CN118006823A - 与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用 - Google Patents
与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118006823A CN118006823A CN202410106476.7A CN202410106476A CN118006823A CN 118006823 A CN118006823 A CN 118006823A CN 202410106476 A CN202410106476 A CN 202410106476A CN 118006823 A CN118006823 A CN 118006823A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oxalic acid
- spinach
- primer
- acid content
- kasp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 267
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 88
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 title claims abstract description 80
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 title claims abstract description 75
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 title abstract description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 abstract 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 abstract 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 abstract 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 abstract 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 abstract 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 abstract 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- 102100038837 2-Hydroxyacid oxidase 1 Human genes 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 108010062584 glycollate oxidase Proteins 0.000 description 2
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710126783 Acetyl-hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241000219317 Amaranthaceae Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000871189 Chenopodiaceae Species 0.000 description 1
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 208000000913 Kidney Calculi Diseases 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000006486 human diet Nutrition 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002366 mineral element Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 108010032737 oxalyl CoA decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- QVXMZFTWJVBUHP-IBOSZNHHSA-N oxalyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QVXMZFTWJVBUHP-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子遗传学领域，尤其涉及与菠菜草酸含量相关的KASP分子标记开发及其应用。利用全基因组关联分析(GWAS)发掘与菠菜草酸含量相关联的SNPs，并将其开发为KASP分子标记，辅助育种。GWAS已被广泛用于玉米、水稻和菜豆等其他作物的数量性状相关基因的鉴定中，而且在菠菜中已经利用GWAS鉴定了许多与抗病性、性别、株型和耐抽薹性等性状有关的标记或基因。利用本发明提供的三条KASP引物可以在苗期对菠菜草酸含量特性进行检测，其分析通量高，准确率高。本发明提供的共显性KASP标记有利于筛选低草酸含量的菠菜品种，缩短了低草酸含量菠菜品种的选育时间。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学技术领域，尤其涉及与菠菜草酸含量相关的KASP分子标记开发及其应用。
背景技术
菠菜(Spinacia oleracea L.,2n＝2x＝12))属苋科藜亚科菠菜属植物，原产伊朗，是主要以绿叶为产品器官的一、二年生草本植物。因其适应性广、耐储藏、供应期长、栽培方式多样，营养比较全面，在世界各地普遍种植。
菠菜富含营养物质和促进健康的化合物，如维生素、矿质元素等，被认为是人类饮食中最健康的蔬菜之一。但菠菜中也含有一些负营养物质，如草酸。草酸在植物中主要分为两种形式，可溶性草酸和难溶性草酸，其中可溶性草酸是菠菜中草酸盐的主要存在形式。当被消化道吸收时，草酸易与钙离子、镁离子等金属离子发生螯合，形成不易溶解的草酸盐，从而通过减少矿物质的吸收和促进肾结石的形成对人体健康造成负面影响。研究发现不同菠菜材料中的草酸含量变异丰富，草酸调控网络较为复杂，可能是由多个基因控制的。乙醛酸/乙醇酸、抗坏血酸和草酰乙酸被认为是多种植物中草酸合成的前体，乙醛酸/乙醇酸经过乙醇酸氧化酶(GLO)催化，氧化为草酸；草酰乙酸经草酸乙酸乙酰水解酶(OXAC)催化形成草酸；抗坏血酸通过C2/C3裂解形成草酸。草酸还通过三种途径被降解：氧化、脱羧和乙酰化，草酸氧化酶将草酸氧化为H2O2和CO2；草酸脱羧酶催化草酸降解为甲酸和CO2；草酰辅酶A合酶、草酰辅酶A脱羧酶、甲酰辅酶A水解酶和甲酸脱氢酶共同作用使草酸降解为CO2。
现有研究尚未开发与菠菜草酸含量相关的分子标记，不利于菠菜低草酸品种的选育。
发明内容
本发明提供与菠菜草酸含量相关的KASP分子标记开发及其应用，用于选育理想的低草酸含量菠菜品种。
本发明提供一种与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，染色体SOVchr1第50807332位的碱基为G或T；
优选的，碱基为G的菠菜植株为低草酸含量植株；
和/或，碱基为T的菠菜植株为高草酸含量植株。本发明标记KMOX06位于菠菜1号染色体上，物理位置为50807332bp，SNP位点处碱基为G/T，碱基为G的菠菜植株为低草酸含量植株，碱基为T的菠菜植株为高草酸含量植株。本发明提供的与菠菜草酸含量相关的KASP分子标记KMOX06，可以用于选育低草酸含量的优质菠菜品种，缩短育种年限。
根据所述的与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，该SNP分子标记的位置是根据菠菜全基因组序列而确定的，网址为http://spinachbase.org/ftp/genome/Monoe- Viroflay/。
本发明还提供一种引物组合，用于扩增所述分子标记；
优选的，包括第一引物、第二引物和第三引物；
所述第一引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(AACCAACGGGGGAAGATATTGC)所示；
所述第二引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO.2(GAACCAACGGGGGAAGATATTGA)所示；
所述第三引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种KASP引物组合，包括第一引物、第二引物和第三引物；
所述第一引物为中第一引物的5’端加上A荧光对应的标签序列A；
所述第二引物为第二引物的5’端加上B荧光对应的标签序列B；
所述A荧光与B荧光不同；
优选的，所述第一引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第二引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，本发明所述的KASP标记共包含3条序列，其中两条为正向引物，一条为通用的反向引物，如下显示：
(1)正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACCAACGGGGGAAGATATTGC-3’(SEQ IDNO.4)；其中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为通用标签A；
(2)正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACCAACGGGGGAAGATATTGA-3’(SEQID NO.5)；其中GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为通用标签B；
(3)反向引物：5’-CCTTGTTAAGGCGTAGCCTAAACAG-3’(SEQ ID NO.3)。
本发明还提供含有所述引物组合的产品，所述产品为检测试剂或试剂盒。
本发明还提供一种鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，以待检测的菠菜DNA为模版，利用所述引物组合，根据引物扩增结果判断菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型；
优选的，根据荧光检测结果判断。
根据所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测的菠菜DNA；
(2)稀释步骤(1)中的DNA到20ng/μL，并向其中加入特异的KASP Primer mix；
(3)加入通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；PCR产物在低于40℃下进行荧光检测分析；仅检测到通用标签A荧光，为GG基因型，对应的是菠菜中草酸含量较低；仅检测到通用标签B荧光，为TT基因型，对应的是菠菜中草酸含量较高；如果同时检测到通用标签A和B荧光，为GT基因型，则对应的是菠菜中草酸含量处于中间水平。
上述特异的KASP Primer mix含所述的引物组合；
优选的，上述通用的KASP Master mix包含如下组份：通用的TRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2。
优选的，所述KASP Primer mix含有3条特异引物：分别带有通用标签A和B的正向引物1和2，以及一条反向引物。
优选的，所述KASP Master mix包含通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，Klear Taq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2等组分，已预置于优化的缓冲液中。其中荧光报告基团A为FAM，荧光报告基团B为HEX，所述KASP Master mix是英国LGC公司产品。产品目录号为KBS-1016-002。
根据所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，每10μl反应体系包括4.86模板DNA、5μlKASP Master mix和0.14μlKASP Primer mix；
优选的，该反应体系适用于96孔板或384孔板。
优选的，所述反应体系为：
根据所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，PCR反应条件包括如下步骤：
优选的，待荧光检测分型后，若分型结果不理想，可再进行如下PCR反应：
第二次PCR反应结束后可再次进行荧光检测分析。
本发明还提供所述引物组合或所述产品在以下任一项或几项中的应用：
(1)在鉴定或者辅助鉴定菠菜草酸含量中的应用；
(2)在菠菜草酸含量的早期预测中的应用；
(3)在菠菜分子育种中的应用；
(4)在菠菜种质改良中的应用；
(5)在筛选菠菜草酸含量中的应用；
(6)在菠菜草酸含量基因分型中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供与菠菜草酸含量相关的KASP分子标记KMOX06辅助育种中的应用。
本发明提供的KASP基因分型通量大且操作简单，只需将特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix加入到含有DNA样本的PCR微孔反应板中，进行PCR扩增。最终结果采用荧光检测仪进行分析即可。
本发明可以鉴定苗期菠菜的草酸含量，鉴定结果准确，且本实验所用到的材料来源广泛，适用范围广，可以用于鉴定多种菠菜品种草酸含量的高低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。
图1本发明实施例1中草酸含量相关联的SNP的定位结果；其中，左侧是p-value值-log10(P)，右侧是SNP密度，底部为染色体名称。
图2本发明实施例2中标记KMOX06检测62份菠菜材料的结果
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。所有菠菜品种均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菠菜课题提供。
实施例1菠菜草酸含量相关的KASP分子标记的开发
1、菠菜草酸含量的测定
使用62份菠菜自交系，种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验基地，播种后50天，每份材料选取长势均匀的10～20株，采用离子色谱法测定每份材料的草酸含量。草酸含量在材料中呈正态分布。
2、DNA提取与重测序
播种25天后收集幼叶，用于DNA提取，使用1.0％琼脂糖凝胶电泳和ND-1000分光光度计对DNA质量进行检验，之后交于贝瑞基因公司使用Illumina平台对62份菠菜材料进行重测序，获得3,356,182个高质量SNPs用于全基因组关联分析(GWAS)。
3、关联SNP的检测以及KASP标记的开发
根据重测序数据和62份菠菜材料的草酸含量数据，用rMVP软件的GLM模型，进行关联SNP检测，-log10(P)采用Bonferroni校正，将-log10(P)＝6.52作为阈值来确定来确定显著关联的SNPs。最终草酸含量相关的主效SNP(-log10(P)＝7.34)位于SOVchr1的50807332bp(图1)，解释了2.70％的表型变异(表2)，将其设计为KASP引物。该引物包含正向引物1、正向引物2和反向引物。两条正向引物末端为等位变异碱基G/T，反向引物的序列选择要保证扩增片段在60-120bp。正向引物的5’端连接有荧光标签序列，其中正向引物1的5’端连接为FAM荧光标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，正向引物2的5’端连接为HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
表1 KMOX06标记的SNP位点信息
| 标记 | 染色体 | SNP物理位置 | 等位基因 |
| KMOX06 | SOVchr1 | 50807332 | [G/T] |
表1中位置信息是根据Cai等(2021)发表的菠菜全基因组序列而确定的。(http://spinachbase.org/ftp/genome/Monoe-Viroflay/)。
引物序列如下：
上述引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成获得。
表2菠菜草酸含量相关性状SNP定位结果
| 性状 | Peak SNP | 位置(bp) | -log10(P) | 变异解释率(％) |
| 草酸含量 | SOVchr1_50807332 | 50807332 | 7.34 | 2.70 |
实施例2 KMOX06标记的有效性验证
具体方法如下：
1、材料表型测定及基因组DNA提取
使用离子色谱法测定62份菠菜自交系的草酸含量。同时，采用CTAB法提取全基因组DNA。
2、稀释DNA
本实验采用的DNA浓度为20ng/μl。
3、KASP Primer mix制备
各取正向引物12μl(100μM)，反向引物30μl(100μM)，用无菌超纯水补充至100μl。
4、PCR扩增反应体系如下：
实验同时设置反应体系中不添加模版DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个空白对照。
5、PCR反应条件如下：
待荧光检测分型后，若分型结果不理想，可再进行如下PCR反应：
第二次PCR反应结束后可再次进行荧光检测分析。
6、PCR扩增产物的荧光扫描
利用Applied Biosystems公司生产的QuantStudio 6 Flex机器对PCR扩增产物进行扫描，基于两荧光(FAM荧光和HEX荧光)的激发波长和发射波长不同，从而实现对扩增产物的分型。聚合在纵轴的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，即为GG；聚合在中间的样本的基因型为两种等位基因，即GT；聚合在横轴的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，即为TT；左下角显示的黑色样本为NTC(图2)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，其特征在于，染色体SOVchr1第50807332位的碱基为G或T；
优选的，碱基为G的菠菜植株为低草酸含量植株；
和/或，碱基为T的菠菜植株为高草酸含量植株。
2.根据权利要求1所述的与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，其特征在于，该SNP分子标记的位置是根据菠菜全基因组序列而确定的，网址为http://spinachbase.org/ftp/genome/Monoe-Viroflay/。
3.一种引物组合，其特征在于，用于扩增权利要求1或2所述分子标记；
优选的，包括第一引物、第二引物和第三引物；
所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种KASP引物组合，其特征在于，包括第一引物、第二引物和第三引物；
所述第一引物为权利要求3中第一引物的5’端加上A荧光对应的标签序列A；
所述第二引物为权利要求3中第二引物的5’端加上B荧光对应的标签序列B；
所述第三引物为权利要求3中第三引物；
所述A荧光与B荧光不同；
优选的，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.含有权利要求3或4所述引物组合的产品，其特征在于，所述产品为检测试剂或试剂盒。
6.一种鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，其特征在于，以待检测的菠菜DNA为模版，利用权利要求3或4所述引物组合，根据引物扩增结果判断菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型；
优选的，根据荧光检测结果判断；
优选的，仅检测到通用标签A荧光，为GG基因型，对应的是菠菜中草酸含量较低；仅检测到通用标签B荧光，为TT基因型，对应的是菠菜中草酸含量较高；如果同时检测到通用标签A和B荧光，为GT基因型，则对应的是菠菜中草酸含量处于中间水平。
7.根据权利要求6所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测的菠菜DNA；
(2)稀释步骤(1)中的DNA到20ng/μL，并向其中加入特异的KASP Primer mix；
(3)加入通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；PCR产物在低于40℃下进行荧光检测分析；
上述特异的KASP Primer mix含权利要求4所述的引物组合；
优选的，上述通用的KASP Master mix包含如下组份：通用的TRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2。
8.根据权利要求6或7所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，其特征在于，每10μl反应体系包括4.86模板DNA、5μlKASP Master mix和0.14μlKASP Primer mix；
优选的，该反应体系适用于96孔板或384孔板。
9.根据权利要求6或7所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，其特征在于，PCR反应条件包括如下步骤：
优选的，待荧光检测分型后，若分型结果不理想，可再进行如下PCR反应：
第二次PCR反应结束后可再次进行荧光检测分析。
10.权利要求3或4所述引物组合或权利要求5所述产品在以下任一项或几项中的应用：
(1)在鉴定或者辅助鉴定菠菜草酸含量中的应用；
(2)在菠菜草酸含量的早期预测中的应用；
(3)在菠菜分子育种中的应用；
(4)在菠菜种质改良中的应用；
(5)在筛选菠菜草酸含量中的应用；
(6)在菠菜草酸含量基因分型中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410106476.7A CN118006823A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410106476.7A CN118006823A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118006823A true CN118006823A (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90958905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410106476.7A Pending CN118006823A (zh) | 2024-01-25 | 2024-01-25 | 与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118006823A (zh) |
-
2024
- 2024-01-25 CN CN202410106476.7A patent/CN118006823A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110607386B (zh) | 一套适用于番茄dna指纹库构建的kasp引物组合及其应用 | |
| CN110438252B (zh) | 与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| CN113502335A (zh) | 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用 | |
| KR102442563B1 (ko) | 밀의 출수기 예측용 바이오마커 | |
| US20060035227A1 (en) | Methods for distinguishing rice varities | |
| CN110894542A (zh) | 一种鉴别水稻gs5基因和glw7基因类型的引物及其应用 | |
| KR101979218B1 (ko) | 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물 | |
| CN106947826B (zh) | 一种检测黄牛serpina3基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN116377082B (zh) | 绵羊lcorl基因单核苷酸多态性标记在生长性状选择中的应用 | |
| CN110453003B (zh) | 与菠菜叶型性状主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| CN116676412A (zh) | 小麦叶绿素含量相关基因TaCAO-3B分子标记及应用 | |
| CN114438225B (zh) | 一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记及应用 | |
| CN116121445A (zh) | 一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的kasp分子标记及应用 | |
| CN116287387A (zh) | 一种辣椒PMMoV抗性基因L3紧密连锁的SNP位点、KASP分子标记及应用 | |
| KR101955074B1 (ko) | 무 판별용 snp 마커 | |
| KR101823374B1 (ko) | 축진 듀록 식별용 snp 마커 및 이를 이용한 축진 듀록 식별 방법 | |
| CN118006823A (zh) | 与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用 | |
| CN114606337A (zh) | 水稻粒型基因glw7的kasp标记开发及其应用 | |
| CN114480721A (zh) | 一种鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的方法及其专用snp引物组合 | |
| CN117821654A (zh) | 与菠菜Fe元素含量相关的KASP分子标记开发及其应用 | |
| CN118166148B (zh) | 一种与南瓜果实大小主效qtl紧密连锁的snp位点、分子标记、引物对及其应用 | |
| CN115896320B (zh) | 与菠菜抗霜霉病基因rpf2紧密连锁的snp分子标记及其应用 | |
| KR102625086B1 (ko) | 밀의 성숙기 판별용 바이오마커 | |
| CN117737296B (zh) | 用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的snp标记及应用 | |
| CN118109623B (zh) | 小麦叶绿素含量相关基因TaGGR-6A分子标记和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |