CZ296930B6 - Zpusob identifikace genetických druhu chmelu - Google Patents

Abstract

Identifikace chmelových druhu je zalozená na polymorfismu v genetické sekvenci druhu chmelu. Presneji, polymorfní oblasti chmelové DNA jsou amplifikovány pomocí polymerázové retezové reakce za pouzití vybrané amplifikované oblasti obsahující polymorfismus v sekvenci bází v ruzných druzích chmelu a amplifikované fragmenty se analyzují. Tímto zpusobem mohou být jednoduse a presne identifikovány jednotlivé druhy chmelu.

Description

Identifikace chmelových druhů je založená na polymorfismu v genetické sekvenci druhů chmelu. Přesněji, polymorfní oblasti chmelové DNAjsou amplifikovány pomocí polymerázové řetězové reakce za použití vybrané amplifikované oblasti obsahující polymorfismus v sekvenci bází v různých dluzích chmelu a amplifikované fragmenty se analyzují. Tímto způsobem mohou být jednoduše a přesně identifikovány jednotlivé druhy chmelu.

Způsob identifikace genetických druhů chmelu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu identifikace druhů chmelu a především identifikační metody, která využívá technologii genetického inženýrství.

Dosavadní stav techniky

Chmel dává pivu jedinečné aroma a hořkost, a pomáhá vysedimentování přebytečných bílkovin a potlačuje bakteriální proliferaci. Nicméně míra účinku chmelu se liší v tomto směru podle druhu chmelu, proto je nutné identifikovat druhy chmelu pro udržení výroby piva stejné kvality a pro vývoj nových piv.

Obvykle je identifikace druhů chmelu založená na jejich základních složkách, tj. hořkých složkách (a kyseliny / β kyseliny kohumulonové / humulonové, kolupulon / lupulon) a esenciálních olejových složek (famezen, karyofylen).

Kromě faktu, že identifikační metoda založená na hořkosti a olejích vyžaduje namáhavá měření všech složek, také není schopná přesně určit druhy, protože tyto složky dokonce vtom stejném druhu závisí na pěstované oblasti a roku.

Současný vývoj v genetickém inženýrství, množství pokusů provedených k vyřešení sekvence chromozómů, která závisí na druhu rostlin a založené na zjištění sekvence bázi, umožnil identifikovat odrůdy s různou genetickou informací mezi různými rostlinami, nebo druhy té stejné rostliny, tj. z polymorfismu DNA sekvence.

Identifikace rostlinných druhů podle tohoto typu polymorfismu je spolehlivá, protože samotná sekvence DNA stěží podléhá vlivům prostředí a je proto neměnná.

Z tohoto hlediska, předpokládaný vynález poskytuje spolehlivý a jednoduchý způsob identifikace chmelových druhů, použitím uvedené genetické techniky

Podstata vynálezu

Způsob identifikace chmelového druhu podle vynálezu geneticky detekuje tento polymorfismus založený na různých mezidruhových sekvencích DNA. Přesněji, části sekvence DNA chmelu, které vykazují polymorfismus, jsou amplifikovány polymerázovou řetězovou reakcí (dále jako PCR) použitím identifikačního očka a druhy jsou pak identifikovány analýzou takto amplifikované DNA.

K použití výše uvedeného způsobu je důležité poznat polymorfismus DNA mezi různými druhy chmelu.

Pojem polymorfismus specificky zahrnuje rozdíl v genetice sekvence, kteiý je způsobený inzercí, delecí nebo substitucí. Délka této sekvence může být 1 bp nebo několik desítek a více bp, ale s výhodou v rozmezí, několika bp nebo několik desítek bp.

Tento sekvenční polymorfismus mezi druhy může být detekován určením sekvencí části odpovídající chromozómové DNA každého druhu a potom provedením porovnávací analýzy sekvencí. Jednoduchým způsobem je použití RAPD (Náhodná amplifikovaná polymorfická DNA) techniky vyvinuté Williamsem, a spol. (Nucleic Acids Research. Vol. 18, p. 6531, 1990).

-1 CZ 296930 B6

Tato RAPD technika detekuje polymorfismus mezi neznámými sekvencemi DNA použitím PCR.

Přesněji, očka nízké specifičnosti, zahrnující relativně krátké syntetické nukleotidy, asi 10 bází, jsou smíchána s mnoha typy DNA a provede se PCR.

Když sekvence chmelu obsahuje sekvenci, která je zcela nebo částečně komplementární k očkům, očka tepelně hybridizují s úplnou nebo částečnou komplementární sekvencí a část ohraničená očky je syntetizována a amplifíkována. Jestliže jsou rozdíly v sekvencích takové, jako je inzerce nebo delece DNA v části mezi očky, v PCR se získají amplifikované fragmenty různých velikostí v závislosti na druhu. Dále jestliže sekvence jednoho druhu tepelně hybridizuje s očkem a druhý druh ne, tak získáme jen PCR fragmenty prvního druhu. Polymorfismus může být pak detekovaný frakcionaci, například elektroforézou.

RAPD metoda může být použita nejen k detekci polymorfismu podle výše popsaného vynálezu, ale také k výběru oček, které mohou detekovat polymorfismus pomocí PCR, tj. jako metoda určující očko.

Předmětem způsobu podle vynálezu jsou všechny polymorfní oblasti DNA chmelových druhů detekované RAPD metodou. Tedy všechny očka, které mohou amplifikovat polymorfní oblast detekovanou RAPD metodou, mohou být použity jako identifikační očka podle vynálezu.

Identifikační očka podle vynálezu vyvinutá výše uvedeným způsobem, mohou být jedním nebo dvěma typy nebo více typy syntetických oligonukleotidů.

Délka syntetického oligonukleotidu je v rozsahu 6 až 40, s výhodou 10 až 21. Přesněji je výhodné používat oligonukleotidy obsahující sekvence bází uvedené v SEKV. IČ: 1 až 8 a SEKV. IČ: 10 až 14 v sekvenčním seznamu.

Druhý způsob určení identifikačních oček podle vynálezu zahrnuje následující stupně:

Tento způsob nejprve stanovuje sekvenci bází amplifikovaných fragmentů získaných polymerázovou řetězovou reakcí použitím identifikačního očka (tj. očka, které může amplifikovat polyformní oblast detekovanou výše uvedenou metodou RAPD, dále uvedené jako primární očko). Nakonec jsou syntetizována dvě identifikující očka, která jednotlivě doplňují pozici dříve určeného intervalu výše uvedeného fragmentu polymorfní sekvence, to znamená, že produkují amplifikovaný fragment, který umožňuje identifikaci polymorfní sekvence s primárním očkem, s vysokou reprodukovatelností a jednoduchostí.

Jinými slovy, podle výše uvedeného způsobu může být identifikační očko selektivně určeno na základě polymorfní sekvence a okolních sekvencích.

Uvedené primární očko může být oligonukleotid složený ze sekvence bází popsané v SEKV. IČ:

až 8 a SEKV. IČ: 10 až 14 v sekvenčním seznamu.

Například první sekvence identifikačního očka může být určená tak, že další nebo obě očka obsahují celou nebo část výše uvedené polymorfní sekvence.

Když se provede identifikace druhu s dříve uvedenými očky a použije se druh, který obsahuje vybranou polymorfní sekvenci, s PCR amplifíkacemi DNA druhu, je získána specifická amplifíkovaná DNA, protože druh neobsahuje komplementární sekvenci. V tomto případě je možná identifikace druhu podle přítomnosti nebo nepřítomnosti amplifikovaného fragmentu. Sekvence druhého identifikačního očka může být určena tak, že dva typy oček jsou umístěny jeden nad a druhý pod odpovídající polymorfní sekvenci.

-2CZ 296930 B6

Jestliže je provedena identifikace druhu použitím výše uvedených identifikujících oček, je produkována pomocí PCR DNA, mající různé vnitřní sekvence bází, které jsou závislé na druhu a v některých případech také různý počet bází. Druh může být identifikován z pohyblivosti vzorku, získané frakcionací amplifikované DNA elektroforézou, pokud je nutné elektroforézou po štěpení restrikčními enzymy, denaturační enzymovou elektroforézou nebo teplotní gradientovou gelovou elektroforézou.

Třetí identifikační očko může být určeno tak, aby na 5'konci obsahovalo sekvenci primárního očka, sekvence bází v polymorfní části připojenou k této sekvenci obsahující 5 až 20 bází společně vázaných. Identifikace druhu použitím tohoto identifikačního očka je vhodná, když je například polymorfní sekvence na místě, ke kterému je primární očko komplementární. Jinými slovy, polymorfní sekvence může být detekovaná s vyšší specifitou, než se samotným primárním očkem připojením k němu sekvenci 2 až 5 bází.

Dále jiné identifikační očko neobsahující tento typ sekvence může být také vhodně použito jako identifikační očko chmelu, a to v případě, že je určeno podle výše uvedeného způsobu.

Přesněji, identifikační očko určené podle výše uvedeného způsobu, může být syntetický oligonukleotid obsahující sekvenci bází v SEKV. IČ 15 až 40 sekvenčního seznamu nebo vhodná kombinace dvou syntetických oligonukleotidů, ze kterých každá obsahuje část této sekvence bází, pokud je výhodnější.

Případně může být identifikačním očkem syntetický oligonukleotid, který obsahuje část sekvence bází genomové DNA mezi místem, kde sekvence bází s SEKV. IČ: 15 (17, 19, 21, 23, 25,27, 29, 31, 33, 35 a 37) je hybridizována ke genomové DNA a místem, kde je sekvence bází SEKV. IČ: 16 (18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 a 38) hybridizována ke genomové DNA.

Podle tohoto způsobu určení identifikačního očka (tj. s tímto složením), je možné stanovit sekvenci bází úseku, který představuje polymorfísmus a tedy způsob poskytuje očko, které může spolehlivěji identifikovat druh.

Takto, provedením porovnávací analýzy DNA mezi druhy, založené na genetické technice podle způsobu Identifikace druhu podle vynálezu, mohou být chmelové druhy spolehlivě identifikovány bez vlivu prostředí, ve kterém byly pěstovány.

Vynález bude nyní popsán podrobněji, a to s odkazy a specifickými případy, ale vynález v žádném případě není omezen těmito příklady.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je fotografie ukazující pohyb vzorku získaného, když části z DNA Hallertauer Tradition (HT) a Shinshu Wase (SW) byly jednotlivě amplifikovány s použitím primárního očka (jeden typ očka: 872) a amplifikované fragmenty byly podrobeny elektroforéze (podle způsobu určení druhého identifikačního očka).

Obr. 2: je diagram, který ukazuje sekvenci bází amplifíkovaných fragmentů podrobených elektroforéze v okolí 600 bp ukázaných šipkou na obr. 1; horní skupina ukazuje sekvenci bází HT a dolní skupina ukazuje sekvenci bází SW. Identická místa bázi patřící k HT v horní skupině jsou označeny černými tečkami (°) a jsou uvedeny báze, kde substituce bází je v místech odpovídající oběma dvěma. Místa, která nepatří k bázím ani jednoho typu, tj. chybějící místa, jsou uvedeny značkou minus (-).

-3 CZ 296930 B6

Orámovaná B72WF2 obsahuje sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 27 sekvenčním seznamu, která je vybrána jako identifikační očko. Rám uzavírající B72WR2 obsahuje sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ 28 sekvenčního seznamu, což je komplementární sekvence k identifikačnímu očku.

Obr. 3: je fotografie, která ukazuje výsledky elektroforézy frakcionace amplifikovaných fragmentů, když je PCR provedena použitím identifikačního očka obsahujícího B72WF2 (SEKV. IČ: 27) a komplementární sekvence B72WR2 (SEKV. IČ 28) uvedené na obr. 2. Obr. 4: je výkres uvádějící sekvenci bází jiného polymorfního amplifikovaného fragmentu (RAPD značka).

Obr. 5: je výkres uvádějící sekvenci bází ještě jiných polymorfních amplifikovaných fragmentů (RAPD značka).

Ve způsobu identifikace chmelového druhu podle vynálezu, polymorfní oblasti, tj. části DNA, ve kterých DNA sekvence je odlišná u různých druhů chmelu, jsou amplifikovány PCR použitím identifikačního očka a druhy jsou identifikovány analýzou rozdílů mezi jednotlivými amplifikovanými fragmenty.

Sbírka DNA chmelu

Chmelová DNA může být pro studium odebrána z malého množství chmelových listů, plodů a zrnek.

Chmelová DNA může být získána metodou všeobecně používanou k tomuto účelu z rostlinných vzorků, například typickou metodou je extrakce DNA, popsaná v Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980) nebo jednodušeji proveditelná extrakce použitím komerční soupravy pro DNA krve a buněčné kultury (QLAGEN Nic.). Při použití Soupravy je DNA absorbována na záporný ion iontoměničové, pryskyřičné kolony a opět uvolněna, takže problém způsobený příměsí látek, které mohou interferovat s reakcí může být vyřešen.

Dále jsou popsány některé způsoby určeni identifikačního očka, které mohou být použity ve vynálezu.

První způsob určení identifikačního očka

K určení očka může být použita jakákoliv metoda, která vyhledává oligonukleotidy, které detekují polymorfní část nebo sekvenci různých odrůd pomocí PCR, ale zvláště vhodná je RAPD metoda.

K provedení RAPD metody se nejdříve připraví skupina oček obsahující různá očka.

Očka použitá v běžné RAPD metodě se mohou získat z DNA použitím automatické syntetické soupravy, například fosfoamididovou technikou. Mají náhodné sekvence a jejich délka je 6 až 40 nukleotidů nebo s výhodou 10 až 21 nukleotidů.

Také je možné použít sekvence bází objevené Williamsem a spol. (Nucleic Acid Research. Vol. 18, p.653 1, 1990), podle Bečka společná očka nebo komerční oligonukleotidy z Operon 10 - mer souprav vyrobených OPERON Co. PCR se pak provede s různými typy chmelové DNA, přičemž se použije jedno nebo více oček z výše uvedené skupiny za stejných podmínek, které budou dále popsané v PCR reakci.

Dále, fragmenty amplifikované pomocí PCR jsou frakcionované na vhodném elektroforetickém gelu a jsou porovnávány stupně pohyblivosti amplifikovaných fragmentů mezi druhy.

Jestliže výsledkem výše uvedeného pozorování jsou nalezené odlišné amplifikované fragmenty nebo fragmenty s různou velikostí mezi druhy, vezmou se jako polymorfní amplifikované

-4CZ 296930 B6 fragmeny (RAPD značky) a jedno nebo dvě očka produkující tyto fragmenty se vyberou z výše uvedené skupiny oček, aby byla použitelná jako identifikační očka.

Příkladem touto cestou vybraného identifikačního očka je syntetický oligonukleotid obsahující sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 1 až 8 a SEKV. IC: 10 až 14 sekvenčního seznamu a samozřejmě tyto sekvence mohou být použité jako komplementární sekvence.

Jakýkoliv oligonukleotid obsahující část sekvence bází uvedené v SEKV. IČ: 1 až 8 a EKV. IČ: 0 až 14 sekvenčního seznamu může být použit v PCR reakci jako identifikační očko, které může amplifíkovat jakoukoliv vybranou polymorfhí sekvenci chmelové DNA.

Dále v závislosti na reakčních podmínkách PCR reakce může být použit jakýkoliv oligonukleotid obsahující sekvenci podobnou výše uvedeným syntetickým oligonukleotidům.

Podle první zjišťovací metody se lehce určuje identifikační očko, které může detekovat polymorfísmus v chmelu obsahujícím neznámou sekvenci.

Kromě toho tímto způsobem vybrané identifikační očko plni svoji funkci velmi dobře, jak bude ukázáno v následujících případech.

Druhý způsob určení identifikačního očka

Druhý způsob určení identifikačního očka stanovuje sekvenci bází polymorfních amplifíkovaných fragmentů (RAPD značek) zjištěných prvním způsobem určení identifikačního očka a zjistí polymorfhí sekvence.

Sekvence, které může produkovat amplifikovaný fragment obsahující polymorfhí sekvenci, jsou vybrány jako identifikační očka ze sekvence v těchto stanovených polymorfních amplifikovaných fragmentech.

Očko může být určeno z typového seznamu „PCR technology“ ed. Henry A. Erlich. Takara Shuzo Co. Ltd., který je často citován v PCR.

Přesněji, když se vybraná sekvence očka z DNA amplifikovaného fragmentu liší velikostí od RAPD značky, je vybrána libovolná sekvence bází oligonukleotidů obsahující sekvenci uloženou na straně inzerce nebo na straně delece v RAPD značce.

Příkladem takovéhoto identifikačního očka je kombinace oligonukleotidů obsahujících sekvenci bází popsanou v SEKV' IČ: 27, 28 sekvenčního seznamu.

Velikost RAPD značky je od 1 bp až několik sto bp, ale velikost asi 10 bp až několik desítek je k identifikaci obvyklejší. Také tam může být párová substituce, která může být identifikována restrikčními enzymy, nebo podobně, dokonce když se neliší velikostí.

Velikost, která může být snadno rozeznána elektroforézou závisí na typu a koncentraci použitého gelu, ale jako pravidlo může být 1/10 nebo více z celkové délky. Například očko je určeno tak, že když sekvence inzertu je 20 bp, želá délka amplifikovaného produktu je 200 bp nebo méně. Proto použitím takového typu očka pro PCR jsou získány amplifikované fragmenty, jejichž velikost umožňuje snadnější rozlišení polymorfismů.

Případně, jestliže amplifikované fragmenty mezi druhy mají různou velikost, mohou být vybrány oligonukleotidy, které obsahují vnitřní sekvence na straně inzertu a sekvence na místech, která spojují místa, kde byla delece. Proto použitím PCR s tímto typem identifikačního očka se získají fragmenty s různou velikostí inzerce nebo delece.

-5CZ 296930 B6

Jestliže může být RAPD značkou identifikována přítomnost nebo nepřítomnost specifických pásů amplifikované DNA v závislosti na druhu, jako očko je vybrán oligonukleotid z vnitřní sekvence, bází RAPD značky, obsahující optimální sekvenci pro polymerázovou řetězovou reakci. Příkladem takového očka jsou oligonukleotidy obsahující sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 35, 36 sekvenčního seznamu.

Dále se ukazuje, že polymorfismus je jen v místě, kde se primární očko hybridizuje, může, být vybrán syntetický oligonukleotid obsahující sekvenci primárního očka na 5'konci a obsahující 5 až 20 sekvencí bází RAPD značky.

Například, když je použito očko obsahující vnitřní sekvenci bází RAPD značky a pomocí PCR jsou touto cestou produkovány amplifikované produkty té stejné velikosti pro všechny druhy, může být výběrem očka zvýšena specifičnost. Specifickým příkladem je očko obsahující sekvenci bází v SEKV. IČ: 15 a 16 sekvenčního seznamu, která je připojená k sekvenci bází na 5'konci (obr. 5). Jestliže však je sekvence bází, která je připojena v RAPD značce, příliš krátká, zvýší se v PCR nespecifická amplifikace pásů a detekce polymorfismu není možná.

Jestliže jsou rozpoznávaná místa pro restrikční enzymy v sekvenci bází RAPD značky, která by umožnila identifikovat druh, tak může být k získání amplifikovaných produktů určeno primární očko, které má zachovány tyto enzymem rozpoznávaná místa. Příklad takovéhoto očka jsou oligonukleotidy obsahující sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 33, 34 sekvenčního seznamu.

Když je očko určeno touto cestou, hybridizační teplota může být určena tak, že provedením PCR jsou amplifikované jen cílové fragmenty (RAPD značka). Identifikace DNA amplifikovaných pásů je proto snadná a získali jsme spolehlivé výsledky.

Syntetické oligonukleotidy poskytují jednoduchý způsob získání oček určených dále popsanou cestou. Syntetická očka použitá ve vynálezu se mohou získat použitím komerčního DNA autosyntetizujícího přístroje, pomocí například fosfoamididové metody.

Délka řetězce takových oligonukleotidů je 15 až 40, s výhodou 20 až 30. S výhodou mohou být použity jakékoliv oligonukleotidy, které obsahují sekvenci bázi popsanou v SEKV. IČ: 1 až 8 a SEKV. IČ: 10 až 14 sekvenčního seznamu.

Kromě toho dále mohou být použity syntetické oligonukleotidy obsahující část sekvence bází chmelové DNA mezi místem, ke kterému jsou komplementární jiné syntetické oligonukleotidy obsahující dva druhy sekvencí bází ze sekvencí bází popsaných v SEKV. IČ: 15 až 38 sekvenčního seznamu (například 15 a 16, 17 a 18, ...35 a 36, atd.).

Identifikační očka, podle dříve uvedeného určujícího způsobu amplifikace polymorfní oblasti, umožňují vhodnou identifikaci založenou na polymorfních amplifikovaných fragmentech, tj. sekvencích obklopujících polymorfní sekvenci a také obsahujících sekvenci vhodnou pro PCR. Použitím těchto oček může být proto uskutečněná přesná identifikace druhu.

PCR reakce

Dále polymorfní oblast DNA chmelu je amplifikována pomocí PCR použitím identifikačního očka určeného podle výše uvedeného prvního nebo druhého určovacího způsobu.

PCR reakce je např. popsána Saiki a spol., Science. Vol. 230, p. 1350 - 1354. Specificky, reakce se skládá z následujících kroků: stupeň denaturace matrice DNA, stupeň hybridizace očka s DNA matricí a stupeň pro provedení replikačního cyklu DNA obsahujícího prodlužovací stupeň s DNA polymerázou s očkem, jako startovacím bodem.

-6CZ 296930 B6

PCR byla provedena zpracováním každého druhu v samostatné reakční zkumavce. Reakční roztok byl připraven přidáním jednoho nebo dvou typů syntetických oligonukleotidů. DNA polymerázy, 4 druhů deoxyribonukleotidů (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), DNA z každého druhu chmelu jako matrice DNA a amplifíkační tlumivý roztok (obsahující asi 1,0 μΜ až 4,0.μΜ, ale s výhodou asi 1,5 μΜ až 3,0 μΜ) chloridu hořečnatého, chlorid draselný, želatinu, hovězí sérový albumin a povrchově aktivní látku (např. Tween 20, NP-40, Triton XI00 (vše komerční názvy) a dimethylsulfoxid). Reakční zkumavka obsahující reakční roztok byla vložena do termocyklovače nebo podobně a uskutečnil se vhodný počet cyklů dříve zmíněného DNA replikačního cyklu, například asi 20 až 50 cyklů, ale nejlépe 25 až 40 cyklů.

PCR reakční stupně mohou být provedeny, například za následujících podmínek.

Denaturační krok se normálně uskuteční zahřátím od 90 do 95 °C, výhodně od 94 do 95 °C, přibližně 1 minutu až 3 minuty, ale nejlépe od přibližně 1 minuty do 2 minut.

Stupeň tepelné hybridizace očka se provede inkubací s očkem při přibližně 30 až 42 °C přibližně 1 minutu až 3 minuty, ale výhodně od přibližně 1 minuty do 2 minut. Identifikační očko můžebýt jednoho typu nebo kombinací dvou nebo více typů podle přání.

Prodlužovací stupeň s DNA polymerázou se uskuteční v přítomnosti termostabilní DNA polymerázy, normálně při přibližně 70 až 73 °C, ale výhodně při přibližně 72 až 73 °C, a přibližně 1 minutu až 4 minuty, ale výhodně přibližně 2 minuty až 3 minuty. Tato termostabilní DNA polymeráza může být komerční, termostabilní DNA polymeráza vyrobená PERKIN ELMER s.r.o.

Žádaná amplifíkovaná DNA se může získat opakováním předcházejících stupňů.

Analýza amplifikovaných fragmentů

Amplifíkovaná DNA produkovaná PCR reakcí použitím identifikačního očka je frakcionovaná elektroforézou, což je obvyklá metoda frakcionace DNA. Druh může být identifikovaný na základě pohyblivosti získaných pásů.

V elektroforéze, vhodná pohyblivost pásů může být získána použitím přibližně 3 až 20 % polyakrylamidového gelu pro DNA fragmenty s velikostí 1000 deoxyribonukleotidových párů a méně a pro delší fragmenty v přibližně 0,2 až 2 % agarózovém gelu.

Pro elektroforézu může být použit jako elektroforetický tlumivý roztok systém Triskyselina fosforečná (pH 7,5 až 8,0), Tris - kyselina octová (pH 7,5 až 8,0), výhodně systém Tris kyselina boritá (pH 7,5 až 8,3), ale nejlépe systém Tris - kyselina fosforečná. Jestliže je nutné, může být přidána EDTA.

Podmínky elektroforézy se liší a závisí na velikosti elektroforetické aparatury, ale mohou být například 50 až 300 V, 10 až 120 minut, ale výhodně 150 V, 30 minut. K porovnání velikosti se současně přidávají značky při elektroforéze, mohou být použity komerční značky, například 100 Base Pair Ladder (Pharmacia lne.)

Amplifíkovaná DNA může být zviditelněna detekováním s látkami, jako je fenantridinové barvivo, například ethidiumbromid, které mohou reagovat s nukleovými kyselinami. Technika barvení se provede buď přidáním takové látky, jako je ethidiumbromid, aby byla jeho konečná koncentrace přibližně 0,5 mg/ml, nebo se gel po elektroforéze ponoří do vhodného roztoku ethidiumbromidu o přibližně 0,5 mg/ml na přibližně 10 až 60 minut. Když se obarvený gel ozáří UV zářením při 254 nm nebo 366 nm v tmavé místnosti, může být pohyblivost vzorku detekována jako červené pásy DNA, které jsou spojeny s ethidiumbromidem. Výhodou je že, když se přidá

-7CZ 296930 B6 barvicí roztok do elektroforetické aparatury, pohyblivost vzorku může být dokonce pozorována také v průběhu elektroforézy. Kromě této elektroforetické metody amplifikovaná DNA může být analyzovaná čímkoliv, co může detekovat její přítomnost nebo nepřítomnost nebo velikost.

Identifikace druhu

Druh může být identifikovaný porovnávací analýzou pohyblivosti vzorku, získané jak bylo popsáno výše. Porovnávací analýza mezi druhy může být provedena tak, že je například založena na různé přítomnosti nebo nepřítomnosti nebo různé velikosti předurčené amplifikovanéDNA.

Přítomnost nebo nepřítomnost amplifikované DNA v určitých druzích ukazuje, zda očko použité pro PCR obsahuje sekvenci pro tepelnou hybridizaci (tj. komplementární sekvenci) a rozdíly velikostí amplifikované DNA ukazují, že existují polymorfiií sekvence, například delece nebo inzerce v částech amplifikovaných pomocí PCR, které závisí na odrůdě.

K přesnější identifikaci druhů je výhodnější se nespoléhat jen na výsledky PCR, ale srovnat pohyblivost vzorku amplifikovaných fragmentů, když jsou použity jako identifikační očka jeden nebo dva různé oligonukleotidy.

Kromě toho přesnost, se kterou může být druh identifikován a kapacita k rozlišení mezi nimi, může být dokonalejší sledováním výsledků získaných při různých podmínkách PCR, například hybridizační teplotě, koncentraci hořčíku v reakčním tlumivém roztoku, atd.

Způsob identifikace chmelových druhů podle vynálezu, provedená předcházejícími postupnými operacemi, může jasně rozlišit různé odrůdy.

Aplikace

Způsob identifikace druhů podle vynálezu může být aplikován k ověření čistoty odrůd chmelu pro použití takových produktů chmelu, jako jsou chmelové pelety.

Například studium je provedeno na základě rozdílu mezi amplifikovanými DNA získanými ze standardních chmelů a amplifikovanými DNA získanými z chmelových peletů. Jestliže je amplifikovaná DNA jiná než ta, která je získána ze standardního chmelu, může být stanoveno, že jiné odrůdy nebo druhy jsou smíchány se standardním chmelem v peletech.

Pokud je očekávána přítomnost jiných odrůd nebo druhů, množství amplifikované DNA, rozsah v jakém jsou jiné odrůdy nebo druhy přítomny tj. čistota, může být měřena pozorováním například intenzity obarvení s ethidiumbromidem, jak bylo popsáno výše.

V tomto případě také přesnost odhadu čistoty může být zvýšená použitím dvou nebo více syntetických oligonukleotidů společně podle vynálezu.

Může se očekávat, že, nukleotidy vynálezu mohou být aplikovány pro identifikaci jiných druhů rostlin než chmelu (například moruše, jahody, třešně, atd.) Místa, kde sekvence deoxyribonukleotidů je u blízkých druhů různá, jsou místa, kde se snadno objevují mutace DNA, a proto jsou omezena. Například je popsáno, že místo kódující rDNA může být použito k identifikaci druhů bakterií (E. coli, bakterie mléčného kvašení) nebo rostlin (semínek rýže, pomerančů). Proto místa, která byla podle vynálezu nalezena jako odlišná u blízkých druhů, mohou být pravděpodobně použita také k identifikaci druhů jiných rostlin.

Způsob identifikace odrůdy podle vynálezu provádí analýzu založenou na polymorfismu sekvencí mezi druhy, a proto mohou přesně rozlišit druhy chmelu bez vlivu prostředí. Dále, identifikační způsob podle vynálezu může nejen identifikovat druhy, ale také měřit čistotu různých druhů chmelu ve chmelových produktech.

-8CZ 296930 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklady 1 až 12 uvádějí identifikaci druhu chmelu při použití identifikačního očka určeného prvním určujícím způsobem identifikačního očka.

Příklad 1

Extrakce genomové DNA

Použil se chmel Brewer' s Gold (dále označený jako druh č. 1), Nothem Brewer (dále označovaný jako druh č. 2), Tettnanger (dále označený jako druh č. 3), Saazer (dále označený jako druh č. 4), Hersbrucker speat (dále označený jako druh č. 5), Spalter selecí (dále označený jako druh č. 6), Hallertauer tradition (dále označený jako druh č. 7), Shinshu Wase (dále označený jako druh č. 8) a Furano Ace (dále označený jako druh č. 9).

Tkáň zelených listů (surová hmotnost 1 g) z výše uvedených druhů byla jemně nasekána a fragmenty tkáně se zmrazily ponořením do kapalného dusíku. Po změně zmrazených látek na prášek v tekutém dusíku při použití Polytropu, byla genomová DNA extrahována z 50 mg prášku pomocí Soupravy pro DNA krve a buněčných kultur (QIAGEN lne.). Nakonec se získalo 10 až 20 mg genomové DNA.

Příklad 2

Klasifikace chmelových odrůd se provedla pomocí PCR, jako očko se použily oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 1 a 2. Polymerázová řetězová reakce se provedla v mikrozkumavkách obsahujících 50 μΜ KC1, 1,5 μΜ MgCl₂ a 10 μΜ Tris - HC1 tlumivý roztok (pH 8,8) obsahující 0,1 % Triton X-100. Do zkumavky se přidala jedna jednotka termostabilní DNA polymerázy (Wako Pure Chemicals), 20 nmol čtyř bází (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 0,1 mg genomové DNA z každého druhu chmelu připraveného podle Příkladu 1 a jako očko se přidalo 33 pmol oligonukleotidů popsaných v SEKV. IČ: 1 a 2. Konečný objem reakčního roztoku byl 30 μΐ a ke každé zkumavce se přidalo přibližně 20 μΐ minerálního oleje, aby se zabránilo odpařování reakčního roztoku.

Výše uvedená polymerázová řetězová reakce byla provedena za následujících podmínek. Nejprve, při udržení teploty 94 °C po dobu 3 minut se uskutečnil denaturační stupeň zahřátím při 94 °C po dobu 1 minuty a stupeň teplotní hybridizace s očkem se uskutečnil při 35 °C po dobu 1 minuty. Extenzní stupeň s DNA polymerázou byl proveden uskutečněním 35 cyklů s termostabilní DNA polymerázou, každý při 72 °C po dobu 2 minut a udržení teploty 72 °C po dobu 10 minut. Produkt se uchoval při 4 °C.

Amplifikovaná DNA získaná výše uvedenou polymerázovou řetězovou reakcí byla oddělena elektroforézou při 150 V, po dobu 30 minut v tlumivém roztoku 100 μΜ Tris - kyselina boritá (pH 8,0), obsahujícím 2 μΜ EDTA za použití 5 % polyakrylamidového gelu. Jako značka velikosti se použil 100-Base-Pair Ladder (Pharmacia lne.).

Po elektroforéze se gel ponořil do 0,5 mg/ml vodného roztoku ethilidiumbromidu na 10 minut a ozářil se UV zářením při 254 nm v tmavé místnosti. Byly detekovány červené pásy, které patřily sloučeninám DNA s ethidiumbromidem. Získané výsledky jsou znázorněny v Tabulce L

Z tabulky je jasné, že když se použily jako očka oligonukleotidy obsahující sekvenci deoxyribonukleotidů popsanou v SEKV. IČ: 1 a 2, byly detekovány dva amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 520 bp a přibližně 530 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti těchto pásů bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

-9CZ 296930 B6

Tabulka 1

SEKV IČ:	1,	2	3,	4	5, 6	7, 8	9
Amplifikovaná DNA (bp)	520	530	750	850	270	370	950	1200
Druh chmelu č.
1	O	o	O		O
2	O	o
3	O	0			O
4	O	O			O
5	O	O	o		O
6	o	o
7	O
8	O	O	O		0
9	O	O	0	O		0

Příklad 3

Způsob byl stejný jako v příkladu 2, kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 3 a 4 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci se provedl při 40 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 3 a 4, byly detekovány dva amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 750 bp a přibližně 850 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd zařazeno do čtyř kategorií.

Příklad 4

Způsob byl identický jako v příkladu 2, kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 5 a 6 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci se provedl při 40 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 5 a 6, byl detekován jeden amplifikovaný genomový pás o velikosti přibližně 270 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo devět chmelových odrůd zařazeno do dvou kategorií.

Příklad 5

Způsob byl identický jako v příkladu 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 7 a 8.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 7 a 8, byl detekován jeden amplifikovaný genomový pás o velikosti přibližně 370 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

Příklad 6

Způsob byl identický jako v příkladu 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 9 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci se provedl při 40 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.

-10CZ 296930 B6

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 9, byly detekovány dva amplifíkované genomové pásy o velikosti přibližně 950 bp a přibližně 1200 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd zařazeno do tří kategorií.

Příklad 7

Způsob byl identický jako v příkladu 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 10 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci se provedl při 38 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 10, byly detekovány tři amplifíkované genomové pásy o velikosti přibližně 650 bp a přibližně 700 bp a přibližně 1200 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd zařazeno do čtyř kategorií.

Tabulka 2

SEKV. IČ:	10	11	12
Amplifikovaná DNA (bp)	650 700 1200	1400	550 800
Druh chmelu č.
1	0	0	0 0
2	0 0
3	0 0
4	0
5	0
6	0
7	0		0
8	0 0 0	0	0
9	0	0	0

Příklad 8

Způsob byl identický jako v příkladu 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 11 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 38 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 11, byl detekován jeden amplifíkovaný genomový pás o velikosti přibližně 1400 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo devět chmelových odrůd zařazeno do dvou kategorií.

-11 CZ 296930 B6

Příklad 9

Způsob byl identický jako v příkladu 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 12 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci se provedl při 38 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 12, byly detekovány dva amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 550 bp a přibližně 800 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd zařazeno do čtyř kategorií.

Příklad 10

Způsob byl identický jako v příkladu 2, kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v. SEKV. IČ: 13 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci se provedl při 38 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 13, byly detekovány čtyři amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 500 bp, 640 bp, 650 bp a přibližně 1400 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd zařazeno do pěti kategorií.

Příklad 11

Způsob byl identický jako v příkladu 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 14 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 38 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 14, byl detekován jeden amplifíkovaný genomový pás o velikosti přibližně 540 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

Tabulka 3

SEKV. IČ:	13	14
Amplifikovaná DNA (bp)	500	640 650	1400	540
Druh chmelu č.
1	O	O	O	O
2	O	O		O
3	O	0
4	O
5		O	O
6		O	O
7	O	O		0
8		O	O	O
9	O	O	0

-12CZ 296930 B6

Příklad 12

Chmelový pelet, prodávaný jako druh č. 8 (vyráběný Northem Hop Agricaltural Cooperative. Iwate-ken v licenci Sapporo Breweries Ltd.) byl ve třecí misce rozdrcen na prášek a z 20 mg prášku se extrahovalo přibližně 5 mg genomové DNA za použití soupravy pro DNA krve a buněčných kultur (QLAGEN lne.). Aplikoval se ten stejný postup jako v příkladu 2, jako očko se použil synteticky oligonukleotid obsahující sekvence deoxyribonukleotidů popsané v SEKV. IČ: 1 až 2.

K ověření čistoty se stanovil rozdíl mezi detekovanou amplifikovanou genovou DNA a amplifikovaným genomem ze standardního druhu č. 8.

Dále, identifikace chmelového druhu použitím očka určeného podle druhého identifikačního způsobu určení očka, bude popsaná v příkladech 13 až 30.

Příklad 13

Extrakce genomu DNA

Tkáň ze zelených listů (surová váha 1 g) z výše uvedených druhů se jemně nasekala a fragmenty tkáně se zmrazily ponořením do kapalného dusíku. Po změně zmrazených látek v kapalném dusíku na prášek při použití Polytronu, se genomová DNA extrahovala z 50 mg prášku pomocí Soupravy pro DNA krve a buněčných kultur (QIAGEN lne.). Nakonec se získalo z každého druhu 10 až 20 mg genomové DNA.

Příklad 14

Výběr RAPD značek

Po získání RAPD značky se provedla PCR s 0,34 μΜ očkem - 872 (Obr. 2) Polymerázová řetězová reakce se provedla v mikrozkumavce obsahující 50 μΜ KCI, 1,5 μΜ MgCl₂ a 10 μΜ Tris - HCI tlumivý roztok (pH 8,8) obsahující 0,1 % Triton X-100. Do zkumavky se přidalo 0,25 jednotek Taq DNA polymerázy (Nippon Gene K. K.), 200 μΜ každé ze čtyř bází (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 17,5 ng genomové DNA z každého druhu chmelu připraveného podle příkladu 13. Konečný objem reakce byl 10 μΐ.

Výše uvedená polymerázová řetězová reakce se provedla za následujících podmínek. Nejdříve, po udržení teploty 94 °C po dobu 1 minuty se provedl denaturační stupeň při 94 °C po dobu 30 sekund a stupeň teplotní hybridizace s očkem se provedl při 33 °C po dobu 1 minuty. Extenzní stupeň s DNA polymerázou se provedl uskutečněním 35 cyklů s termostabilní DNA polymerázou, každý při 72 °C po dobu 30 sekund a udržením teploty 72 °C po dobu 1 minuty.

Amplifikovaná DNA získaná výše uvedenou polymerázovou řetězovou reakcí byla oddělená elektroforézou při 150 V po dobu 30 minut v 100 μΜ Tris - kyselina boritá tlumivém roztoku (pH 8,0), .obsahujícím 2 μΜ EDTA za použití 5 % polyakrylamidového gelu. Jako signální značka velikosti se použil Markér 9 (Nippon Gene).

Po elektroforéze se gel ponořil do 0,5 mg/ml vodného roztoku ethidiumbromidu na 10 minut a ozáří se UV zářením při 254 nm v tmavé místnosti. Červené pásy, které byly detekované patřily sloučeninám DNA s ethidiumbromidem. Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 1.

Z obr. 1 je patrné, že velikost pásů na místě uvedeném šipkou je různá pro HT a SW. Pozice pásu uvedeného šipkou odpovídá RAPD značce.

-13 CZ 296930 B6

Příklad 15

RADP značka připravená v příkladu 14 se vyřízla elektroforetického gelu, vložila do dializační zkumavky, vystavila napětí a eluovala se z gelu.

K RADP značce získané způsobem popsaným v„ PCR Technology (ed., Henry A. Erlich, pub. Takara Shuzi Co. Ltd.) se přidala rozpoznávající sekvence pro restrikční enzymy Bg 111 nebo Pstl. Po subklonování s pUC plazmidem, za použití takových sekvencí rozpoznané restrikčními enzymy se stanovila sekvence deoxyribonukleotidů pomocí dideoxy metody a je uvedena na obr. 2. Na obrázku ukazuje symbol tečky (°) ty stejné deoxyribonukleotidy jako v horní řadě a čárky (-) ukazují chybějící báze. Podtržená část je sekvence deoxyribonukleotidů očka B 72 a sekvence deoxyribonukleotidů uzavřená rámečkem je sekvence deoxyribonukleotidů, která je popsána v příkladu 16.

Příklad 16

Určily se RAPD značky získané v příkladu 15, syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 27 v sekvenčním seznamu se získaly vztažením k sekvenci deoxyribonukleotidů B72WF2 uzavřené v rámečku, uvedené na obr. 2 a sekvence deoxyribonukleotidů popsaná v SEKV IČ: 28, získaná z komplementární sekvence B72WR2 (produkce Sawaddy Technology).

Tyto syntetické oligonukleotidy se použily jako souprava oček v následující PCR reakci. PCR se provedla v 10 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 50 μΜ MgCl₂ a 10 μΜ Tris - HCI tlumivý roztok (pH 8,8) obsahující 0,1 % Triton X-100 a 0,25 jednotek Taq DNA polymerázy (Nippon Gene K. K.), 200 μΜ ze všech čtyř bází (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 17,5 ng genomové DNA z každého druhu chmelu připraveného podle Příkladu 13 a 0,34 μΜ syntetických oligonukleotidů.

Výše uvedená polymerázová řetězová reakce se provedla za následujících podmínek. Nejdříve, po udržení teploty 94 °C po dobu 1 minuty se provedl denaturační stupeň zahřátím při 94 °C po dobu 1 minuty a stupeň teplotní hybridizace s očkem se provedl při 60 °C po dobu 1 minuty. Extenzní stupeň s DNA polymerázou se provedl 35 cykly s termostabilní DNA polymerázou, každý při 72 °C po dobu 30 sekund a udržením teploty 72 °C po dobu 30 sekund.

Amplifíkovaná DNA získaná výše uvedenou polymerázovou řetězovou se separovala elektroforézou při 150 V, po dobu 30 minut v 100 μΜ Tris - kyselina boritá tlumivém roztoku (pH 8,0), obsahujícím 2 μΜ EDTA za požití 5 % polyakrylamidového gelu. Jako signální značka velikosti se použil Markér 9 (Nippon Gene).

Po elektroforéze se gel ponořil do 0,5 mg/ml vodného roztoku ethidiumbromidu na 10 minut a ozářil se UV zářením při 254 nm v tmavé místnosti. Červené pásy, které byly detekované, patřily sloučeninám DNA s ethidiumbromidem. Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 3.

Stejný postup byl proveden s ostatními odrůdami a výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Druhy, které se použily: Fuggle (FU), Cascade (CC), Brewer s Gold (BG), Nothern Brewer (NB), Tettanger (TE), Saazer (SA), Hersbrucker spaet (HE), Perle (PE), Spatter select (SS) a Furano Ace (FA).

Jak je vidět z obrázku, pro BG, NB, TE, SW a FA byla zjištěna amplifikace 329 bp fragmentu (šipka), který obsahuje inzerční místo. U všech druhů byl zjištěn 299 bp fragment, který inzerční místo neobsahoval. Také byly zjištěny druhově-specifícké fragmenty 600 bp, 700 bp, 710 bp. Fragmenty jsou lehce identifikovatelné a byla zjištěna vysoká reprodukovatelnost.

- 14CZ 296930 B6

Příklad 17

Způsob byl identický se způsobem uvedeným v příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 15 a 16. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Z tabulky je vidět, že když se jako očko použily syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 15 a 16, byl detekovaný jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 500 bp. Z přítomnosti nebo z nepřítomnosti tohoto pásu bylo dvanáct chmelových odrůd zařazeno do dvou kategorií.

Příklad 18

Způsob byl identický v příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 17 a 18 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden při 62 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 17 a 18, detekoval se jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 260 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti tohoto pásu.

Příklad 19

Způsob byl identický v Příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 19 a 20 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden za 65 °C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 19 a 20, detekovaly se dva amplifíkované genomové pásy přibližně 500 bp a přibližně 550 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo dvanáct chmelových odrůd zařazeno do dvou kategorií.

Příklad 20

Způsob byl identický v příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 21 a 22. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 21 a 22, detekoval se jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 710 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo dvanáct chmelových odrůd zařazeno do dvou kategorií.

Příklad 21

Způsob byl identický v příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 23 a 24. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 22 a 23, detekoval se jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 330 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo dvanáct chmelových odrůd zařazeno do dvou kategorií.

Příklad 22

Způsob byl identický se způsobem uvedeným v příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 25 a 26 a po PCR bylo provedeno 20 cyklů PCR, které se

- 15CZ 296930 Β6 provedly při těch stejných podmínkách jako v předcházející PCR, použitím 1 μΐ reakěního roztoku jako templátu DNA. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 25 a 26, se detekovaly dva amplifikované genomové pásy přibližně 160 bp přibližně 200 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo dvanáct chmelových odrůd zařazeno do dvou kategorií.

Příklad 23

Způsob byl identický v příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 29 a 30 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden při 57 °C. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 29 a 30, se detekoval jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 350 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo dvanáct chmelových odrůd zařazeno do dvou kategorií.

Příklad 24

Způsob byl identický se způsobem uvedeným v příkladu 22, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy obsahující sekvence deoxyribonukleotidů popsané v SEKV. IČ: 30 a 31, PCR proběhlo dvakrát a reakční roztok se vystavil působení restrikčního enzymu NIain (Daiichi Pure Chemicals). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy obsahující sekvence deoxyribonukleotidů popsané v SEKV. IČ: 31 a 32, detekovaly se dva amplifikované genomové pásy přibližně 220 bp a přibližně 360 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů se do čtyř kategorií zařadilo dvanáct chmelových odrůd.

Příklad 25

Způsob byl identický příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 33 a 34 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden za 67 °C a reakční roztok se vystavil působení restrikčního enzymu Taq 1 (Boehringer Mannheim). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Jako očko se použily syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 33 a 34, detekovaly se dva amplifikované genomové pásy přibližně 220 bp a přibližně 270 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo dvanáct chmelových odrůd zařazeno do tří kategorií.

Příklad 26

Způsob byl identický se způsobem uvedeným v příkladu 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 35 a 36 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden za 58 °C. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Jako očko se použily syntetické oligonukleotidy SEKV. IC: 35 a 36, detekoval se jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 440 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů se do dvou kategorií zařadilo dvanáct chmelových odrůd.

-16CZ 296930 B6

Příklad 27

PCR a elektroforéza byly provedeny tou stejnou cestou jako v příkladu 14 s použitím 33 pmol Beckova očka (A25;5'-GGTCAGGCACCA-3'). Jako výsledek bylo pozorováno více jak 10 pásů přibližně 200 až 2000 bp a pás přibližně 500 bp, jehož přítomnost nebo nepřítomnost byla závislá na druhu, použil se jako RAPD značka. Výsledky stanovení sekvence deoxyribonukletidů této RAPD značky jsou uvedeny na obr. 4.

Syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV IČ: 19 a 20 byly podle sekvencí označeny jako A a B, uzavřeny v rámečku na obr. 4. Oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ 37 a 38 byly určeny podle sekvencí, označeny jako C a D a jsou podtrženy na obr. 4. Tyto oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 37 a 38 obsahovaly část RAPD značky. Oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 19 a 20 obsahovaly primární sekvenci na 5'konci.

Postup byl identický jako v příkladu 16 kromě toho, že se provedlo 35 tepelných hybridizačních cyklů při 65 °C s použitím SEKV. IČ: 19 a 20 jako očka a 30 tepelných hybridizačních cyklů při 60 °C s použitím SEKV. IČ: 37 a 38 jako očka. Při použití SEKV. IČ: 19 a 20 jako očka se pozorovaly pásy 500 bp a 550 bp, uvedené v tabulce 4 a když se použila jako očko SEKV. IČ: 37 a 38, pozoroval se pás 459 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo klasifikováno dvanáct chmelových odrůd do dvou kategorií.

Příklad 28

PCR a elektroforéza byly provedeny tou stejnou cestou jako v příkladu 14 s použitím 33 pmol Beckova očka (Cl6; 5'-CGCCCTGCAGTA-3'). Jako výsledek bylo pozorováno více jak 10 pásů přibližně 200 až 2000 bp a pás přibližně 500 bp, kterého přítomnost nebo nepřítomnost byla závislá na druhu, použil se jako RAPD značka. Výsledky stanovení sekvence deoxyribonukletidů této RAPD značky jsou uvedeny na obr. 5.

Syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV IČ: 15 a 16 byly podle sekvencí označeny jako A a B, uzavřeny v rámečku na obr. 4. Oligonukleotidy popsané v SEKV. IC: 39 a 40 byly založeny podle sekvencí, označeny jako C a D, podtrženy na obr. 5.

Sekvence IČ: 39 a 40 byly použity jako očko a bylo provedeno 30 tepelných hybridizačních cyklů při 60 °C. Amplifikovaný genomový pás 500 bp byl pozorovaný ve všech odrůdách, ale odrůdy nemohou být identifikovány. Na druhé straně, když následoval totožný postup s použitím 15 a 16, amplifikované genomové pásy jsou uvedeny v tabulce 4, z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo klasifikováno dvanáct chmelových odrůd do dvou kategorií.

Příklad 29

Ze všeobecného pohledu na tabulku 4, která shrnuje typy v příkladech 16 až 28 je patrné, že se dá rozlišit všech 12 odrůd chmelu.

Příklady, kde je vytvořený seznam fragmentů se vzaly jako doporučení k identifikaci odrůd a příklady, kde bylo provedeno zpracování restrikčními enzymy jsou uvedeny v závorkách ( ).

-17CZ 296930 B6

Tabulka 4

Sada oček SEVK. IČ.	(bp)	FU	cc	BG	NB	Druh TE	SA	HE	PE	ss	HT	sw	FA
15/16	500	0		0							0		0
17/18	260	0	0		0	0	0	0	0	0	0	0
19/20	500		0	0	0	0					0	0	0
19/20	550		0	0	0	0					0	0	0
21/22	710				0							0
23/24	330			0								0
25/26	200	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
25/26	160	0			0	0				0		0
27/28	710											0
27/28	700											0
27/28	600			0	0	0							0
27/28	329			0	0	0						0	0
27/28	299	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
29/30	350	0	0		0	0	0		0	0	0		0
31/32	360 (NI a III)	0	0				0		0	0	0	0
31/32	220 (NI a III)	0	0		0	0		0				0	0
33/34	270 (Taql)	0	0	0		0			0				0
35/36	400		0
37/38	459		0	0	0	0					0	0	0

Příklad 30

Shinsu Wase chmelový pelet (vyrobený Northen Hop Agrocultural Cooperative. Iwateken s licencí od Sapporo K. K.) se ve třecí misce rozetřel na prášek a z 20 mg prášku se extrahovalo přibližně 5 mg genomové DNA s použitím Soupravy pro DNA krve a buněčných kultur ío (QIAGEN lne.). Čistota získané DNA se stanovila tím stejným postupem jako je to v příkladu

29, za použití syntetických oligonukleotidů obsahujících sekvenci deoxyrobonukleotidů popsanou v SEKV. IČ: 15 až 40.

-18CZ 296930 B6

Objevilo se několik nespecifických pásů a žádaná značka se mohl snadno ověřit. Také se dosáhla vysoká reprodukovatelnost výsledků v opakovaných testech čistoty.

Průmyslová využitelnost

Podle identifikačního způsobu podle vynálezu se může provést přesná a jednoduchá identifikace odrůd chmelu, která není ovlivněna prostředím ani jinými podmínkami. Genetický identifikační způsob podle vynálezu může být také efektivně použit ke stanovení čistoty produktů, ve kteiých chmel je jako surovina. A tak, pomocí identifikace chmelových druhů může být genetický identifikační způsob podle vynálezu použit k udržení kvality produktů obsahující chmel na konstantní úrovni nebo ke zdokonalení kvality.

SEKVENČNÍ SEZNAM

SEKV. IČ: 1

Délka sekvence: 19

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CTATTCTGGCTAGTTCTGC

SEKV. IČ: 2

Délka sekvence: 19

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CTATTTTGGCCAGTTTTGT

SEKV. IČ: 3

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AGCTGAGCAAGCTTCTTTGG

SEKV. IČ: 4

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CCCTTTATATACACTGCCGA

- 19CZ 296930 B6

SEKV. IČ: 5

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA Popis sekvence:

TAGCATCGGTAATCTCTCGC

SEKV. IČ: 6

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AACATGCTGGGCAACTCCCA

SEKV. IČ: 7

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA Popis sekvence:

GGAGACATCATCGAATCAGA

SEKV. IČ: 8

Délka sekvence: 21

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA Popis sekvence:

AACCAGAGCAGCCATGTTAGT

SEKV. IČ: 10

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA Popis sekvence:

GCCAGCTGTACG

SEKV. IČ: 11

Délka sekvence: 12

-20CZ 296930 B6

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AGGTACGCCCGA

SEKV. IČ: 12

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CGCCCTGCAGTA

SEKV. IČ: 13

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CCATCCGCACGA

SEKV. IČ: 14

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GGTCAGGCACCA

SEKV. IČ: 15

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CGCCCTGCAGTACCTTCCTGTAAG

SEKV. IČ: 16

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

-21 CZ 296930 B6

Popis sekvence:

CGCCCTGCAGTAGAGCACTTCTAT

SEKV. IČ: 17

Délka sekvence: 22

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CAATCGCCGTCTTGGTAGCGTA

SEKV. IČ: 18

Délka sekvence: 25

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CAATCGCCGTTGAGAAAGTTAAGTA

SEKV. IČ: 19

Délka sekvence: 25

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GGTCAGGCACCATGTACTAGCTGGC

SEKV. IČ: 20

Délka sekvence: 25

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GGTCAGGCACCAAGGCCACCATCTG

SEKV. IČ: 21

Délka sekvence: 26

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCCAGCTGTACGATGCCATGACCTTA

-22CZ 296930 B6

SEKV. IČ: 22

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCCAGCTGTACGCCCCGGAAGGAA

SEKV. IČ: 23

Délka sekvence: 23

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

ACTCACCACGCAGAAACCCAGGC

SEKV. IČ: 24

Délka sekvence: 23

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CCTCGACAAGTGAGATGTTGACC

SEKV. IČ: 25

Délka sekvence: 23

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCCACATTATCAAGGCAATACAC

SEKV. IČ: 26

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GGCATGACTCATGCCAGCTG

SEKV. IČ: 27

Délka sekvence: 22

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

-23 CZ 296930 B6

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GTCCCTCCTAGACACCTACATA

SEKV. IČ: 28

Délka sekvence: 21

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCTCCTGACAGCAAGGTAAGC

SEKV. IČ: 29

Délka sekvence: 22

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GAATACTGAGATTTTTATGAGG

SEKV. IČ: 30

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CAGGTCATGACTCATTGCTAA

SEKV. IČ: 31

Délka sekvence: 28

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AAGGTGTTGCGGCCCTTAACAACTTCTT

SEKV. IČ: 32

Délka sekvence: 28

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AAGGTGTTGCGGAGAGTGTTCTAGAACA

-24CZ 296930 B6

SEKV. IČ: 33

Délka sekvence: 23

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

ío ATCGAGCGAACGTATCAGCTGCG

SEKV. IČ: 34

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CCTTTCCGACGTCACTAATCGTGG

SEKV. IČ: 35

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

TTAAATGACATGATCACCTCTCCC

SEKV. IČ: 36

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

TAACACAGAGGTACCTCACTGTCT

SEKV. IČ: 37

Délka sekvence: 21

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CTCCCACTGCACACCTATTTC

SEKV. IČ: 38

Délka sekvence: 21

-25CZ 296930 B6

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineami

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CACCATCTGAAGGAGGTCAAG

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (5)

1. Způsob identifikace chmelové odrůdy pomocí náhodné polymorfické DNA (RAPD), vyznačující se tím, že

a) se připraví chmelová odrůda a první primer/primery k amplifikaci oblasti DNA, která je charakterizována polymorfizmem chmelové odrůdy, přičemž první primer obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO:8 a SEQ ID NO: 10 až SEQ ID NO: 14 nebo první primer obsahuje nukleotidovou sekvenci obsahující komplementární sekvenci výše uvedené, vybrané nukleotidové sekvence;

b) načež se DNA z odrůdy izoluje;

c) načež se provede polymerázová řetězová reakce za použití DNA a prvního primeru/primerů, čímž vznikne DNA molekula;

d) načež se stanoví sekvence DNA molekuly;

e) načež se sestaví druhé primery obsahující sekvenci obsaženou v DNA molekule, přičemž druhý primer obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 15 až SEQ ID NO: 38, nebo druhý primer obsahuje nukleotidovou sekvenci obsahující komplementární sekvenci výše uvedené, vybrané nukleotidové sekvence;

f) načež se provede polymerázová řetězová reakce za použití DNA molekuly a druhých příměrů;

g) načež se stanoví, zda polymerázovou řetězovou reakcí vznikla nebo nevznikla DNA molekula/molekuly; a

h) načež se provede identifikace odrůdy, pokud DNA molekula/molekuly vznikla.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se připraví pluralita prvních primerů a polymerázová řetězová reakce se provede za použití plurality těchto prvních primerů.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že primerem je syntetický oligonukleotid.

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že druhé primery obsahují nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny sestávající z kombinací SEQ ID Nos: 15 a 16, SEQ ID Nos:17 a 18, SEQ ID Nos: 19 a 20, SEQ ID Nos:20 a 21, SEQ ID Nos:21 a 22, SEQ ID Nos:23 a 24, SEQ ID Nos:25 a 26, SEQ ID Nos:27 a 28, SEQ ID Nos:29 a 30, SEQ ID Nos:31 a 32, SEQ ID Nos:33 a 34, SEQ ID Nos:35 a 36, SEQ ID Nos:37 a 38.

5 výkresů

-26CZ 296930 B6

-27CZ 296930 B6

5' B72

Hallertauer Tradition- GGCGATTCTGCAAGACACACAACGCAGACAAGAAATTTGAATAACA

Shinshu Tase ....................................C........B72VF2___________

TAATCGAGAGGGGnTCCTCTCGA17IIirrcrrT(,7UimWXAAnGCTACAATTTCCTACTGT

CCGCAAATATTGTAGGGnACTAA-TGGATTTAKGTrTÁCATCTGTTGCATTCTTTTATGTAAATGATG

AATATATAGGAAATATCTAAACGTGTAAAAAA

ATGATGAGATTCCArATGiUTGAGAGTCrTTATAAGCTAMLATn.UTGGCATGCATTCrATCCCÁAGG .......... C..........................................T.....

AAACAAAATAGGTAATACCAGAAl lUATnTlUCGAACAGCTrrCCiGr

CAGACACGTCCTCArCGGTGCCACCACTTCCAGTTTCACTGCTTGGTTCCACAGGTITCTCAAGTACGTr

CTTCCGGAACTTCTCTAGTCITGCTAGAACCrGAAGGAAÁCGHAACCAGCAAAGITGGTAAnGGAAAC

.........................................λ............................

3' rTAATTAGCAAATAATGCTAATGTGAAGAGCAATACATCAAATTGTTnArAIGCAGAAIGGCC

B72