석용 키트는 플루이다임 시스템용 프라이머를 포함할 수 있고, 구체적으로 STA, LSP, 및 ASP 1&2 프라이머를 포함할 수 있다. 플루이다임 SNP 분석용 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 완충 용액을 더 포함하는 것일 수 있다. DNA 중합효소 및 PCR 완충 용액은 상기 PCR 키트에서 설명한 내용을 참조하여 이해될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기 조성물을 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및 상기 각 증폭된 산물을 분석하여 수박 품종을 판별하는 단계를 포함하는, 수박 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.

상기 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계의 구체적인 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다. 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열복제 및 핵산에 근거한 서 열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 조성물을 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계는 공지의 방법으로 증폭할 수 있다. 구체적으로, 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템 (transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법으로 수행될 수 있다.

상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

상기 각 증폭된 산물을 분석하여 수박 품종을 판별하는 단계는 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 의미하며, 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 단계의 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지 하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32 P 또는 35 S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 조성물은 효용성을 확인한 마커세트를 포함하고, 이는 수박 고정도 판별에 활용함으로써 유전적으로 고정된 육성 계통 선발 효율을 높일 수 있다. 빠른 육성 계통의 선발은 신규 품종 육성에 소요되는 시간과 노동력을 단축시켜 수박 육성의 국제적 경쟁력을 높일 수 있다. 또한 판매를 위한 F₁ 종자 생산 시 F₁ 종자의 순도검정에 활용하여 육성계통 종자 유출 및 모본 종자 유출을 방지할 수 있다.

도 1은 수박 우량 계통 30자원의 re-sequencing 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 효용성이 검증된 KASP 마커 분석 예시를 나타낸 것이다.
도 3은 마커세트의 수박 염색체 내 물리적 위치 분포를 나타낸 것으로 파란색은 효용성이 검정된 마커이다.
도 4는 28개 마커를 활용한 수박 94자원의 고정도 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1. 시험 재료

국내외 수박 품종 육성에 활용하는 우량 계통 30자원을 형태적 특성(과피색, 호피무늬, 과육색 등)의 다양성을 기반으로 선발하였다. 국내 수박 육종 종자회사(A사, B사, C사)에서 각 9점씩 분양하였으며, 국립원예특작과학원 보유 우량 계통 및 병저항성 계통 3점을 활용하였다.

개발한 마커세트 검정을 위해 원예특작과학원 보유 육성재료 93점과 시판 품종 1점을 활용하였다.

1-2. 수박 핵심계통의 re-sequencing 및 SNP 탐색

수박 잎을 파쇄한 후 CTAB 방법으로 DNA를 추출하였다. QC를 통과한 DNA는 Illumina사에서 제공한 방식에 따라 sequencing library 제작에 활용하였다. 이후 Illummina HiSeq X ten 기기에서 염기서열을 분석하였다.

수박(Citrullus lanatus) 97103 (v2) 표준유전체 서열 정보를 기반으로 BWA, SAMtools, GATK 프로그램을 활용하여 SNP를 탐색하였다.

1-3. 유용 SNP 선발 및 KASP 마커세트 개발

우량 계통 30자원에서 탐색한 SNP 중 다형성지수가 높고, 동형접합형의 유전형 비율이 높은 SNP를 선발하였다. 이후 각 염색체 별 3개, 각 SNP간 거리가 1 Mbp 이상이 되도록 선발하여 최종적으로 33개 SNP 연관 서열을 추출하였다.

추출한 33개의 SNP 연관 서열은 LGC 사에 송부하여 KASP 마커세트를 개발하였다.

1-4. KASP 마커세트 효용성 검정

33개 마커세트는 KASP 사 제공 실험방법에 따라 유전형분석을 실시하였다. 분석한 유전형 결과를 바탕으로 육성재료 및 시판품종의 고정도를 판별하였다. 고정도는 유전형을 분석한 전체 마커 중 동형접합형으로 나온 마커의 비율(%)로 계산하였다.

실시예 2: 연구 결과 - 수박 핵심계통 re-sequencing을 통한 SNP 선발

수박 30개 핵심계통의 re-sequencing 결과 시료 당 평균 31M의 시퀀싱 리드를 확보하였다 (도 1).

수박(Citrullus lanatus) 97103 (v2) 표준유전체 기반 SNP 탐색을 수행하였다. 전체 30개 핵심계통에서 다형성을 보이는 12,674개의 유의한 SNP를 탐색하였다. 이 중 전체 11개 염색체에 고르게 분포하면서 다형성 지수(PIC, polymorphism information content)가 높고, KASP 마커로 전환이 가능한 33개 마커를 선발하였다(표 2).

Chr	Length of Chr	No of SNPs	No of KASP assays	Successice marker
Cla97Chr01	36,935,898	1,232	3	3
Cla97Chr02	37,915,939	1,123	3	1
Cla97Chr03	31,872,261	1,029	3	3
Cla97Chr04	27,110,815	755	3	1
Cla97Chr05	35,887,987	1,621	3	3
Cla97Chr06	29,507,460	1,594	3	3
Cla97Chr07	31,939,013	1,166	3	3
Cla97Chr08	28,201,227	894	3	3
Cla97Chr09	37,727,573	1,424	3	2
Cla97Chr10	35,099,344	1,134	3	3
Cla97Chr11	30,886,124	702	3	3
Total	363,083,641	12,674	33	28

선발한 33개 마커세트를 활용하여 육성재료 93점과 시판 품종 1점의 유전형 분석을 수행하였다. 그 결과 5개 마커는 유전형의 다형성을 보이지 않거나 개체 별 유전형을 구분할 수 없었다. 반면 28개 마커는 동형접합형과 이형접합형을 구분할 수 있었다 (도 2). FAM/HEX 형광물질을 활용하는 KASP 실험은 동형접합형은 X축/Y축에 가까운 형광값의 분포(주황색/파란색 점)를 보이며, 이형접합형은 두 축의 중간(녹색 점)에 분포하는 것을 보여준다.

28개 마커세트는 염색체 2, 4번에는 각각 1개, 9번 염색체에는 2개, 이외의 염색체에는 3개가 분포하였다 (도 3).

고정도는 육성재료 93점에서는 77.8-100% 사이, 시판 F₁ 품종인 스피드꿀에서 53.6%로 나타났다 (도 4). 효용성이 검정된 28개 마커세를 활용하면 고정계통과 F₁ 구분이 가능하여 F₁ 종자가 모본이 자가교배되어 생성된 종자인지, 부본 꽃가루를 받아 생성된 종자인지 확인하는 순도검정에 활용할 수 있다.

최종 효용성을 검정한 28개 마커세트의 프라이머 서열은 상기한 바와 같다 (표 1).

상기한 결과들을 요약하면 다음과 같다:

원예적 형질(과피색, 호피무늬, 과육색 등)의 다양성을 보이는 30개 수박 핵심계통을 선발하여 DNA 염기서열재분석(re-sequencing)을 수행하였다. 수박 표준유전체 서열(97103 v2)을 기반으로 유의한 SNP 33개를 선발하여 고속 분석이 가능한 KASP(Kompetitive Allele Specific PCR genotyping system) 마커 형태로 전환하였다.

KASP 마커 33개를 활용하여 원예특작과학원 수박 육성재료 93점 및 시판품종 1점의 유전형을 분석하였다. 최종적으로 효용성이 검정된 28개의 마커세트는 동형접합형, 이형접합형을 구분할 수 있어 육성계통의 고정도 판별 및 품종 육성 시 순도검정에 활용할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER SET FOR LINE PURITY CHECKING AND EARLY FIXED LINE SELECTING IN WATERMELON (Citrullus lanatus) <130> RDA-P210014 <160> 84 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 1 ttttttaaaa aataaaaaat agtttttttt gcattgtgat atttaggtta atattttggg 60 yccaattact atatatttgc aactacccaa aaactttagt tactactagc agggttgcaa 120 c 121 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-01-7372 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 2 cattgtgata tttaggttaa tattttgggc 30 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-01-7372 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 3 gcattgtgat atttaggtta atattttggg t 31 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 4 atctaataga aactccctta atttaagaga ataaaaagca cttttcaagc gcttttcact 60 mtgtaatttt gatttttccc aaaacaagct taatagcaca aggcgatcat tagcttctgt 120 t 121 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-01-12184 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 5 agcacttttc aagcgctttt cactc 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-01-12184 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 6 aaagcacttt tcaagcgctt ttcacta 27 <210> 7 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 7 ctaaacaaat aaatagggga aatagaaaaa gactagaaga taagaaaaaa ggaaaaccca 60 yccattattg atgaaagccg ctaccacaaa atttgatttc attattttcc ggaatatgtt 120 g 121 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-01-33522 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 8 ggtagcggct ttcatcaata atgga 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-01-33522 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 9 gtagcggctt tcatcaataa tggg 24 <210> 10 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 10 tattaggggt gagtattgat agaccgaaaa tcgagccgac cgaccaaaat caactaaatc 60 kaagtcaatc ggtcgaagaa gaggggggac ttagttggtg tcagtttgga aaaatttcaa 120 a 121 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Cl-03-20863 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 17 cactcacatg tctctacatg aac 23 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-03-20863 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 18 atctcactca catgtctcta catgaat 27 <210> 19 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 19 ccatttaatt agatgaacac aacacaacca attggctaat aacattaaga atgaggaata 60 wgcttagttg aatgcccaac tggaaacgtc aaatcactat tcaatataat tcttcctacg 120 t 121 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-03-26913 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 20 tccagttggg cattcaacta agct 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-03-26913 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 21 ccagttgggc attcaactaa gca 23 <210> 22 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 22 cagtatacgt ttttcatgtg agacagtaga tataaagata ctttatatta ttcttaccat 60 yagtctcaat atgataacca ttgcaactta tatatttaaa actcattaaa tttctctttg 120 a 121 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-04-12341 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 23 aagttgcaat ggttatcata ttgagacta 29 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-04-12341 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 24 gttgcaatgg ttatcatatt gagactg 27 <210> 25 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 25 atttatagtt attgttatgt agaggtcaaa tttttttccc tattctaatt aaggcatcaa 60 yatgacatga atttttttag ttgccataaa catacactta aaatcaacat actaaacaaa 120 g 121 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-05-2679 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 26 aatttttttc cctattctaa ttaaggcatc aat 33 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-05-2679 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 27 ttttccctat tctaattaag gcatcaac 28 <210> 28 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 28 ataataataa ataatgattt cttatgcgtt ggtaagttct cttccatctt gccctcaaat 60 waaaaaaagc ttctctccat tgatgataac atagcttaaa gttaagccct aattgatgaa 120 c 121 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-05-11366 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 29 gttctcttcc atcttgccct caaatt 26 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-05-11366 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 30 gttctcttcc atcttgccct caaata 26 <210> 31 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 31 cacacagttg gcaacccagt tcggtgtaac cacacctacg tttgggaggc agagtgccta 60 ratgaaaaaa gtttcactaa tagagttaag cgattataga ggaatgctta tcttatggtt 120 a 121 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-05-24966 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 32 gtttgggagg cagagtgcct aa 22 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-05-24966 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 33 tgggaggcag agtgcctag 19 <210> 34 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 34 tttgttccca ataagttcaa acttatcaag aaggaagatc tttgttattt tcccgtaaag 60 ktggtcatca gaattttatg agaaaagtca caaagggctc aactccttcc tgataagttt 120 g 121 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-06-7473 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 35 gacttttctc ataaaattct gatgaccac 29 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-06-7473 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 36 gacttttctc ataaaattct gatgaccaa 29 <210> 37 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 37 tttcgaacaa atatgttcaa gtaagtatga ccatctgctt gagagagtat gtgattaacg 60 ytaatcattt aacaaaaaaa gaattggttt tagagataaa gttaaacttt ttcatgaaga 120 a 121 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-06-13190 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 38 tgagagagta tgtgattaac gc 22 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-06-13190 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 39 gcttgagaga gtatgtgatt aacgt 25 <210> 40 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 40 tcgctcctct caatactcac tctcactttc aataattcaa catttgatct cgctattgtt 60 yacgttactt gttttcgctt cttgtttcgt atatttttaa tttgaacaga catataacgt 120 t 121 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-06-28475 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 41 gaaacaagaa gcgaaaacaa gtaacgta 28 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-07-4860 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 42 aaacaagaag cgaaaacaag taacgtg 27 <210> 43 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 43 caaaatagtt accaaacaag gtcattgtta tagctatatg taaacaacca agagctcaat 60 ytaacataac ttagtgaata atgctattgg atctcctatt tgtcattatt gaactaaaaa 120 a 121 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-07-4860 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 44 atccaatagc attattcact aagttatgtt aa 32 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-07-4860 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 45 ccaatagcat tattcactaa gttatgttag 30 <210> 46 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 46 gcacattgtc tgtcaaattc aatatggaaa tagttgaatt taatattttt gatgctatga 60 ragctcccaa tcagagtcct cttattttat gtcaaattga tgtgattgat tgtttggaat 120 a 121 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-07-9070 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 47 agaggactct gattgggagc tc 22 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-07-9070 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 48 ataagaggac tctgattggg agctt 25 <210> 49 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 49 tataatacta gttttacctt cactcattag cttaagcttt tgggtcaatt ggtgaattaa 60 rgtggcatta gagcaagtga tttagaggga ttctcgtgtt caaatcctgc tttattattt 120 a 121 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-07-26217 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 50 ctaaatcact tgctctaatg ccact 25 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-07-26217 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 51 ctaaatcact tgctctaatg ccacc 25 <210> 52 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 52 gatggtatat caatgatatt acttaggtag atatcagtga tataacttag gtcaatatca 60 rcgatatcca tgtattagtg atatctgtga tagaacttag gtagatatca ttaatagaat 120 a 121 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-08-4826 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 53 cagatatcac taatacatgg atatcgc 27 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-08-4826 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 54 cacagatatc actaatacat ggatatcgt 29 <210> 55 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 55 ctgtctttgc tcattgtaat ccgttgtgca aaatcgttgt tgaagagtaa aagatcaaga 60 rgataacttt tatcttaggg gatagcctaa ggcattgctt atgattagaa aatggaagat 120 a 121 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-08-14774 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 56 aatcgttgtt gaagagtaaa agatcaagaa 30 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-08-14774 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 57 cgttgttgaa gagtaaaaga tcaagag 27 <210> 58 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 58 caaataaagg gagaaaaaaa aacactctac atacaatgag aatttgtgtt tgtaaattac 60 waaattgaat attataaatt aaatttagat gtacgaaaat tgcactctat attccattat 120 t 121 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-08-26011 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 59 acatacaatg agaatttgtg tttgtaaatt aca 33 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-08-26011 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 60 acatacaatg agaatttgtg tttgtaaatt act 33 <210> 61 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 61 ttggccttgc cctagtggcg aaaaaaggtc aaggtcatta gttcaattcg tggtccctaa 60 yttaggattg aacattctat aagttatgat ccgtaagatt actcgaagtg cgtataagat 120 a 121 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-09-4414 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 62 gatcataact tatagaatgt tcaatcctaa g 31 <210> 63 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-09-4414 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 63 ggatcataac ttatagaatg ttcaatccta aa 32 <210> 64 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 64 tcacaataac ataacataaa attgagaaaa gttcataata ttctcaaggt ctacttctac 60 rtctccccaa cttttgcacg aatgatctaa aaaattttaa tgaactaact ttttcaaaag 120 c 121 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-09-28652 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 65 tcataatatt ctcaaggtct acttctaca 29 <210> 66 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-09-28652 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 66 cataatattc tcaaggtcta cttctacg 28 <210> 67 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 67 ctatctgata gaaatgaaaa gaaactaagg attctacaaa tataaccatt ttcgtctttt 60 ygaaaaaagg gggcaggcaa gaagagaaca ctttaaaatc ttaatttgtg aatgaaaagt 120 g 121 <210> 68 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-10-987 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 68 gattctacaa atataaccat tttcgtcttt tc 32 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-10-987 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 69 ctacaaatat aaccattttc gtcttttt 28 <210> 70 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 70 tggtagacca atgaaaagtc ttagaaaaag aaaaatagac aattgtaata aaagacctga 60 ytaaggatgt aaacatccat gaagaaaccc tggacatgac tgatagtcga attagtaaaa 120 a 121 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-10-4796 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 71 gaaaaataga caattgtaat aaaagacctg ac 32 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-10-4796 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 72 agaaaaatag acaattgtaa taaaagacct gat 33 <210> 73 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 73 taaatattta gaaaaattaa ttaaaaaatc tacatgtatg cattcttttc atttcattgt 60 ygaggcaaag tcgcattcat caactaccct ctattttctt tgtatcaaat aacattttgc 120 t 121 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-10-33916 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 74 acatgtatgc attcttttca tttcattgtc 30 <210> 75 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-10-33916 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 75 ctacatgtat gcattctttt catttcattg tt 32 <210> 76 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 76 atttattcca cctctataag ggtttgttat ctaattttta ccaatttttt caacaaccaa 60 rctctatttt ataaactaaa aaaagtagct tttaaaactt atttttattt ttgaaatttg 120 g 121 <210> 77 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-11-3800 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 77 aaaagctact ttttttagtt tataaaatag agt 33 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-11-3800 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 78 aaaagctact ttttttagtt tataaaatag agc 33 <210> 79 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 79 cgaggatgag ttttcttcac ttgcacgaag ggaatttaat gtagtttatt atgttcaaca 60 rctgtttttt gaaattaata gcagtgtaat tctacctttt catacttctt tgtaattttc 120 a 121 <210> 80 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-11-12000 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 80 agggaattta atgtagttta ttatgttcaa caa 33 <210> 81 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-11-12000 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 81 ggaatttaat gtagtttatt atgttcaaca g 31 <210> 82 <211> 121 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 82 atcacgtgca gcactacaac tttgtcaaaa tttgcttcct attgatttta gccccgcgca 60 ygacgctcta ccttagggga aattttgtaa ttttttactc tttttggcct aattgcttca 120 t 121 <210> 83 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-11-23067 Primer Seq Allele X (FAM) <400> 83 aaatttcccc taaggtagag cgtca 25 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cl-11-23067 Primer Seq Allele Y (HEX) <400> 84 tcccctaagg tagagcgtcg 20

Claims (7)

1. 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열에서 각 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79 및 82 의 염기서열의 61번째 염기에 위치한 단일염기다형성 부위를 포함하는 5 내지 121개의 연속염기 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 제제는 프로브, 프라이머 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함하는 것인, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 조성물
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, 서열번호 8 및 9의 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트, 서열번호 14 및 15의 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트, 서열번호 20 및 21의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 26 및 27의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트, 서열번호 32 및 33의 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 프라이머 세트, 서열번호 38 및 39의 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트, 서열번호 44 및 45의 프라이머 세트, 서열번호 47 및 48의 프라이머 세트, 서열번호 50 및 51의 프라이머 세트, 서열번호 53 및 54의 프라이머 세트, 서열번호 56 및 57의 프라이머 세트, 서열번호 59 및 60의 프라이머 세트, 서열번호 62 및 63의 프라이머 세트, 서열번호 65 및 66의 프라이머 세트, 서열번호 68 및 69의 프라이머 세트, 서열번호 71 및 72의 프라이머 세트, 서열번호 74 및 75의 프라이머 세트, 서열번호 77 및 78의 프라이머 세트, 서열번호 80 및 81의 프라이머 세트, 및 서열번호 83 및 84의 프라이머 세트를 포함하는 것인, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 조성물.
   
5. 제 1 항의 조성물을 포함하는, 수박 고정도 판별 및 순도 검정용 키트.
   
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 키트는 PCR 키트, 마이크로어레이, 또는 플루이다임 SNP 분석용 키트인 것인, 수박 고정도 판별 및 순도 검정을 위한 키트.
   
7. 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 조성물을 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및
   상기 각 증폭된 산물을 분석하여 수박의 고정도를 판별하는 단계를 포함하는, 수박의 고정도를 판별하기 위한 방법.
   

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