KR101856030B1

KR101856030B1 - 꾸지뽕 계통 판별용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101856030B1
Application number: KR1020170029029A
Authority: KR
Inventors: 이신우; 김윤희; 신용욱; 이수진
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2018-05-11

Abstract

본 발명은 꾸지뽕 계통 판별용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 한국 및 다양한 중국 꾸지뽕 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있고 더 나아가 한약재에 혼재되어 있는 꾸지뽕 계통의 혼합 비율도 확인할 수 있고, 교잡종의 교배조합도 판별할 수 있다.

Description

꾸지뽕 계통 판별용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도{SNP markers for the differentiation of Cudrania tricuspidata Bureau lines and use thereof}

본 발명은 꾸지뽕 계통 판별용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 중국 계통 등 꾸지뽕의 다양한 계통을 정확하고 신속하게 판별할 수 있고, 한약재에 혼재되어 있는 꾸지뽕 계통의 혼합 비율도 확인할 수 있고, 교잡종의 교배조합도 판별가능한 꾸지뽕 계통 판별용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 꾸지뽕 계통 판별 방법에 관한 것이다.

꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata Bureau)는 뽕나무과(Moraceae)에 속하는 낙엽활엽 소교목으로 조경, 섬유(잎), 상황버섯 종균 접목용 등의 용도로 널리 재배되고 있다. 민간에서는 줄기와 뿌리를 암 치료용으로 많이 사용되고 있으나, 식품의약품안전처에서는 이들의 식품원료 사용을 법적으로 금지하고 있으며, 열매와 잎만 식용으로 가능하도록 하고 있다.

꾸지뽕 나무에 관한 연구는 항암 활성 물질의 탐색 등으로 간암 세포인 HepG3에 세포독성을 보이는 물질들이 동정 되었고, Zou 등(2005, Chem Biodivers. 2 (1) : 131-138)은 꾸지뽕 근피로부터 소화기계 암 세포주에 저해활성을 보이는 이소프레닐화 크산톤(isoprenylated xanthone) 또는 이소프레닐화 플라바논(isoprenylated flavanones)계에 속하는 물질들을 분리하였다. 또한 Wang 등(2005, Planta Med. 71 (3) : 273-274)은 이소프레닐화 크산톤(isoprenylated xanthone)인 쿠드라푸루티크산톤 A (cudrafrutixanthone A) 화합물을 꾸지뽕 뿌리에서 분리하여 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주의 활성을 저해하는 항진균 작용도 확인하였다고 보고하였다. An 등(2006, Biol Pharm Bull 29: 838-840)은 간암에 효능이 있음을 보고하였고, Tian 등(2005,Arch Pharm Res. 28(1): 44-48)도 HepG2 cell에 타크린(Tacrine)으로 유도한 간 독성을 저해하는 결과를 보고하였다.이외에도 꾸지뽕 나무는 혈압강하작용(Kang 등, 2002, Life Sci 70:2599-2609), 항우울 작용, 파킨슨병 예방 (Han 등, 2005, Arch Pharm Res.28(12):1324-1327), 고지혈증과 동맥경화 억제(Park 등, 2006, Bioorg Med Chem Lett 16: 5580-5583)의 효능이 있음이 보고되었다.

꾸지뽕이 속한 뽕나무과(Molaceae) 식물은 세계적으로 73 속 1,000여 종이 알려져 있으며, 국내에는 5 속 10여 종의 뽕나무과 식물이 서식하고 있는 것으로 보고된 바 있다(Lee 등, 1985, Shingo plantbtaxonomy, Hyangmunsa; 1986, Dendrology, Hyangmunsa). 현재의 문헌에 의하면 꾸지뽕나무는 인도, 중국, 호주 등에서 각 1종씩 3종과 일본에 2종이 자생하고 있는 것으로 알려져 있다(上原敬仁, 1959, 樹木大圖設, 有明書房, 東京).

최근 나고야의정서의 발효 등의 국제추세에 따라 국내에서 자생하는 꾸지뽕나무와 중국, 일본 등의 계통과 구분이 가능한 마커의 개발이 필요한 실정이나 기존에 수행되었든 형태학적 연구(Kwon 등, 2014, Korean J Plant Research 27(4):337-343), ITS 유전자의 염기서열 비교 분석 등의 분자생물학적 연구 (2001,Korean J. Seric. Sci. 43(1):1-8; 2012, J. Agri & Life Sci, 43(2):32-36) 등은 아직 크게 부족한 실정이다.

본 발명의 배경기술로는 대한민국 등록 특허 제10-0701607호에 토포아이소머라제 Ｉ 저해 활성을 갖는 구지뽕나무로부터 분리된 쿠드라플라바논 Ａ를 함유하는 암예방 및 치료를 위한 조성물이 기재되어 있다.

본 발명자들은 국내의 재배단지 또는 유통시장 등에서 수집한 꾸지뽕 계통에 대한 지속적인 연구를 수행하는 과정에서, 핵 내 유전자는 기존에 보고한 중국계통에 속하나 엽록체 유전자로는 중국도 한국계통도 아닌 새로운 계통을 추가로 발견하여 이 중국계통을 중국계통 2로 명명하는 한편 기존의 보고된 중국계통은 중국계통 1로 명명하여, 이들 두 계통을 구분하여 판별할 수 있는 분자 마커 및 그 적용기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 의한 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 의한 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용한 꾸지뽕 계통의 혼합비율 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신속하고 정확하게 꾸지뽕 계통을 판별할 수 있는 꾸지뽕 계통 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신속하고 정확하게 꾸지뽕 교잡종을 판별할 수 있는 꾸지뽕 교잡종 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 기재의 조성물을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 154번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 154번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 467번째 염기는 T 또는 G이고, 상기 467번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 650번째 염기는 C 또는 A이고, 상기 650번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 Mat K 유전자에서 유래된 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 12 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 12 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 12 및 22의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 12 및 24의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 25 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 26 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 27 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 28 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 29 및 30의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 33 및 36의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 34 및 37의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 35 및 38의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 39 및 42의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 40 및 43의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 41 및 44의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 기재된 조성물을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 꾸지뽕 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계에서 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 141번째 염기가 A인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 143번째 염기가 C인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 270번째 염기는 G인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 466번째 염기는 G인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 482번째 염기는 C인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 488번째 염기는 G인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 561번째 염기는 T인 경우; 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 565번째 염기는 G인 경우, 한국산 꾸지뽕 계통으로 판별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계에서 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 141번째 염기가 T인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 143번째 염기가 T인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 270번째 염기는 A인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 466번째 염기는 C인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 482번째 염기는 G인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 488번째 염기는 A인 경우; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 561번째 염기는 C인 경우; 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 565번째 염기는 A인 경우, 중국산 꾸지뽕 계통으로 판별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 꾸지뽕 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 10 및 11의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계에서 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 154번째 염기가 A인 경우; 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 467번째 염기는 T인 경우; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 650번째 염기는 C인 경우; 한국산 꾸지뽕 계통이라고 판별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계에서 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 154번째 염기가 G인 경우; 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 467번째 염기는 G인 경우; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 650번째 염기는 A인 경우; 중국산 꾸지뽕 계통이라고 판별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 꾸지뽕 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및 전기영동의 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 12 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 26 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 28 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 12 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 12 및 22의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 12 및 24의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 39 및 42의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 40 및 43의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 41 및 44의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 꾸지뽕 계통 판별용 SNP 마커를 활용하여 한국 토종 및 다양한 중국 계통의 기원을 정확하고 신속하게 판별할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면, ARMS-PCR용 프라이머쌍을 제공하여 한약재에 다양한 형태로 혼용 또는 혼재되어 있는 꾸지뽕 계통의 혼합 비율도 용이하게 확인할 수 있다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 핵내에 존재하는 ITS 유전자에 존재하는 SNP 마커를 이용하여 PCR용 프라이머쌍을 제공하며, 상기 프라이머쌍과 엽록체에 존재하는 trnL - trnF 및 matK 유전자 단편에서 개발한 판별 마커를 상호 이용하면 두 계통간의 상호 교배에 의해 생산된 교잡종 여부 및 교잡종의 교배 조합의 부본 및 모본을 판별할 수 있다.

도 1은 꾸지뽕 계통별 ITS 유전자의 염기서열을 비교한 결과 및 판별용 프라이머의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 ITS 유전자 마커를 이용한 한국과 중국계통의 판별 결과를 나타낸 사진이다. 도 2의 좌측은 한국계통 특이 판별용 프라이머 (503F+462R)를 이용하여 PCR을 수행한 결과이고, 도 2의 우측은 중국계통 특이 판별용 프라이머 (440F+442R)를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다. K는 한국계통(2014-2), C는 중국계통 1(2014-1)로 확인된 대표 시료이며, 나머지는 각각 수집된 계통들의 일련번호이다.
도 3은 수집된 꾸지뽕 계통별 TrnL - TrnF 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과 및 중국계통 1과 중국계통 2의 판별용 프라이머 위치를 나타내는 도면이다.
도 4는 수집된 꾸지뽕 계통별 Mat K 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과 및 중국계통 1과 중국계통 2의 판별용 프라이머 위치를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 TrnL - TrnF 유전자 마커를 이용한 ARMS-PCR 결과를 나타낸 사진이다. 도 5의 좌측은 한국계통 특이 판별용 프라이머쌍 (405F+459R)을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타내고, 도 5의 우측은 중국계통 1 특이 판별용 프라이머쌍(405F+452R)을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. K는 한국계통(2014-2), C는 중국계통 1(2014-1)로 확인된 대표 시료이며, 나머지는 각각 수집된 계통들의 일련번호이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 TrnL - TrnF 유전자 마커를 이용한 ARMS-PCR 결과를 나타낸 사진이다. 도 6의 좌측은 한국계통 특이 판별용 프라이머쌍들을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타내고, 도 6의 우측은 중국계통 2 특이 판별용 프라이머쌍들을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. K는 한국계통(2014-2), C는 중국계통 2로 확인된 대표 시료이며, 나머지는 각각 수집된 계통들의 일련번호이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 MatK 유전자 마커를 이용한 ARMS-PCR 결과를 나타낸 사진이다. 도 7의 좌측은 한국계통 특이 판별용 프라이머쌍들을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타내고, 도 7의 우측은 중국계통 1 특이 판별용 프라이머쌍들을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. K는 한국계통(2014-2), C는 중국계통 1(2014-1)로 확인된 대표 시료이며, 나머지는 각각 수집된 계통들의 일련번호이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 MatK 유전자 마커를 이용한 ARMS-PCR 결과를 나타낸 사진이다. 도 8의 좌측은 한국계통 특이 판별용 프라이머쌍들을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타내고, 도 8의 우측은 중국계통 2 특이 판별용 프라이머쌍들을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. K는 한국계통(2014-2), C는 중국계통 2로 확인된 대표 시료이며, 나머지는 각각 수집된 계통들의 일련번호이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 141번째 염기는 A 또는 T이고, 상기 141번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 143번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 143번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 270번째 염기는 G 또는 A이고, 상기 270번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 466번째 염기는 G 또는 C이고, 상기 466번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 482번째 염기는 C 또는 G이고, 상기 482번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 488번째 염기는 G 또는 A이고, 상기 488번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 561번째 염기는 T 또는 C이고, 상기 561번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 565번째 염기는 G 또는 A이고, 상기 565번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명에 의한 상기 SNP 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 이용하여 한국산과 중국산 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 1).

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오티드는 ITS(intergenic transcribed spacer) 유전자에서 유래된 것이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 선택적으로 서열번호 8 및 9의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명에서는 상기 SNP를 확인한 후 상기 SNP에 이웃하고 있는 2, 또는 3번째의 염기를 변경하여 미스매치 프라이머(mismatch primer)를 제작하여 PCR 반응과정에서 특이성을 증대시킨 ARMS-PCR(amplification refractory mutation system-PCR)기술을 적용하여 판별력의 정확도를 더욱 높였다(Han 등, Mol Biol Rep (2016) 43:323332). 상기 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 이용하여 한국산과 중국산 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 2).

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 키트는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함한다.

본 발명에 있어 상기 키트는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마이크로어레이 키트일 수 있다.

본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 154번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 154번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 467번째 염기는 T 또는 G이고, 상기 467번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 650번째 염기는 C 또는 A이고, 상기 650번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명에 의한 상기 SNP 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 이용하여 한국산과 중국산 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 4).

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 12 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

상기 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 이용하여 중국산 계통 1을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 5).

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 12 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 12 및 22의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 12 및 24의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

상기 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 이용하여 중국산 계통 2를 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 6).

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 25 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 26 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 27 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 28 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

상기 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 이용하여 한국산과 중국산 계통 1을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 7).

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 29 및 30의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 33 및 36의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 34 및 37의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 35 및 38의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 39 및 42의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 40 및 43의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 41 및 44의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

상기 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 이용하여 한국산과, 중국산 계통 2를 포함한 중국산 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 8).

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 기재된 본 발며의 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 꾸지뽕 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명에 있어서, 상기 대상 시료로부터 핵산을 분리하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다. 대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 염기서열을 분석하는 단계는 특정서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelsteinet al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립유전자-특이적 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계에서 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 154번째 염기가 A 또는 G인 경우; 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 467번째 염기는 T 또는 G인 경우; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 650번째 염기는 C 또는 A인 경우; 한국산 꾸지뽕 계통이라고 판별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 꾸지뽕 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 8 및 9의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및 전기영동의 결과를 분석하는 단계를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별 방법이 제공된다.

상기 방법에 의하면, 한국산과 중국산 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 2).

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 12 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 26 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 28 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 방법에 의하면, 중국계통 1 여부를 판별할 수 있다(도 5 및 도 7).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 12 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 12 및 22의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 12 및 24의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 39 및 42의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 40 및 43의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 41 및 44의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 방법에 의하면, 중국계통 2 여부를 판별할 수 있다(도 6 및 도 8).

본 발명에 따른 꾸지뽕 계통 판별 방법에 의하면, 먼저 핵 내의 유전자 마커 ITS 마커를 이용하여 구분한 후, 중국계통 개체에 대해 엽록체 유전자 마커인 trnL - trnF 및 matK 유전자 마커를 사용하여 판별하면 현재까지 국내에서 재배되거나 시중에 건제품으로 유통되고 있는 3종의 꾸지뽕 계통을 구분할 수 있다.

< 실시예 >

시료

하기 실험에서 사용한 꾸지뽕 계통은 경남 산청군 생비량면의 농가(김광연)에서 중국(2014-41) 혹은 한국 계통(2104-42)의 기원이 확실하게 알려진 계통을 확보하였으며, 이 외에 2016년도에 경남산청군, 사천시, 진주시 경남과학기술대학교, 밀양시 그리고 자연애제약사를 통하여 중국으로부터 직접 수입한 건줄기 등 총 7점을 대상으로 그 기원을 판별하기 위한 실험을 수행하였다 (표 1 참조). 중국계통으로 그 기원을 알고 있으며, 본 발명자에 의해 기개발된 판별마커로 중국계통으로 확인된 시료번호 2014-41번은 중국계통 1로 명명하였으며, 2014-42번 시료는 본 발명자에 의해 기개발된 판별마커에 의해 한국계통으로 확인된 것이다. 그리고 밀양시에서 수집한 시료번호 2016-10은 잎과 줄기를 확보하여 각각 2016-10-6과 2016-10-9로 표기하였으며, 2016-47 시료는 중국에서 수입된 건줄기 시료이다.

표 1은 본 발명자들에 의해 수집 및 보관중인 꾸지뽕 계통 현황을 나타낸 것이다.

계통별 게놈 DNA 분리

수집된 계통별로 일정량의 줄기, 잎 등을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 곱게 갈아서 얻은 분말을 이용하여 GeneAll사의 Exgene^TM Plant SV 킷트를 이용하여 제조사에서 제공한 실험방법에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 정제된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DNA의 분리과정에서의 분해정도를 확인한 후 Micro-spectrometer (BioPrince, SD-2000, Gangwon, South Korea)를 이용하여 234nm, 260nm, 280nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A₂₆₀/A₂₈₀ 값이 1.8-2.2 범위 그리고 A₂₃₄/A₂₆₀ 값이 0.5-0.8 범위 내 포함 여부를 조사하여 RNA 및 단백질 등의 오염정도를 확인하여 순수한 DNA를 확보하였다.

< 실시예 1> 한국과 중국 꾸지뽕 계통의 판별용 핵내 DNA 판별 ARMS- PCR 프라이머 개발

2016년도에 국내의 재배포장 및 유통시장 그리고 중국에서 수입되는 과정에서 확보한 꾸지뽕 계통들의 게놈 DNA를 분리한 후 먼저 핵 내에 존재하는 ribosomal DNA의 ITS(internal transcribed spacer)의 염기서열을 비교분석하기 위하여 기존에 알려진 프라이머쌍(Forward, 5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′(서열번호 2); Reverse,5′- GCCGTTACTAGGGGAATCCTTG-3′(서열번호 3))를 이용하여 rDNA 단편을 증폭한 후 염기서열분석을 한 후 상호 비교분석한 결과 시료번호 2016-33, 34, 36번은 한국계통과 동일한 것으로 그리고 2016-10과 47은 중국계통으로 확인되었다(도 1 참조).

도 1에서 보는 바와 같이 8개의 SNP를 확인하였으며 이중 2개의 SNP가 인접하여 있는 부위에서 각 계통을 판별하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 제작하였으며 중국계통 판별용 프라이머는 SNP를 보이는 프라이머를 그대로 사용하였으나 한국계통 판별용 프라이머는 인접한 염기를 임의로 변경한 ARMS-PCR용 프라이머를 제작하였다. 즉 정방향 프라이머의 3′-말단에 바로 이웃한 염기 G를 T로 그리고 역방향 프라이머의 3′-말단에서 3번째 염기 A를 T로 변경하였다(표 2 참조).

표 2는 한국과 중국 꾸지뽕 계통간 교잡종을 판별하기 위한 핵내 ITS DNA의 SNP를 포함하는 프라이머와 ARMS-PCR용 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 붉은 색은 SNP, 초록색은 임의로 변경시킨 염기서열이다.

상기 프라이머를 사용하여 각 계통별 유전자의 증폭은 iNtRON사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하였으며, 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 순수 분리한 DNA 50 ng과 프라이머를 각각 10 pmole을 혼합 한 후 94℃에서 5분간 DNA를 변성 시킨 후 94℃에서 30초, 각 프라이머쌍로 주어진 Tm값 온도에서 10초, 72℃에서 30초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 72℃에서 5분간 연장반응을 시킨 후 4℃에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA밴드는 2.0% agarose gel을 이용하여 전기 영동하여 그 결과를 확인하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 2016-33, 34, 36은 한국계통 즉 2014-42(K), 그리고 2016-10-6, 10-9, 47은 중국계통 즉 2014-41(C)와 동일한 밴드를 각각 확인하여 손쉽게 판별이 가능하였다.

따라서 상기한 프라이머쌍들은 핵 내 유전을 하는 ITS 유전자 단편을 이용한 것이므로 한국계통과 중국계통간의 상호교배에 의한 교잡종의 출현 시 판별이 가능할 것으로 판단된다. 특히 최근에 중국에서 도입된 중국종이 대량으로 재배되면서 국내 전역에서 한국산 계통과 서로 교잡이 되어 유통되고 있을 것으로 사료되며, 이러한 교잡종은 이하 설명되는 엽록체 내에 존재하는 판별 마커를 같이 사용할 경우 모계 또는 부계의 구분도 가능하다. 즉 엽록체 내에 존재하는 유전자는 모계유전을 하고 핵에 존재하는 유전자는 교배에 의하여 유전을 하기 때문에, 교잡종이 출현하면 모계 또는 부계의 구분도 가능하다.

< 실시예 2> 엽록체 유전자 단편( trnL - trnF 와 matK ) 염기서열 분석 및 단일염기다형성의 확인

엽록체 유전자( TrnL - TrnF 와 MatK )의 증폭 및 염기서열 분석

엽록체 유전자 내의 단일염기다형성을 확인하고자 TrnL - TrnF 유전자 단편과 MatK 유전자 단편의 증폭을 위하여 표 3에 요약한 바와 같이 기존에 알려진 유전자의 염기서열정보를 사용하여 각각의 프라이머를 제작하였다. 즉 TrnL - TrnF 유전자단편은 GenBank에서 Accession number (JN006418.1), 그리고 MatK 유전자 단편은 (JF317421.1)의 염기서열들로부터 각각의 프라이머를 제작하였다.

표 3은 엽록체 게놈의 SNP 개발을 위하여 사용한 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

유전자의 증폭은 iNtRON사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하여 중합반응과정에서 야기 될 수 있는 돌연변이를 최소화 하였다. 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 순수 분리한 DNA 50 ng과 프라이머를 각각 10 pmole을 혼합 한 후 94℃에서 5분간 DNA를 변성 시킨 후 94℃에서 30초, 60℃에서 10초, 72℃에서 30초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 72℃에서 5분간 연장반응을 시킨 후 4℃에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA밴드는 2.0% agarose gel을 이용하여 전기 영동하여 그 결과를 확인하였다. 증폭되어진 각 유전자 단편의 클로닝과정에서 돌연변이가 일어날 수도 있으므로 클로닝을 하지 않고 증폭된 DNA단편을 Expin^TM PCR SV (GeneAll, Seoul, South Korea)Kit를 사용하여 순수정제한 후 직접 염기서열분석을 의뢰하였다. 또한, 최종적으로 확인된 단일염기다형성(SNP)은 최소 5반복 이상 수행하여 검정하였다.

엽록체 유전자 단편( trnL-trnF 와 matK )내에 존재하는 단일염기다형성의 확인

국내에 자생하는 것으로 확인된 한국계통과 중국에서 도입된 종으로 확인된 꾸지뽕 계통을 대표로 하여 국내 또는 중국에서 수집된 꾸지뽕 시료를 대상으로 trnL - trnF와 matK 유전자단편을 증폭하여 염기서열 분석을 수행하여 그 결과를 비교하여 본 바 trnL - trnF 유전자 단편의 경우 기존에 알려진 한국계통 및 중국계통 1과는 또 다른 중국계통을 확인하였다. 즉 시료번호 2016-33, 34, 36은 한국계통과 동일한 것으로 판명되었으나, 2016-10과 47은 한국계통도 중국계통 1 중 어느 계통에도 속하지 않는 새로운 계통인 것으로 판명되었다(도 3 참조).

즉 단일염기다형성을 염기서열번호에 따라 정리하여 본 결과 표 4에 요약한 바와 같이 총 4개의 단일염기다형성을 확인하였으며, 중국계통 1은 한국계통과 비교하여 465번 염기가 T 에서 C로 변한 단 하나의 SNP가 확인 되었으며, 877번 부근에서 12bp(ATTGACTTTTTA)가 삭제된 것으로 확인 되었다. 그러나 2016-10과 47은 465번 염기는 중국계통 1과 동일하나 247, 248, 813번 염기가 한국 또는 중국계통도 아닌 또 다른 염기를 나타내어 새로운 중국계통으로 확인 되었으며, 본 특허 출원서에서는 이들을 중국계통 2로 분류하였다. 따라서 기존에 확인된 중국계통 1을 구분하기 위한 판별마커 이외에 중국계통 1과 중국계통 2를 구분하기 위한 판별마커를 개발하고자 하였다.

표 4는 수집된 꾸지뽕 계통간 trnL - trnF 유전자 단편의 단일염기다형성 패턴을 나타낸 것이다.

또한, matK 유전자 염기서열을 비교한 결과에서도 도 4에서 나타난 바와 같이 2016-10과 47은 한국계통과 중국계통 1 중 그 어느 곳에도 속하지 않는 계통으로 판명되었다. 즉 염기서열번호별 단일염기다형성 패턴을 비교하여 보면 표 5에서 요약한 바와 같이, 새로운 중국계통 2는 총 6개의 단일염기다형성 중 3개(154, 467, 650번)는 중국계통 1, 그리고 다른 3개(204, 460, 743번)는 한국계통과 동일한 것으로 조사되었다. 2016-10과 47은 trnL - trnF 유전자의 비교분석결과와 동일하게 matK 유전자에서도 또 다른 중국계통으로 판명되어 이들을 구분하기 위한 판별 마커의 개발이 필요하게 되었다. 표 5는 수집된 꾸지뽕 계통간 matK 유전자 단편의 단일염기다형성 패턴을 나타낸 것이다. 적색으로 표시한 염기는 한국계통과 동일하며 나머지는 중국계통 1과 동일하다.

이러한 단일염기다형성 패턴의 발달된 기원에 관하여는 여러 가지 추측이 가능할 것이다. 다만 흥미로운 사실은 이들 3계통의 단일염기다형성패턴이 무작위적으로 일어난 것이 아니라 특정 위치에서 나타나는 현상으로 보아 하나의 계통에서 유전자재조합에 의하여 계통이 분지되어 나온 것으로 추정된다.

< 실시예 3> 한국 및 중국 꾸지뽕 계통들의 판별용 엽록체 유전자 단편( trnL - trnF )에 대한 ARMS-PCR 프라이머 개발

염기서열의 비교분석으로 확인한 trnL - trnF 유전자 단편의 계통 간 단일염기다형을 바탕으로 단일염기다형성을 나타내는 염기를 3′-말단에 위치하게 하고, 5′-말단 쪽으로 세 번째 염기를 인위적으로 변형시킨 프라이머를 사용하여 특이성을 향상 시킬 수 있는 ARMS-PCR기술을 도입하여 한국계통, 중국계통 1, 중국계통 2를 판별하는 연구를 수행하였다.

먼저 이들 3계통들의 염기서열을 비교분석한 결과 단일염기다형성이 많지 않고, 특히 동일한 위치에서 3계통 간에 모두 단일염기다형성을 보이는 염기가 없기 때문에 정방향 프라이머는 trnL - trnF 유전자 단편 전체를 증폭시킬 때 사용한 프라이머 즉 5´-GATATGGCGAAATCGGTAGACG- 3´서열번호 12)를 그대로 사용하였다. 그리고 중국계통 1의 판별을 위한 역방향 프라이머는 465번 위치의 단일염기다형성을 나타내는 염기(도 3 참조)를 3´말단에 위치하도록 하여 한국계통 및 중국계통 2와는 차이가 나는 중국계통 1에만 특이한 역방향 프라이머를 디자인하였으며 5´말단 쪽으로 3번째 염기를 각각 T와 G로 변경하였다(표 6 참조).

그리고 중국계통 2를 판별하기 위한 특이 프라이머는 813번의 단일염기다형성(도 3 참조)을 보이는 염기를 3′-말단에 위치하게 하여 그 자체만으로 한국계통과 중국계통 1과는 다른 역방향 프라이머를 제작하였으며(표 7 참조), 5′-말단 쪽으로 세 번째 염기를 인위적으로 변형시켜 만든 3 종류의 ARMS-PCR용 프라이머를 제작하였다(표 8 참조).

표 6은 중국계통 1과 한국계통 구지뽕의 판별을 위한 trnL - trnF 유전자 마커용 (ARMS-PCR) 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

표 7은 중국계통 2 구지뽕의 판별을 위한 trnL - trnF 유전자 마커용 SNP 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

표 8은 중국계통 2 구지뽕의 판별을 위한 trnL - trnF 유전자 마커용 ARMS-PCR 용 프라이머의 염기서열을 나타낸다.

상기한 프라이머쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과는 다음과 같다.

먼저 표 6에 나타난 바와 같이 중국계통 1을 판별하기 위한 프라이머쌍(405F와 459R; 서열번호 12 및 15, 또는 405F와 452R; 서열번호 12 및 16))를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 2016년도에 수집하여 분석한 모든 꾸지뽕 개체들은 기존에 한국종으로 확인된 계통 즉 2014-42(K)와 동일한 위치에 밴드를 나타내었다. 그러나 중국계통 1 특이 프라이머(405F와 452R; 서열번호 12 및 16)은 2014-41(C), 즉 기존에 중국계통으로 확인한 계통에서만 단일밴드를 확인하여 예상한바 대로 이 프라이머는 중국계통 1을 판별하기 위한 마커로 사용할 수 있다는 결론을 얻었다.

다음 중국계통 2를 판별하기 위한 실험으로 표 7에 나타난 단일염기다형성만 포함한 프라이머상과 표 8에 나타난 ARMS-PCR용 프라이머쌍을 사용하여 핵산증폭실험을 수행한 결과에서도 예상한 바와 같이 중국계통 2만 판별할 수 있도록 디자인한 561R(서열번호 18), 575R(서열번호 22)과 정방향 프라이머 405F(서열번호 12)를 사용한 경우에는 2016-10의 잎(10-6), 줄기(10-9), 그리고 2016-47에만 단일밴드를 나타내었으며(도 6-5, 6-6 참조), 동일위치에서 제작한 다른 프라이머 즉 562R(서열번호 17), 578R(서열번호 19), 579R(서열번호 18), 580R(서열번호 19)과 정방향 프라이머인 405F(서열번호 12)로는 기존에 중국종으로 확인된 중국계통 1(C)와 한국종으로 확인된 한국계통(K) 그리고 33, 34, 36번 시료에도 동일하게 단일밴드를 나타내었다(도 6-1, 6-2, 6-3, 6-4 참조).

하나의 단일염기다형성만을 포함하는 프라이머를 사용하여 제작한 중국계통 2의 판별용 프라이머 (561R과 405F; 서열번호 18 및 12)에 대한 핵산증폭실험결과(도 6-5)를 자세히 검토하여 보면 다른 계통에서도 희미하게 약한 밴드가 출현한 것을 확인하여 이를 보다 선명하게 차이가 나도록 하기 위하여 제작한 ARMS-PCR용 프라이머를 사용한 결과, 도 6-6에서 보는 바와 같이 세 번째 염기의 T를 A로 변경한 프라이머 즉 575R(서열번호 22)이 가장 좋은 결과를 보였으며, 나머지 즉 G 또는 C 로 변경한 경우(서열번호 23 및 24)에는 오히려 더 복잡한 결과를 얻었다(도 6-7, 6-8 참조).

반면에 동일위치에서 제작한 다른 계통 즉 한국계통 및 중국계통 1에 대한 프라이머의 경우에는 염기를 변경하지 않은 562R(서열번호 17)을 사용한 경우에는 중국계통 2에 해당하는 10-6, 10-9 및 47번 개체에도 희미하게 약한 밴드를 나타내었으나 ARMS-PCR용 프라이머 즉, 578R(서열번호 19), 579R(서열번호 20), 580R(서열번호 21)를 사용한 경우에는 이들 희미한 밴드들이 모두 사라지고 선명하게 차이를 보이는 만족할만한 결과를 얻어 이들 프라이머들은 한국계통 및 중국계통 1에 대하여 중국계통 2를 판별할 수 있는 마커로 사용할 수 있는 것으로 판명되었다.

< 실시예 6> 한국 및 중국 꾸지뽕 계통들의 판별용 엽록체 유전자 단편( matK )에 대한 ARMS- PCR 프라이머 개발

또 다른 엽록체 유전자에 해당하는 matK 유전자의 단일염기다형성을 이용한 판별용 프라이머쌍을 개발하여 trnL - trnF 유전자 마커를 이용하여 얻은 연구결과를 보다 확실하게 증명하고자 추가연구를 수행하였다. 전술한 바와 같이 matK 유전자의 염기서열을 비교한 결과에서도 2016-10과 47은 한국계통과 중국계통 1중 그 어느 곳에도 속하지 않는 계통으로 판명되었다(도 4 및 표 5 참조).

이들 단일염기다형성을 바탕으로 3계통에 대하여 먼저 중국계통 1을 판별할 수 있는 프라이머를 제작하기 위하여 460번의 단일염기다형성(도 4 및 표 5 참조)을 포함하는 위치에서 두 종류의 프라이머를 제작하여 한국계통과 중국계통 2와 비교하여 중국계통 1을 구분할 수 있는 프라이머를 제작하였으며, ARMS-PCR을 위하여 정방향 프라이머의 3′-말단에서 5′- 상류 쪽으로 3번째 염기 G를 T 또는 A로 변경하였다(표 9 참조),

표 9는 중국계통 1의 꾸지뽕의 판별을 위한 matK 유전자 마커(SNP) 및 (ARMS-PCR)용 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 적색으로 표시한 염기는 SNP, 초록색은 임의로 변경한 염기이다.

한편 중국계통 2의 경우에는 표 5에서 요약한 바와 같이 총 6개의 단일염기다형성 중 중국계통 2에만 유일하게 나타나는 단일염기다형성을 확인할 수가 없으므로, 한국계통과는 구분이 가능하나 중국계통 1과는 구분이 되지 않는 위치에서 프라이머를 제작하였다. 따라서 핵 내 유전자인 ITS 마커를 이용하여 한국계통과 중국계통을 먼저 구분한 다음 그 중 중국계통 2 판별용 마커에는 밴드가 나타나고 중국계통 1 판별용 마커로는 밴드가 나타나지 않는 것으로 구분하도록 하였다. 중국계통 2의 판별용 프라이머는 표 10에 나타난 바와 같이 정방향 및 양방향에서 각각 단일염기다형성을 보이는 염기를 3′-말단에 위치하게 하여 다른 염기를 변경 시키지 않았다. 그리고 ARMS-PCR용 프라이머는 정방향 및 역방향 프라이머의 3′-말단에서 상류쪽 세 번째 염기를 각각 다른 3종류의 염기로 변경 시켜 각 계통별로 3조합을 제작하였다(표 11).

표 10은 중국계통 2의 꾸지뽕의 판별을 위한 matK 유전자 마커(SNP)용 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 적색으로 표시한 염기는 SNP이다.

표 11은 중국계통 2의 꾸지뽕의 판별을 위한 matK 유전자 마커(ARMS-PCR)용 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 적색으로 표시한 염기는 SNP, 초록색은 임의로 변경한 염기이다.

상기한 중국계통 1에 대한 판별 마커 (표 9)을 사용하여 핵산증폭실험을 수행한 결과 도 7에 나타난 바와 같이 한국계통 판별용 프라이머(425F+408R; 서열번호 25 및 11)와 ARMS-PCR용으로 염기를 변경시킨 프라이머(497F+408R; 서열번호 27 및 11)은 ITS 마커로 한국계통으로 판명된 33, 34, 36 개체들에는 선명하게 밴드를 나타내었으나 중국계통 1번으로 판명된 2014-41(C)와 10, 47번 개체들은 밴드를 생산하지 않았다. 반면에 중국계통 1번 판별용 프라이머(426F+408R; 서열번호 26 및 11)을 사용한 경우에 중국계통 1번은 선명하고 10, 47번 개체들에도 약하지만 밴드를 생산하였으나 인접한 염기를 다른 염기로 변경시킨 ARMS-PCR용 프라이머( 499F+408R; 서열번호 28 및 11)을 사용한 경우에 10번과 47번 개체에 나타난 약한 밴드들이 사라지고 중국계통 1 개체만 선명하게 밴드를 보여 판별이 가능한 것으로 조사되었다.

다음으로 중국계통 2는 전술한 바와 같이 중국계통 1과 2에 공히 밴드를 생산하도록 제작한 판별 마커(표 10, 11 참조)들을 사용하여 핵산증폭실험을 수행한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 한국계통에 대한 판별 마커 즉 SNP(559F+560R; 서열번호 27 및 28)과 인접한 염기를 변경한 ARMS-PCR용 프라이머(569F+572R; 서열번호 33 및 36, 570F+573R; 서열번호 34 및 37, 571F+574R; 서열번호 35 및 38)들을 사용한 경우 ITS 마커로 한국계통으로 판명된 2014-42 (C)와 33, 34, 36 개체들은 밴드들을 생성하였으나, 핵내 ITS 마커로 중국계통 1로 확인된 2014-41(C)와 엽록체 유전자인 trnL - trnF 마커로 중국계통 2로 확인된 10, 47번 개체들은 밴드를 생산하지 않아 예상한 결과를 얻었다.

또한 중국계통 1과 2에 공히 밴드를 생성하도록 제작한 프라이머로 SNP(557F+558R; 서열번호 31 및 32) 그리고 ARMS-PCR용 프라이머(563F+566R; 서열번호 39 및 42, 564F+567R; 서열번호 40 및 43, 565F+568R; 서열번호 41 및 44)를 사용한 경우에도 예상한 바와 같이 2014-41(중국계통 1)과 10, 47번 개체들은 모두 밴드를 생성하였다. 그러나 SNP 그 자체만을 이용한 프라이머(표 10의 서열번호 31 및 32 참조)와 인접한 3번째 염기를 T로 변경한 프라이머(표 11의 서열번호 40 및 43 참조)를 사용한 경우에는 약하지만 한국계통에도 밴드를 생성하였다(도 8-5 및 8-7 참조).

이상의 결과를 요약하여 보면 꾸지뽕의 한국계통과 중국계통의 판별은 먼저 핵 내 유전자마커인 ITS 마커로 구분을 한 다음 중국계통으로 확인된 개체들에 대하여 엽록체 유전자 마커인 trnL - trnF 및 matK 유전자 마커를 사용하여 판별하면 현재까지 국내에서 재배되거나 시중에 건제품으로 유통되고 있는 3종의 꾸지뽕 계통을 구분할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의해 국내에서 수집하여 증식 및 보관 중에 있는 중국계통 1, 중국계통 2 또는 국내 자생종인 꾸지뽕 계통을 구분하기 위하여 엽록체에 존재하는 TrnL과 TrnF 유전자의 일부와 유전자간 DNA(intergenic DNA)를 포함하는 단편과 matK 유전자 단편을 PCR로 증폭한 후 염기서열을 분석하여 기존에 등록된 은행(GenBanK)으로부터 유전자의 염기서열을 비교하여 SNP를 보이는 부위를 포함하는 프라이머를 제작하여 각각의 기원을 조사하여 판별할 수 있는 마커를 개발하였다. 이와 함께 PCR 반응의 특이성을 증대시키기 위하여 기존의 단일염기다형성을 나타내는 염기를 3′-말단에 위치하도록 하고 그와 이웃하는 3번째의 염기를 인위적으로 변경시켜 제작한 mismatch primer 즉 ARMS-PCR용 마커를 개발하였다. 이들 마커를 이용하면 꾸지뽕의 유통과정 또는 가공과정에서 두 계통간의 혼재 여부 즉 혼ㆍ오용 문제를 해결하기 위하여 정성은 물론 혼합비율까지 측정이 가능하다.

또한 최근 중국에서 대량으로 도입되어 재배되고 있는 현실을 감안하여 이들 계통이 동일종인 한국 토종 계통과의 상호교배에 의하여 생성된 교잡종을 확인하기 위하여 이와는 별도로 핵내에 존재하는 ribosomal DNA의 전사단위체를 증폭하여 SNP를 확인한 후 ITS(internal transcribed sequence) I과 ITS Ⅱ지역에서 각각의 계통을 구분할 수 있는 판별 마커를 개발하여 이들 계통을 구분함과 동시에 전술한 엽록체 판별 마커와 조합하여 이들 계통들 사이에 일어난 교잡종의 부본 및 모본을 판별 할 수 있는 기술을 확립하였다.

<110> GYEONGNAM NATIONAL UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> SNP markers for the differentiation of Cudrania tricuspidata Bureau lines and use thereof <130> NPF30839 <160> 44 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 702 <212> DNA <213> Cudrania tricuspidata Bureau <400> 1 ccttctcntt nnggggngcc tgcggaagga tcattgtcga aagctgccca gcagaaagac 60 ccgtgaacct gttgtacctc gtgatggggt ggggggtgca gcatgcaccc ttcgctcatc 120 atgccaagtg cgtgccgctc tgtgtcacgc cctcggccct gaacgaaccc cggcgcggaa 180 agcgtcaagg aaagacaatg aaacgagggc taccaagtca ctagaattgg tgtatatctt 240 ggtggtcgca tcgtggttgg ttgaagtcta taacgactct cggcaacgga tatctcggct 300 ctcgcatcga tgaagaacgt agcgaaatgc gatacttggt gtgaattgca gaatcccgtg 360 aaccatcgag tctttgaacg caagttgcgc ccgaagccat ccggtcgagg gcacgtctgc 420 ctgggcgtca cacactgttg cccccctaat cccttgtcac tcgttctgta gtgcatgtgg 480 agtaaaaagg gcgtatattg gcctcccgtg cgatatggac ttcatggttg gcccaaactc 540 aagtcccttg tcacgtgcat cgtgacaaaa ggtggttgtc gatcagtcgg tgccccgtca 600 cttgatgccg gacacgtaaa gggactccca gcgaccccaa tgcatcgata gtgtaggtgc 660 tttgaaagcg accccaggtc aggcggggct acccgctgag tt 702 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gccgttacta ggggaatcct tg 22 <210> 4 <211> 953 <212> DNA <213> Cudrania tricuspidata Bureau <400> 4 tgagccttgg tatggaacct accaagtgac aactttcaaa ttcagagaaa ccctggaatt 60 aaaaatgggc aatcctgagc caaatccggt tttctgaaaa caaacaaggg ttcagaaggc 120 aataataaaa aaggataggt gcagagactc aatggaagct gttctaacaa atggagttgg 180 ctgcggtgcg ttagtaaagg aatcactcca gaaagaatga agaataaacg tatatatgta 240 tacgtactga aatactatct tcaaatgatt aatgacaacc caaatccgta tttcttttca 300 ttttcatgaa aaatgaaaga attgttgtga atcaattata aggtgaaaaa agaatcaaat 360 atttattgat caaatcattt actccatcaa aatctgatag atcttttgaa gaattgatta 420 atcggacgag aataaagata gagtcctatt ctacatgtca atattggcaa caatgaaatt 480 tatagtaaga ggaaaatccg tcgactttaa aaatcgtgag ggttcaagtc 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gtggtctcaa ccaggaagga tgtatataaa ccaattatgc aaacattccc 420 tcagcttttt gggttatctt tcaagtatgc aaataaatcg ttcagtggta cggagtcaaa 480 tgctagaaaa ttcatttcta atggataatg ctatgaagaa gattgataca ttagttccaa 540 ttagtcctct gattggatcg ttggctaaaa tgagattttg taacgtatta gggcatccca 600 ttagtaagtc gacctgggcc gattcatcag attttgatat tatcgaccga tttgcgtgta 660 tatgcagaaa tctttttcat tattacagtg gatcctcaaa aaaaaagagt ttgtatcgag 720 taaaatatat acttcgactt tcttgtgtta aaactttagc tcgtaaacac aaaagtactg 780 tacgcgcttt tttgaaaaga ttaggttcta aattattgga agatttcttt acggaggaag 840 aagaggttct ttctttgatt tttccaagaa cttattccgc ttttcgaagt tcatataagg 900 tgcgaatttg gtctttggat 920 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gccaagtgcg tgccgctcat c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgacaaccac cttttgcctc a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccaagtgcg tgccgctctg t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgacaaccac cttttgtcac g 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 attgcggttt tttcttcacg act 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atgattgacc agatcgttga tgc 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gatatggcga aatcggtaga cg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgccaggaac cagatttgaa ct 22 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNPmarker <400> 14 attgactttt ta 12 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cctcttacta taaatttcat tgttgtcg 28 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cttactataa atttcattgt tggca 25 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggccttggtg aaatttcttg g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggccttggtg aaatttcttg a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ggccttggtg aaatttctag g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ggccttggtg aaatttctgg g 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggccttggtg aaatttctcg g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggccttggtg aaatttctag a 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggccttggtg aaatttctgg a 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ggccttggtg aaatttctcg a 21 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 caagtatgca aataaatctt tcagtt 26 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 caagtatgca aataaatcgt tcagtg 26 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 caagtatgca aataaatctt tcattt 26 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 caagtatgca aataaatcgt tcaatg 26 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 acgattaaca tcttctgggg a 21 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gatttctgca tatacacgca aag 23 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 acgattaaca tcttctgggg g 21 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gatttctgca tatacacgca aat 23 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 acgattaaca tcttctggag a 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 acgattaaca tcttctggtg a 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 acgattaaca tcttctggcg a 21 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gatttctgca tatacacgca gag 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gatttctgca tatacacgca tag 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gatttctgca tatacacgca cag 23 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 acgattaaca tcttctggag g 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 acgattaaca tcttctggtg g 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 acgattaaca tcttctggcg g 21 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gatttctgca tatacacgca gat 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gatttctgca tatacacgca tat 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gatttctgca tatacacgca cat 23

Claims

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서열번호 5로 표시되는 염기서열의 154번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 154번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 467번째 염기는 T 또는 G이고, 상기 467번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 650번째 염기는 C 또는 A이고, 상기 650번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;를 검출할 수 있는 제제를 포함하여, 한국산 및 중국산 계통을 판별할 수 있는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 Mat K 유전자에서 유래된, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제3항에 있어서,
폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제는
서열번호 25 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 26 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 27 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및
서열번호 28 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제3항에 있어서,
폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제는
서열번호 29 및 30의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 31 및 32의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 33 및 36의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 34 및 37의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 35 및 38의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 39 및 42의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 40 및 43의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및
서열번호 41 및 44의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제3항에 있어서,
폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제는 서열번호 12 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍을 더 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제3항에 있어서,
폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제는
서열번호 12 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
서열번호 12 및 22의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및
서열번호 12 및 24의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 더 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별용 키트.
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꾸지뽕 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머쌍 및 서열번호 10 및 11의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 포함하고,
상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계에서
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 141번째 염기가 A인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 143번째 염기가 C인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 270번째 염기는 G인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 466번째 염기는 G인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 482번째 염기는 C인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 488번째 염기는 G인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 561번째 염기는 T인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 565번째 염기는 G인 경우;
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 154번째 염기가 A인 경우;
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 467번째 염기는 T인 경우; 및
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 650번째 염기는 C인 경우;
한국산 꾸지뽕 계통으로 판별하는 단계를 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별 방법.
꾸지뽕 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머쌍 및 서열번호 10 및 11의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 포함하고,
상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계에서
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 141번째 염기가 T인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 143번째 염기가 T인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 270번째 염기는 A인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 466번째 염기는 C인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 482번째 염기는 G인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 488번째 염기는 A인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 561번째 염기는 C인 경우;
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 565번째 염기는 A인 경우;
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 154번째 염기가 G인 경우;
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 467번째 염기는 G인 경우; 및
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 650번째 염기는 A인 경우
중국산 꾸지뽕 계통으로 판별하는 단계를 포함하는, 꾸지뽕 계통 판별 방법.
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