KR101864856B1 - 엉겅퀴 계통 판별용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 5.8s의 유전자 염기서열의 1837번째 염기는 A 또는 G인 염기, 1948번째 염기는 T인 염기, 및 1999번째 염기는 A 또는 T인 염기 중 1 중 이상을 포함하고, 5 내지 200염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 5.8s의 유전자 염기서열의 2248번째 염기는 T인 염기, 2253번째 염기는 T인 염기 및 2289번째 염기는 T인 염기 중 1 중 이상을 포함하고, 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로, 본 발명은 ARMS-PCR 기술을 이용하여, 엉겅퀴 종을 판별하여, 한약재 유통시장 등에서 수집되는 수많은 종류의 시료들에 대하여 편리하고 신속 정확하게 종의 계통을 판별할 수 있는 엉겅퀴의 계통 판별용 조성물에 관한 것이다.

Description

엉겅퀴 계통 판별용 조성물 및 이의 용도{Composition for the differentiation of Thistle and use thereof}

본 발명은 엉겅퀴 계통 판별용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System-PCR) 기술을 이용하여, 국내 자생 엉겅퀴와 국외에서 수입되어 유통되어 한약재 유통시장 등에서 수집되는 수많은 종류의 시료들에 대하여 편리하고 정확하고 신속하게 종의 계통을 판별할 수 있는 엉겅퀴 계통 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.

엉겅퀴는 영어로 “thistle”이라고 하며, 이는 국화과(Asteraseae 또는 Compositae) 식물들 중 날카로운 가시를 가진 식물들을 일반적으로 지칭하는 것이다. 좁게는 카두스(Carduus), 시르지움(Cirsium) 및 오노포듐(Onopordum)속의 식물들만을 지칭하지만, 넓게는 국화과에 속하는 아크티늄(Arctium ), 카를리나(Carlina), 센토레아(Centaurea), 체르비타(Cicerbita), 크니커스(Cnicus), 시나라(Cynara), 에키놉스(Echinops), 노타베시스(Notobasis), 스콜리무스(Scolymus ), 실리범(Silybum), 손커스(Sonchus) 속의 식물들을 함께 지칭하기도 한다(Haffner, E. and Hellwig, F. H. (1999) Phylogeny of the tribe Cardueae (Compositae) with emphasis on the subtribe Carduinae: an analysis based on ITS sequence data. Willdenowia. 29:27-39; Yoo SK and Bae YM (2012) Phylogenetic and chemical analyses of Cirsium pendulum and Cirsium setidens inhabiting Korea. J. Life Science 22(8):1120~1125).

우리나라에서는 일반적으로 엉겅퀴 아족에 속하는 식물들을 모두 엉겅퀴라고 부르기도 하지만, 구체적인 종(species)을 지칭할 때에는 Cirsium japonicum종에 속하는 식물을 엉겅퀴라고 하고 나머지 종들을 다른 이름으로 부르기도 한다(Yoo SK and Bae YM (2012) Phylogenetic and chemical analyses of Cirsium pendulum and Cirsium setidens inhabiting Korea. J. Life Science 22(8):1120~1125).

우리나라에 자생하는 다른 엉겅퀴종들은 Cirsium 속에 속하는 것들로는 엉겅퀴(Cirsium japonicum)을 비롯하여 큰엉겅퀴(C. pendulum), 고려엉겅퀴(C. setidens), 바늘엉겅퀴(C. rhinoceros), 도깨비엉겅퀴(C. schantarense), 버들잎엉겅퀴(C. lineare), 흰잎엉겅퀴(C. vlassovianum), 물엉겅퀴(C. nipponicum)등 8종이 보고되었다(Song, MJ and Kim, H. 2007. Taxonomic study on Cirsium Miller (Asteraceae) in Korea based on external morphology. Korean J. Pl. Taxon. 37, 17-40; Yoo SK and Bae YM (2012) Phylogenetic and chemical analyses of Cirsium pendulum and Cirsium setidens inhabiting Korea. J. Life Science 22(8):1120~1125).

이중 엉겅퀴(Cirsium japonicum)를 말린 것은 대계라고 명명하기도 하고, 고려 엉겅퀴는 강원도의 “곤드레”라는 귀한 나물로 알려진 것이며, 물엉겅퀴는 섬엉겅퀴로도 불리우고 있는 등 국내에서도 지역마다 이름이 서로 다르고, 국가마다 그 종의 기원이 서로 달라 혼·오용이 심각하다고 할 수 있다. 본 발명에서는 엉겅퀴(Cirsium japonicum)은 엉겅퀴로 C. nipponicum는 섬엉겅퀴로 명명하여 혼동을 피하고자 하였다.

유럽에서는 “thistle”로 호칭되는 엉겅퀴로 국내의 자생 엉겅퀴와는 속이 다른 Silybum marianum이 있으며 이 식물이 생산하는 실리마린(sylimarin)이라는 물질은 간질환치료에 효과가 있다고 하여 약재로 시판되고 있다(Thao NTP et al, 2011, Simultaneous determination of bioactive flavonoids in some selected Korean thistles by high-performance liquid chromatography. Arch. Pharm. Res. 2011 ; 34(3) : 455-61).

또한, 최근에는 국내자생 엉겅퀴(C. japonicum)의 종자껍질 추출물을 투여한 결과 관절염의 염증을 가라앉히고 통증유발물인 프로스타글란딘 E2의 형성을 억제하여 통증을 덜어준다는 결과를 얻었고, 이는 아마도 종자껍질에 가장 많이 함유하고 있는 항염증물질인 “아피게닌”의 역할인 것으로 추정하고 특허로 출원된 바 있다.

그러나 수많은 종류의 종 및 속을 달리하는 “thistle”은 각각 그 약효성분이 다르기 때문에 혼·오용에 더욱더 주의가 필요하다.

국내에서 자생하는 시르지움(Cirsium) 속에 속하는 식물들만 보아도 8종 이상으로 추정하고 있으며, 전 세계적으로는 약 200-300 여종에 달한다고 알려져 있어 이들 식물들을 건강 기능식품 또는 한약재로 사용하는 중국과 우리나라 등에서의 혼오용을 방지할 수 있도록 각각의 종의 기원을 판별 할 수 있는 과학적인 기술의 개발이 시급하다(Haffner, E. and Hellwig, F. H. (1999) Phylogeny of the tribe Cardueae (Compositae) with emphasis on the subtribe Carduinae: an analysis based on ITS sequence data. Willdenowia. 29:27-39; Yoo SK and Bae YM (2012) Phylogenetic and chemical analyses of Cirsium pendulum and Cirsium setidens inhabiting Korea. J. Life Science 22(8):1120~1125).

그러나 이들은 매우 유사한 종으로 서로 간의 종간 교잡종도 상당할 것이라고 추측하고 있어 이들을 형태학적 또는 생화학적 지표성분 등으로 분류하기는 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

따라서 최근에는 분자생물학적기술을 도입하여 이들의 상호 유전적 근연성(phylogenic analyses)을 분석하거나 종의 기원을 조사하는 연구결과가 일부 보고 되고 있다. 예를 들면 국내에 자생하는 것으로 알려진 8종 중 엉겅퀴(C. japonicum), 물엉겅퀴 (C. nipponicum), 큰엉겅퀴(C. pendulum), 고려엉겅퀴(C. setidens), 도깨비엉겅퀴(C. schantarense) 등 5종에 대하여 ITS 영역의 염기서열을 분석하여 유전적 연관성을 조사하였으며(Bae YM (2010) Identification of a Carduus spp. showing anti-mycobacterial activity by DNA. J. Life Science 20(4):578~583; Sequence analysis of its ITS1, 5.8S rRNA and ITS2), 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴의 유전적 연관성을 분석하여 보고된 바 있다(Yoo SK and Bae YM (2012) Phylogenetic and chemical analyses of Cirsium pendulum and Cirsium setidens inhabiting Korea. J. Life Science 22(8):1120~1125). 또한 Bae(2015)는 정영엉겅퀴(C. chanroenicum)를 대상으로 큰엉겅퀴와 도깨비엉겅퀴와의 유전적 연관성을 분석하여 보고한 바 있다(Bae YM (2015) Genetic relationship of some Cirsium Plants of Korea. J. Life Science 25(2):243~248). 그리고 문 등(2013)은 조뱅이(Cirsium segetum Bunge), 큰조뱅이 (Cirsium setosum (Wild.) M.Bieb.), 엉겅퀴(Cirsium japonicum), 고려엉겅퀴(C. setidens), 정영엉겅퀴(C. chanroenicum) 및 지느러미엉겅퀴(C. crispus) 6종을 대상으로 rDNA -ITS, matK, rbcL 유전자 염기서열을 DNA 바코드 종류별로 비교분석하여 한약재인 소계와 대계의 기원정립을 위한 연구결과를 보고한 바 있다(Moon et al, 2013, DNA 바코드 분석을 통한 소계 및 대계 기원식물 감별과 종간 유연관계분석. Kor J Herbology 28(3):75-84).

북미의 경우에도 지역별로 수집한 Cirsium속에 속하는 캐나다 thistle (C. arvense (L.) Scop.)을 대상으로 micrsattelite를 이용한 유연관계를 분석하거나(Slotta et al, 2010, Assessing genetic diversity of Canada Thistle (Cirsium arvense) in North America with microsatellites. Weed Science 58:387394), ITS 유전자단편의 염기서열을 이용한 유연관계를 분석하였다고 하였다(Slotta et al, 2006, Genetic diversity of Canada thistle (Cirsium arvense) in North Dakota. Weed Science, 54:10801085; Slotta et al. 2012, Phylogeny of Cirsium spp. in North America: host specificity does not follow phylogeny. Plants 2012, 1:61-73).

최근 NGS (Next generation sequencing) 기술 등의 발달로 특정 생물종이 갖는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)의 차이에 근거한 특정 종을 판별하는 소위 바코딩(barcoding) 기술 등이 눈부시게 발전 되고 있다. 그러나 아직까지도 비용과 노력면에서 실용화하기가 어려운 실정이며, 현장에서 채취한 수많은 시료를 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 기술의 개발이 시급한 실정이다. 특히 국내의 한약재 시장에서 일부 가공 처리한 상태인 건 뿌리 절편 또는 분말상태로 유통되는 제품들에 대한 정확한 약재의 종의 기원 판별은 육안으로는 거의 불가능하기 때문에 바코딩(barcoding) 등의 분자생물학기술을 적용하고자 하나, 수많은 시료들을 개별적으로 염기서열을 비교분석하여야 하는 등의 복잡성을 아직 해결하지 못하기 때문에 실용화의 걸림돌이 되고 있다.

본 발명의 배경기술로는 대한민국 공개특허 제10-2012-0059208호에 ‘아피제닌'을 유효성분으로 하는 불면증 개선 및 치료용 약학 조성물이 기재되어 있다.

본 발명자들은 국내외에서 수집하여 증식 및 보관 중에 있는 엉겅퀴 종에 대한 기원의 구분과 관련하여, 종래의 문제점인 제한된 단일염기다형성의 존재로 종 특이 프라이머의 제작이 어렵고 일부 제작된 종 특이 프라이머들도 판별능력이 떨어져 실용화가 어려운 문제를 해결하기 위해 ARMS-PCR 기술을 적용하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 본 발명에 의한 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 엉겅퀴 계통 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 단일염기 다형성(SNP) 마커를 포함하는 엉겅퀴 계통 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 의한 엉겅퀴 계통 판별용 조성물을 포함하는 엉겅퀴 계통 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 의한 프라이머 세트를 이용한 엉겅퀴 계통의 혼합비율 판별이 가능한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신속하고 정확하게 엉겅퀴 계통을 판별할 수 있는 엉겅퀴 계통 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신속하고 정확하게 엉겅퀴 교잡종을 판별할 수 있는 엉겅퀴 교잡종 판별이 가능한 엉겅퀴 계통 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1903번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 1903번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 2272번째 염기는 T 또는 A이고, 상기 2272번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 캐나다엉겅퀴 계통 여부를 판별할 수 있는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1948번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 1948번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 섬엉겅퀴 계통 여부를 판별할 수 있는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1999번째 염기는 A, T 또는 G이고, 상기 1999번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 대계 계통 여부를 판별할 수 있는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 ITS(intergenic transcribed spacer) 유전자에서 유래된 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는, 엉겅퀴 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 10 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 국산 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 21 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 섬엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 26 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 29 및 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 30 및 서열번호 33의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 중 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함하는, 캐나다 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 유럽산 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 엉겅퀴 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 상기 기재된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및 전기영동의 결과를 분석하여 국내자생 엉겅퀴 및 국외산 엉겅퀴를 판별하는 단계를 포함하는, 엉겅퀴 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR은 ARMS-PCR이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 종래의 단일염기다형성을 대상으로 제작한 프라이머들의 낮은 판별력으로 인한 실용화가 어려운 단점을 보완하기 위해 ARMS-PCR 기술을 이용하여, 우수한 판별력을 가진 계통 판별 프라이머 세트를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 향후 엉겅퀴의 수요도가 증가할 것으로 예상되는 국내 자생 엉겅퀴와, 국외의 유럽과 캐나다산 엉겅퀴들이 판별 가능한 프라이머 세트를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 프라이머 세트를 활용하여, 유통시장 등의 수많은 시료들에 대하여, 국내 자생 엉겅퀴와 국외산 엉겅퀴를 정확하고 신속하게 판별할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 바코딩 기술을 현장에서 실용화할 수 있다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 혼·오용 판별 및 이들의 혼합비율까지도 측정 가능한 계통 판별용 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 국내 자생하는 엉겅퀴(C. japonicum), 큰엉겅퀴(C. pendulum), 고려엉겅퀴(C. setidens), 섬엉겅퀴(C. nipponicum), 유럽엉겅퀴(Silybum marianum) 및 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 핵 내 ITS 영역의 염기서열 비교분석 결과를 나타낸 도면이다. 도면 내에는 본 발명의 일 실시예에 따른 판별용 프라이머를 각각 표시하였으며, ITS I, 5.8S RNA, ITS II 영역을 각각 다른 색으로 표시하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 국내 자생하는 엉겅퀴(C. japponicum)의 SNP 또는 ARMS-PCR용 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 나타낸 도면이다. 상기 도면 내의 1, 2 및 3은 국산엉겅퀴(C. japonicum)로 수집지역 및 시기가 다른 시료이고, 4는 섬엉겅퀴(C. nipponicum), 5 및 6은 유럽엉겅퀴(Silybum marianum), 7 및 8은 캐나다에서 수집된 엉겅퀴(Cirsium arvense)를 나타낸다. 또한, SNP는 3′-말단에 인접한 염기를 변경하지 않은 내재하는 염기 그 자체만으로 제작한 프라이머 세트를, A, T, G 및 C는 각각의 염기로 변경하여 제작한 ARMS-PCR용 프라이머 세트를 이용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 국내 자생하는 섬엉겅퀴(C. nipponicum)의 SNP 또는 ARMS-PCR용 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 나타낸 도면이다. 상기 도면 내의 1, 2 및 3은 국산엉겅퀴(C. japonicum)로 수집지역 및 시기가 다른 시료이고, 4는 섬엉겅퀴(C. nipponicum), 5 및 6은 유럽엉겅퀴(Silybum marianum), 7 및 8은 캐나다에서 수집된 엉겅퀴(Cirsium arvense)를 나타낸다. 또한, SNP는 3′-말단에 인접한 염기를 변경하지 않은 내재하는 염기 그 자체만으로 제작한 프라이머 세트를, A, T, G 및 C는 각각의 염기로 변경하여 제작한 ARMS-PCR용 프라이머 세트를 이용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 캐나다 엉겅퀴(C. arvense )의 SNP 또는 ARMS-PCR용 프라이머 세트(표 4 참조)를 이용한 PCR 결과를 나타내는 도면이다. 상기 도면 내의 SNP는 캐나다엉겅퀴에 내재하는 단일염기다형성을 각각 정방향과 역방향의 3′-말단에 위치하도록 하여 제작한 프라이머이고, (A), (T), (G), (C)는 3′-말단에 인접한 세 번째 염기서열을 각각 해당하는 염기로 변경하여 만든 ARMS-PCR용 프라이머 세트를 이용한 결과를 나타낸 것이다. 1, 2 및 5는 국산엉겅퀴(C. japonicum)로 수집지역 및 시기가 다른 시료이고, 3 및 4는 각각 캐나다에서 수집한 엉겅퀴이며, 6은 섬엉겅퀴(C. nipponicum), 7 및 8은 유럽엉겅퀴(Silybum marianum)를 나타낸다. 또한, SNP는 3′-말단에 인접한 염기를 변경하지 않은 내재하는 염기 그 자체만으로 제작한 프라이머 세트를, A, T, G 및 C는 각각의 염기로 변경하여 제작한 ARMS-PCR용 프라이머 세트를 이용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유럽엉겅퀴(Silybum marianum)의 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 나타낸 도면이다. 염기서열분석 결과 유럽엉겅퀴에만 유일하게 보이는 단일염기다형성을 각각 정방향과 역방향의 3′-말단에 위치하도록 하여 제작한 프라이머 세트를 이용하였다. 상기 도면 내의 1, 2 및 3은 국산엉겅퀴(C. japonicum)로 수집지역 및 시기가 다른 시료이고, 4는 섬엉겅퀴(C. nipponicum), 5 및 6은 유럽엉겅퀴(Silybum marianum), 7 및 8은 캐나다에서 수집된 엉겅퀴(Cirsium arvense)를 나타낸다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명은 보다 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1903번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 1903번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 2272번째 염기는 T 또는 A이고, 상기 2272번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 캐나다엉겅퀴 계통 여부를 판별할 수 있는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1948번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 1948번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 섬엉겅퀴 계통 여부를 판별할 수 있는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1999번째 염기는 A, T 또는 G이고, 상기 1999번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 대계 계통 여부를 판별할 수 있는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 폴리뉴클레오티드는 ITS(intergenic transcribed spacer) 유전자에서 유래될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 기재의 조성물을 포함하는, 엉겅퀴 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명에 있어 상기 키트는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 엉겅퀴 계통 판별용 마이크로어레이 키트일 수 있다.

상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 10 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 국산 엉겅퀴 계통 판별용 조성물 국산 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

상기 프라이머는 이에 한정하는 것은 아니나, ARMS-PCR 증폭용 프라이머일 수 있다.

본 발명은 국내에 자생하는 것으로 알려진 엉겅퀴종과 유럽 및 캐나다에서 확보된 엉겅퀴종을 대상으로 기존에 이미 알려진 핵 내 rDNA (ribosomal DNA) 전사단위체내에 존재하는 ITS (internal transcribed spacer)의 염기서열을 상호 비교하여 단일염기다형성을 확인하였다. 또한 이를 근거로 하여 종 특이 프라이머를 제작한 후 PCR 반응으로 판별이 가능한지 여부를 조사하고자 하였다. 그러나 하나 또는 두 개의 제한된 단일염기다형성을 근거로 제작한 판별용 프라이머가 핵산중합반응과정에서 해당하는 대립유전자(allele) 이 외에 다른 종의 대립유전자도 증폭이 되는 경우가 많으므로 ARMS (Amplification Refractory Mutation System) 기술을 적용하고자 하였다.

본 발명에서는 5′-말단 쪽으로 세 번째 염기를 다른 3종류의 변경시켜 만든 프라이머를 사용하여 PCR반응에서 종 특이 판별력이 가장 우수한 프라이머 세트를 확보하도록 하였다. 이들 프라이머 세트를 이용하면 한약재 시장에 유통되는 대량의 엉겅퀴 시료들을 먼저 PCR기술로 신속하게 판별할 수 있기 때문에 모든 시료에 대한 염기서열분석을 위한 복잡한 과정을 수행할 필요가 없고, 이로 인해 노동력과 비용을 절약할 수 있는 장점이 있다.

ARMS(Amplification-refractory mutation system) 기술은 단 하나의 단일염기다형성만으로 종 특이 대립유전자만을 정확하게 증폭시킬 수 있도록 고안된 기술로서 단일염기다형성을 프라이머의 3′-말단에 위치시킨 다음 이웃하고 있는 두 번째, 세 번째 또는 4번째의 염기를 다른 염기로 변경시켜 임의로 mismatch염기를 도입하여 목표로 하는 대립유전자(allele)의 연장반응 특이성을 증대시킨 기술이다. 즉 3′-말단에 존재하는 단 하나의 단일염기다형성을 보이는 미스매치(mismatch)염기로는 완전히 PCR 반응의 초기단계인 연장반응을 억제하지 못하므로 또 다른 하나의 미스매치(mismatch)염기를 인위적으로 도입하여 연장반응을 100% 억제시키고자 고안된 기술이다. 따라서, 본 발명은 3’말단에 SNP를 포함한 염기서열에 ARMS 기술을 이용하여 우수한 판별력을 가진 엉겅퀴 계통 판별용 조성물을 제공하였다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 21 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 섬엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 26 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 29 및 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 30 및 서열번호 33의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 중 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함하는, 캐나다 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 유럽산 엉겅퀴 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 엉겅퀴 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 상기 기재된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및 전기영동의 결과를 분석하여 국내자생 엉겅퀴 및 국외산 엉겅퀴를 판별하는 단계를 포함하는, 엉겅퀴 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명에 있어서, 상기 대상 시료로부터 핵산을 분리하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다. 대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 판별하는 단계는 특정서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelsteinet al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립유전자-특이적 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR은 ARMS-PCR일 수 있다.

출원인은 PCR반응의 종 특이 연장반응의 특이성을 증대시키기 위하여 기존의 단일염기다형성을 나타내는 염기를 3′-말단에 위치하도록 하고 그와 이웃하는 3번째의 염기를 인위적으로 다른 3가지의 염기로 변경시켜 다양한 종류의 정방향 및 역방향의 ARMS-PCR용 프라이머를 제작하여 PCR 실험을 통하여 판별능력이 가장 우수한 조합의 판별 마커를 개발하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 판별하는 단계는 혼용 판별 또는 오용의 판별 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 판별하는 단계는 혼합 비율 측정 단계를 더 포함할 수 있다.

< 실시예 >

시료

하기 실험에서 사용한 엉겅퀴 계통들은 표 1에서 요약하였다. 국내에 자생하는 것으로 알려진 엉겅퀴Cirsium japonicum 는 3점, 섬엉겅퀴(Cirdium nipponicum)는 1점 등을 국내의 재배단지 또는 유통시장에서 직접 구입하였다. 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)는 온타리오주의 도로변에서 채취한 2점의 시료들로부터 분리한 DNA를 사용하였으며, 유럽엉겅퀴(Silybum marianum)는 국내 수입업체로부터 시기를 달리하여 2점을 수집한 것을 사용하였다(표1 참조). 표 1은 수집 및 보관중인 엉겅퀴 계통 현황을 나타낸 것이다.

계통별 게놈 DNA 분리

수집된 계통별로 일정량의 뿌리 또는 잎을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 곱게 갈아서 분말로 만든 다음 GeneAll사의 Exgene^TM Plant SV 키트를 이용하여 제조사에서 제공한 실험방법에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 정제된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DNA의 분리과정에서의 분해정도를 확인한 후 Micro-spectrometer (BioPrince, SD-2000, Gangwon, South Korea)를 이용하여 234nm, 260nm, 280nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A₂₆₀/A₂₈₀ 값이 1.8-2.2 범위 그리고 A₂₃₄/A₂₆₀ 값이 0.5-0.8 범위 내 포함 여부를 조사하여 RNA 및 단백질 등의 오염정도를 확인하여 순수한 DNA를 확인하였다.

실시예 1. 다양한 엉겅퀴 수집종의 핵 내 ribosomal DNA ( rDNA ) 유전자 단편의 염기서열 분석 비교

표 1에서 공시한 엉겅퀴 계통들로부터 분리한 게놈 DNA를 대상으로 핵 내에 존재하는 ribosomal DNA의 ITS (internal transcribed spacer)의 염기서열을 비교분석 하기 위하여 기존에 알려진 primer 세트(Forward, 5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′(서열번호 8); Reverse,5′- GCCGTTACTAGGGGAATCCTTG-3′(서열번호 9))를 이용하여 rDNA 단편을 증폭한 후 Solgent 회사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열분석을 하였으며, 이들을 상호 비교분석한 결과를 도 1에 제시하였다. 또한 국내에서 서식하고 있는 것으로 알려진 큰엉겅퀴(Cirsium pendulum)와 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)는 시료의 확보가 어려워 본 발명에서는 판별마커 개발을 시도하지 않았으나 향후의 연구를 대비하여 이들 두 종의 염기서열은 기존에 Genbank에 등록된 정보를 이용하여 비교분석하였다. 즉 도 1에 제시한 염기서열 정보 중 큰엉겅퀴는 AB035977과 AB035998, 그리고 고려엉겅퀴는 JX274255, JX274256, JX274257, JX274258 등의 정보를 이용하여 비교분석하였다.

따라서 국내에서 자생하는 것으로 알려진 4종의 엉겅퀴 즉 대계, 큰엉겅퀴, 고려엉겅퀴, 섬엉겅퀴와 유럽엉겅퀴 그리고 캐나다엉겅퀴 등 총 6종의 핵 내 DNA인 rDNA 유전자 단편의 염기서열을 비교 분석 한 결과 ITSI영역의 일부, 5.8S, ITSII영역의 일부를 포함하는 640 bp의 염기서열 중 31개의 단일염기다형성을 보여 상호간에 높은 상동성을 나타내었다. 특히 5.8S rRNA를 암호 하는 영역의 염기서열은 100% 일치하였으며, ITS 영역에서만 단일염기다형성을 보였으며 6종의 엉겅퀴 종 사이에 거의 동일한 위치에서 염기 치환이 일어난 것으로 조사되었다(도 1 참조).

실시예 2. 국내 자생하는 엉겅퀴(대계)( C. japonicum ) 판별용 프라이머 세트 개발

국내에서 자생하는 엉겅퀴 중 대표적인 것으로 알려진 대계(C. japonicum)를 판별하기 위한 프라이머를 제작하기 위하여 도 1의 염기서열 비교분석 결과에서 확인된 단일염기다형성 중 정방향은 1999번째, 역방향은 2248번째 염기를 3′-말단에 위치하도록 각각 디자인하였다. 따라서 대계엉겅퀴 판별용 정방향 프라이머는 본 연구에서 확인된 다른 5종의 엉겅퀴종과 차이가 나는 염기 “T”가 3′-말단에 위치하도록 하였으나, 역방향 프라이머는 고려엉겅퀴(C. setidens), 유럽(Silybum marianum), 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)와는 차이를 보이나 큰 엉겅퀴(C. pendulum)와는 동일한 “T”염기가 3′-말단에 위치하도록 하였다(표 2 참조).

상기한 프라이머(615번과 616번)를 사용하여 표 1에서 공시한 수집된 엉겅퀴종으로부터 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 표 2에서 기술한 프라이머 조합을 사용하여 PCR 실험을 수행하였다. PCR 반응은 iNtRON사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하였으며, 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 순수 분리한 DNA 50 ng과 프라이머를 각각 10 pmole을 혼합한 후 94℃에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 94℃에서 30초, 그리고 각 프라이머 셋트별로 주어진 Tm값 온도에서 10초, 72℃에서 30초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 72℃에서 5분간 연장반응을 시킨 후 4℃에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA밴드는 2.0% agarose gel을 이용하여 전기 영동하여 그 결과를 확인하였다.

3′-말단에 각각 단일염기다형성을 포함하는 SNP 프라이머 (표 2의 615와 616번)를 사용하여 PCR을 수행한 결과 유럽산 엉겅퀴를 제외한 다른 3종 즉 대계, 섬(물)엉겅퀴 그리고 캐나다산엉겅퀴에서 모두 동일한 크기의 DNA 밴드를 생산한 것으로 조사되어 대계엉겅퀴에 내재하는 단일염기다형성만으로 만든 SNP 프라이머는 다른 엉겅퀴종으로부터 구분할 수 있는 판별마커로 사용하기에 부적합한 것으로 조사되어 ARMS-PCR 기술의 도입이 필요하였다(도 2).

따라서 SNP 프라이머의 3′-말단에서 5′-말단 쪽으로 세 번째 염기를 각각 다른 3종류의 염기로 변경한 프라이머를 제작하여 정방향 및 역방향프라이머 모두 동일한 염기로 치환된 프라이머 조합을 사용하여 PCR반응을 수행하여 본 결과 3′-말단과 인접한 세 번째 염기를 각각 “T”로 변경시킨 615번과 621번 프라이머 조합에서 가장 선명한 밴드를 생산하여 ARMS기술의 도입으로 판별효과를 높일 수 있는 것으로 조사되었다. 그러나 “G”로 치환한 경우(617 + 616 조합)에는 섬엉겅퀴에도 약한 밴드를 생산하였으며 “A”+ (618+620조합) 또는 “C”+ (619+622조합)로 치환한 경우에는 모든 시료에서 밴드가 사라지거나 아주 희미하게 되는 결과를 얻어 판별 마커로는 부적합한 것으로 조사되었다(도 2). 표 2는 국산엉겅퀴(C. japonicum)의 판별용 ITS 유전자 SNP 및 ARMS-프라이머의 염기서열 정보를 나타낸 것이다.

실시예 3. 섬엉겅퀴 ( C. nipponicum ) 판별용 프라이머 세트 개발

섬 또는 물엉겅퀴로 불리우는 C. nipponicum을 판별하기 위한 프라이머 역시 도 2를 참조하여 유일하게 다른 5종의 엉겅퀴와 차이가 나는 단일염기다형성을 보이는 염기를 근거로 하여 제작하도록 하였다. 즉 정방향 프라이머는 1948번 염기 그리고 역방향프라이머는 2289번째의 염기를 각각 3′-말단에 위치하도록 하여 프라이머를 제작하여 각각 nipponicum_ITS_SNP_F, nipponicum_ITS_SNP_R로 명명하였다(도 1 및 표 3 참조).

표 1에서 공시한 엉겅퀴 시료로부터 분리한 게놈 DNA와 상기한 섬 엉겅퀴 판별용 정방향과 역방향 프라이머를 이용하여 주어진 Tm값을 annealing 온도로 하고 전술한 조건으로 PCR 반응을 수행한 결과 목표로 한 섬엉겅퀴보다 유럽 또는 캐나다 엉겅퀴에서도 강한 밴드를 생산하여 역시 ARMS 기술의 도입이 필요한 것으로 조사되었다(도 3 참조).

따라서 정방향과 역방향프라이머의 3′-말단에 이웃한 세 번째 염기를 각각 다른 3가지의 염기로 변경하여 제작 한 다음(표 3참조), 같은 염기 조합의 프라이머를 사용하여 PCR실험을 수행하여 본 결과 세 번째 염기를 “T”로 변경한 정방향 및 역방향 프라이머 조합 (표 3의 592+595)에서 섬엄겅퀴에만 예상한 크기(376 bp)의 단일 밴드를 확인하여 가장 우수한 결과를 얻었으며, “A”“G”또는 “C”로 변경한 조합에서는 다른 종의 시료에도 밴드를 생성하거나, 크기가 다른 DNA 밴드가 보여 판별마커로는 부적합한 것으로 조사되었다. 따라서 국내에서 자생하는 것으로 알려진 엉겅퀴 중 본 발명에서 수집하여 확인한 대계와 섬엉겅퀴의 판별마커는 향후 실용화가 가능할 것이다. 표 3은 섬엉겅퀴(C. nipponicum)의 판별용 SNP 및 ARMS-프라이머의 염기서열 정보를 나타낸 것이다.

실시예 4. 캐나다 엉겅퀴( Cirsium arvense )의 구분을 위한 프라이머 세트 개발

캐나다의 온타리오 주 도로변에서 채취한 엉겅퀴의 핵 내 rDNA 단편의 염기서열을 분석한 결과 이는 국내에서 자생하는 엉겅퀴들과 동일한 Cirsium속에 속하는 Cirsium arvense로 확인되었으며 문헌에 의하면 이는 유럽에서 북미로 이동된 외래종으로 북미 온대지역에서 가장 심각한 잡초 중의 하나로 알려져 있다.

따라서 국내에 자생하는 엉겅퀴와 동일한 속에 속하나 종이 다른 캐나다엉겅퀴와 속이 다르나 역시 엉겅퀴(milk thistle)로 호칭되고 있는 유럽엉겅퀴(Silybum marianum)를 본 발명에 포함하여 각각의 판별 마커를 개발하기로 하였다. 먼저 캐나다엉겅퀴의 판별 마커는 도 2의 염기서열 비교분석 자료에서 캐나다엉겅퀴에만 유일하게 단일염기다형성을 보이는 염기들 즉 1903번과 2272번 염기를 3′-말단으로 하는 정방향과 역방향 프라이머를 각각 제작하여 각각 arvense_ITS_SNP_F와 arvense_ITS_SNP_R로 명명하였다(표 4 참조). 이들 프라이머를 사용하여 표 1에서 공시한 시료들로부터 분리한 게놈 DNA를 대상으로 PCR 반응을 수행한 결과, 예상한 바와 같이 캐나다엉겅퀴는 예상한 크기(545 bp)의 강한 DNA밴드를 확인하였으나 다른 엉겅퀴종 특히 유럽종에서 약한 밴드를 확인하였다(도 4 참조).

따라서 ARMS기술을 도입하여 판별효과를 보다 높일 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여 3′-말단에 인접한 세 번째 염기를 각각 다른 3가지의 염기로 변경한 프라이머를 제작하였다(표 4 참조). 이들 프라이머를 대상으로 정방향과 역방향 프라이머의 세 번째 염기를 동일한 염기 즉 “A”“T”“G”및 “C”로 조합하여 PCR을 다시 수행하여 본 결과 모든 조합에서 캐나다엉겅퀴에만 밴드를 생산하는 것을 확인하여 이들을 캐나다엉겅퀴의 판별용 프라이머로 사용할 수 있음을 확인하였다. 표 4는 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 판별용 SNP 및 ARMS-프라이머의 염기서열 정보를 나타낸 것이다.

실시예 5. 유럽엉겅퀴( Silybum marianum ) 판별용 프라이머 세트 개발

최근 국내 소비자들의 건강기능식품에 대한 선호도의 증가추세에 따라 유럽산 엉겅퀴의 수입량 또한 증대되고 있는 실정이다. 따라서 국산 엉겅퀴와의 구분 유통질서의 확립을 위한 판별마커의 개발 필요성이 시급한 실정이다. 유럽에서 수입되는 엉겅퀴는 학명이 국내의 엉겅퀴종과는 다른 Silybum marianum 으로 도 1에서 제시한 바와 같이 국내 자생하는 엉겅퀴 즉 대계(C. japonicum), 섬엉겅퀴(C. nipponicum), 또는 고려엉겅퀴(C. setidens), 큰엉겅퀴(C. pendulum), 그리고 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)와는 많은 단일염기다형성을 보였다. 그 중 유럽산엉겅퀴에만 유일하게 다른 1837번과 2253번의 단일염기다형성을 보이는 염기를 정방향 또는 역방향 프라이머의 3′-말단에 위치하도록 하여 프라이머를 제작하여 각각 marianum_ITS_SNP_F와 marianum_ITS_SNP_R로 명명하였다(표 5 참조). 이들 프라이머를 사용하여 표 1에서 공시한 4종의 엉겅퀴 시료로부터 분리한 게놈 DNA를 대상으로 PCR 실험을 수행한 결과, 유럽산 엉겅퀴 시료에서만 예상한 크기(456 bp)의 DNA 밴드를 형성하여 상기한 SNP 프라이머를 그대로 유럽엉겅퀴(S. marianum)의 판별마커로 사용하기에 적합하다는 결론을 얻었다. 표 5는 유럽산엉겅퀴(Silybum marianum)의 판별용 프라이머의 염기서열 정보를 나타낸 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> GYEONGNAM NATIONAL UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Composition for the differentiation of Thistle and use thereof <130> NPF30837 <160> 35 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 643 <212> DNA <213> Silybum marianum <400> 1 tcgaagcctg cacagcagaa cgacccgcga acacgtaatc acagccgggc gtcgaggggg 60 tcgggcgtga gcccggtgcc cgcgatgcct tgtcgacgtg tgtctgcgat gccccgtttc 120 gaggcgtcgt ggatgttgcg tcggcaccta aacaaacccc ggcacggcat gtgccaagga 180 aaacaaaaca tatgaagggt gcgtctcgtg ttgccccgtt cgcggtgcgc gcacgggccg 240 tggcctctca ataaccataa acgactctcg gcaacggata tctcggctca cgcatcgatg 300 aagaacgtag caaaatgcga tacttggtgt gaattgcaga atcccgtgaa ccatcgagtt 360 tttgaacgca agttgcgccc gaagccattc ggccgagggc acgtctgcct gggcgtcacg 420 catcgcgtcg ccccagacca cgccttccnt acggggatgc gttcgtctgg ggcggagaat 480 ggtctcccgt gccgtcggcg cggttggcct aaaaaggagt ccccttcgac ggacgcacgg 540 ctagtggtgg ttgttaaggc cttcgtatcg agccgtgtgt cgttagccgc aagggaagcg 600 ctctccaaag accccaacgc gtcgtctcgc gacgatgctt cga 643 <210> 2 <211> 781 <212> DNA <213> Cirsium japonicum <400> 2 tgtccactga accttatcat ttagaggaag gagaagtcgt aacaaggttt ccgtaggtga 60 acctgcggaa ggatcattgt cgaagcctgc acagcagaac gacccgtgga cacgtaatca 120 cagccggtgt cgagggggtc gggcgtgagc ccggtgcctg cgatgcctcg tcgacgtgcg 180 tctacgatgc cccgttttga ggcgtcgtgg atgttgcgtc ggcacctaaa caaaccccgg 240 cacggcatgt gccaaggaaa agaaaacata agaagggcgc gtctcgtgtt gccccgttcg 300 cggtgtgcgc atgggccgtg gcctctcaat aaccataaac gactctcggc aacggatatc 360 tcggctcacg catcgatgaa gaacgtagca aaatgcgata cttggtgtga attgcagaat 420 cccgtgaacc atcgagtttt tgaacgcaag ttgcgcccga agccattcgg ccgagggcac 480 gtctgcctgg gcgtcacgca tcgcgtcgcc ccagaccatg cctccccaat ggggatgcgt 540 tcgtctgggg cggagaatgg tctcccgtgt cgttggcgcg gttggcctaa aaaggagtcc 600 ccttcgacgg acgcacggct agtggtggtt gttaaggcct tcgtatcgag ccgtgcgtcg 660 ttagccgcaa gggaagcgct ctctaaagac cccaacgtgt cgtctcgtga cgacgcttcg 720 accgcgaccc caggtcaggc gggactaccc gctgagttta agcatatcaa taagcggagg 780 a 781 <210> 3 <211> 2509 <212> DNA <213> Cirsium pendulum <400> 3 ctggttgatc ctgccagtag tcatatgctt gtctcaaaga ttaagccatg catgtgtaag 60 tatgaacaaa ttcagactgt gaaactgcga atggctcatt aaatcagtta tagtttgttt 120 gatggtatct gctactcgga taaccgtagt aattctagag ctaatacgtg caacaaaccc 180 cgacttttgg aagggatgca tttattagat aaaaggtcga cgcgggctct gcccgttgct 240 gcgatgattc atgataactc gacggatcgc acggccctcg tgccggcgac gcatcattca 300 aatttctgcc ctatcaactt tcgatggtag gatagtggcc tactatggtg gtgacgggtg 360 acggagaatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg 420 aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc tgacacgggg aggtagtgac aataaataac 480 aataccgggc tcaaacgagt ctggtaattg gaatgagtac aatctaaatc ccttaacgag 540 gatccattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta 600 tatttaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttggactt tgggttgggt cggccggtcc 660 gccttcaggt gtgcaccggt ttactcgtcc cttctgtcgg cgatgcgctc ctggccttaa 720 ttggccgggt cgtgcctccg gcgctgttac tttgaagaaa ttagagtgct caaagcaagc 780 ctacgctctg tatacattag catgggataa catcatagga tttcggtcct attacgttgg 840 ccttcgggat cggagtaatg attaacaggg acagtcgggg gcattcgtat ttcatagtca 900 gaggtgaaat tcttggattt atgaaagacg aacaactgcg aaagcatttg ccaaggatgt 960 tttcattaat caagaacgaa agttgggggc tcgaagacga tcagataccg tcctagtctc 1020 aaccataaac gatgccgacc agggatcagc ggatgttgct tttaggactc cgctggcacc 1080 ttatgagaaa tcaaagtttt tgggttccgg ggggagtatg gtcgcaaggc tgaaacttaa 1140 aggaattgac ggaagggcac caccaggagt ggagcctgcg gcttaatttg actcaacacg 1200 gggaaactta ccaggtccag acatagtaag gattgacaga ctgagagctc tttcttgatt 1260 ctatgggtgg tggtgcatgg ccgttcttag ttggtggagc gatttgtctg gttaattccg 1320 ttaacgaacg agacctcagc ctgctaacta gctatgtgga ggtatccctc cacggccagc 1380 ttcttagagg gactatggcc tttcaggcca cggaagtttg aggcaataac aggtctgtga 1440 tgcccttaga tgttctgggc cgcacgcgcg ctacactgat gtattcaacg agtatatagc 1500 cttggccgac aggcccggga aatctttgaa atttcatcgt gatggggata gatcattgca 1560 attgttggtc ttaaacgagg aattcctagt aagcgcgagt catcagctcg cgttgactac 1620 gtccctgccc tttgtacaca ccgcccgtcg ctcctaccga ttgaatggtc cggtgaagtg 1680 ttaggatcgc ggcgacgtgg gcggttcgcc gccggcgacg tcgcgagaat tccactgaac 1740 cttatcattt agaggaagga gaagtcgtaa caaggtttcc gtaggtgaac ctgcggaagg 1800 atcattgtcg aagcctgcac agcagaacga cccgtggaca cgtaatcaca gccggtgtcg 1860 agggggtcgg gcgtgagccc ggtgcctgcg atgcctcgtc gacgtgtgtc tacgatgccc 1920 cgttttgagg cgtcgtggat gttgcgtcgg cacctaaaca aaccccggca cggcatgtgc 1980 caaggaaaag aaaacatagg aagggcgcgt ctcgtgttgc cccgttcgcg gtgtgcgcat 2040 gggccgtggc ctctcaataa ccataaacga ctctcggcaa cggatatctc ggctcacgca 2100 tcgatgaaga acgtagcaaa atgcgatact tggtgtgaat tgcagaatcc cgtgaaccat 2160 cgagtttttg aacgcaagtt gcgcccgaag ccattcggcc gagggcacgt ctgcctgggc 2220 gtcacgcatc gcgtcgcccc agaccatgcc tctccaatgg ggatgcgttc gtctggggcg 2280 gagaatggtc tcccgtgtcg ttggcgcggt tggcctaaaa aggagtcccc tttgacggac 2340 gcacggctag tggtggttgt taaggccttc gtatcgagcc gtgcgtcgtt agccgcaagg 2400 gaagtgctct ttaaagaccc caacgtgtcg tctcgtgacg acgcttcgac cgcgacccca 2460 ggtcaggcgg gactacccgc tgagtttaag catatcaata agcggagga 2509 <210> 4 <211> 713 <212> DNA <213> Cirsium setidens <400> 4 agaggaagga gaagtcgtaa caaggtttcc gtaggtgaac ctgcggaagg atcattgtcg 60 aagcctgcac agcagaacga cccgcggaca cgtaatcaca gccgggcgtt gagggggtcg 120 ggcgtgagcc cggtgcccgc gatgcctcgt cgacgtgcgt ctgcgatgcc ccgtttcgag 180 gcgtcgtgga tgttgcgtcg gcacctaaac aaaccccggc acggcatgtg ccaaggaaaa 240 caaaacatag gaagggcgcg tcccgtgttg ccccgttcgc ggtgtgtgca cgggccgtgg 300 cctctcaata accataaacg actctcggca acggatatct cggctcacgc atcgatgaag 360 aacgtagcaa aatgcgatac ttggtgtgaa ttgcagaatc ccgtgaacca tcgagttttt 420 gaacgcaagt tgcgcccgaa gccattcggc cgagggcacg tctgcctggg cgtcacgcat 480 cgcgtcgccc cagaccacgt ctccccaacg gggatgcgtt gttcgtctgg ggcggagaat 540 ggtctcccgt gccgtcggcg cggttggcct aaaaaggagt ccccttcgac ggacgcacgg 600 ctagtggtgg ttgttaaggc cttcgtatcg agccgtgcgt cgttagccgt aagggaaccg 660 ctctctaaag accccaacgt gtcgtctcgc gacgacgctt cgaccgcgac ccc 713 <210> 5 <211> 642 <212> DNA <213> Cirsium nipponicum <400> 5 tcgaagcctg cacagcagaa cgacccgtgg acacgtaatc acagccggcg tcgagggggt 60 cgggcgtgag ctcggtgccc gcgatgcctc gtcgacgtgc gtctacgatg ccccgtttcg 120 aggcgtcgtg gatgttgcgt tggcacctaa acaaaccccg gcacggcatg tgccaaggaa 180 aagaaaacat aggaagggcg cgtctcgtgt tgccccgttc gcggtgtgcg catgggccgt 240 ggcctctcaa taaccataaa cgactctcgg caacggatat ctcggctcac gcatcgatga 300 agaacgtagc aaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagttt 360 ttgaacgcaa gttgcgcccg aagccattcg gccgagggca cgtctgcctg ggcgtcacgc 420 atcgcgtcgc cccagaccac gcctccccaa cggggatgcg ttcgtctggg gcggagattg 480 gtctcccgtg ccgtcggcgc ggttggccta aaaaggagtc cccttcgacg gacgcacggc 540 tagtggtggt tgttaaggcc ttcgtatcga gccgtgcgtc gttagccgca agggaagcgc 600 tctgtaaaga ccctaacgtg tcgtctcgcg acgacgcttc ga 642 <210> 6 <211> 630 <212> DNA <213> Cirsium marianum <400> 6 tgcacagcag aacgacccgc gaacacgtaa tcacagccgg gcgtcgaggg ggtcgggcgt 60 gagcccggtg cccgcgatgc cttgtcgacg tgcgtctgcg atgccccgtt tcgaggcgtc 120 gtggatgttg cgtcggcacc taaacaaacc ccggcacggc atgtgccaag gaaaacaaaa 180 catatgaagg gtgcgtctcg tgttgccccg ttcgcggtgc gcgcacgggc cgtggcctct 240 caataaccat aaacgactct cggcaacgga tatctcggct cacgcatcga tgaagaacgt 300 agcaaaatgc gatacttggt gtgaattgca gaatcccgtg aaccatcgag tttttgaacg 360 caagttgcgc ccgaagccat tcggccgagg gcacgtctgc ctgggcgtca cgcatcgcgt 420 cgccccagac cacgccttcc ctacggggat gcgttcgtct ggggcggaga atggtctccc 480 gtgccgtcgg cgcggttggc ctaaaaagga gtccccttcg acggacgcac ggctagtggt 540 ggttgttaag gccttcgtat cgagccgtgt gtcgttagcc gcaagggaag cgctctccaa 600 agaccccaac gcgtcgtctc gcgacgatgc 630 <210> 7 <211> 645 <212> DNA <213> Cirsium arvense <400> 7 tcgaagcctg cacagcagaa cgacctgtgg acacgtaatc acagccgggc gtcaacgggg 60 tcgggtgtga gcccggtgcc tgcgatgcct cgtcgatgtg cgtctgcgat gccccgtttt 120 gaggcgtcgt ggatgttgcg tcggcaccta aacaaacccc ggcacggcat gtgccaagga 180 aaacaaaaca taggaagggc gcgtcccgtg ttgccccgtt cgcggtgtgc gcacgggtcg 240 tggcctctca ataaccataa acgactctcg gcaacggata tctcggctca cgcatcgatg 300 aagaacgtag caaaatgcga tacttggtgt gaattgcaga atcccgtgaa ccatcgagtt 360 tttgaacgca agttgcgccc gaagccattc ggccgagggc acgtctgcct gggcgtcacg 420 cattgcgtcg ccccagacta cgcctcccca acggggatgc gttcgactgg ggcggagaat 480 ggtctcccgt gtcgtcggcg tggttggcct aaaaaggagt ccccttcggc ggacgcacgg 540 ctagtggtgg ttgttaaggc cttcgtatcg agccgtgtgt cgttagccgc aagggaagca 600 ctctttaaag accccaatgt gtcgtctcgt gacgacgctt cgacc 645 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gccgttacta ggggaatcct tg 22 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 catgtgccaa ggaaaagaaa acataa 26 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atccccattg gggaggca 18 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 catgtgccaa ggaaaagaaa acaaaa 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 catgtgccaa ggaaaagaaa acagaa 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 catgtgccaa ggaaaagaaa acacaa 26 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atccccattg gggagaca 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 atccccattg gggagtca 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 atccccattg gggagcca 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggcgtcgtgg atgttgcgtt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccgacggcac gggagaccaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ggcgtcgtgg atgttgcatt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggcgtcgtgg atgttgcttt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggcgtcgtgg atgttgcctt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ccgacggcac gggagacaaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccgacggcac gggagactaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ccgacggcac gggagacgaa 20 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ctgcgatgcc tcgtcgat 18 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cgacacattg gggtctttaa agagt 25 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ctgcgatgcc tcgtcaat 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ctgcgatgcc tcgtctat 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ctgcgatgcc tcgtccat 18 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgacacattg gggtctttaa agtgt 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 cgacacattg gggtctttaa agggt 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cgacacattg gggtctttaa agcgt 25 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cacagcagaa cgacccgcga 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 acgaacgcat ccccgtaggg a 21

Claims (11)

1. 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1903번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 1903번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
   서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 2272번째 염기는 T 또는 A이고, 상기 2272번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
   서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1948번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 1948번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
   서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1999번째 염기는 A, T 또는 G이고, 상기 1999번째 염기를 포함하고, 서열번호 3의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;를 검출하기 위한 제제를 포함하며, 캐나다 엉겅퀴, 대계 엉겅퀴 및 섬엉겅퀴 중 1종 이상을 판별할 수 있는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드는 ITS(intergenic transcribed spacer) 유전자에서 유래된, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물.
5. 제1항 또는 제4항에 기재된 조성물을 포함하는, 엉겅퀴 계통 판별용 키트.
6. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 10 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
   서열번호 21 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
   서열번호 26 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
   서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
   서열번호 29 및 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및
   서열번호 30 및 서열번호 33의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 더 포함하는 캐나다 엉겅퀴, 대계 엉겅퀴, 섬엉겅퀴, 및 유럽 엉겅퀴 중 1종 이상을 판별할 수 있는, 엉겅퀴 계통 판별용 조성물.
10. 엉겅퀴 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
    상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 제6항 또는 제9항에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
    상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및
    전기영동의 결과를 분석하여 캐나다 엉겅퀴, 대계 엉겅퀴, 섬엉겅퀴, 및 유럽 엉겅퀴 중 1종 이상을 판별하는 단계를 포함하는, 엉겅퀴 계통 판별 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 PCR은 ARMS-PCR인, 엉겅퀴 계통 판별 방법.

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