CN1249253C - 基于PCR检测和定量Tapesia yallundae和Tapesia acuformis - Google Patents

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Abstract

本发明提供在检测Tapesia yallundae(syn.Pseudocercosporellaherpotrichoides W型)和Tapesia acuformis(syn.Pseudocercosporellaherpotrichoides R型)的TaqManTM定量PCR测定中使用的引物和探针。本发明还提供在检测小麦DNA的TaqManTM定量PCR对照测定中使用的引物和探针。

Description

基于PCR检测和定量 Tapesia yallundae和Tapesia acuformis
技术领域
本发明涉及引物和探针在用于检测Tapesia yallundae(syn.Pseudocercosporella herpotrichoides W型)和Tapesia acuformis(syn.Pseudocercosporella herpotrichoides R型)的TaqManTM定量PCR测定中的应用。应用这些测定可以在植物群体中对特定真菌病原体进行检测和定量。本发明还涉及引物和探针在检测宿主小麦DNA用作内源性反应对照的TaqManTM定量PCR测定中的应用。
背景技术
每年植物疾病都造成可观的作物损失，这不仅给农民带来经济损失，而且在世界的许多地方导致当地人群的营养供应短缺。杀真菌剂的广泛使用为对抗植物病原体攻击提供了相当大的保证。然而，尽管支出价值十亿美元的杀真菌剂，1981年全球的作物损失仍总计达到作物价值的约10％(James，1981；Seed Sci.& Technol.9：679-685)。
疾病破坏作用的严重性取决于病原体的侵袭性和宿主的反应。大多数植物育种项目的一个目的是增强宿主植物的抗病性。典型地，不同种类(race)的病原体有差别地与同一作物物种的不同品种相互作用，而且许多来源的宿主抗性仅对特定的病原体种类产生防护。而且，一些病原体种类会表现出疾病症状的早期征兆，而对作物几乎不造成破坏。Jones和Clifford(1993；谷物疾病(Cereal Diseases)，John Wiely)报道，随着宿主栽培品种中抗性的引入可以预期在病原体群体中会出现病原体的毒性形式，因此有必要对病原体群体进行监测。此外，关于抗某些杀真菌剂的真菌菌株的进化，有几个经文献证明的案例。早在1981年，Fletcher和Wolfe(1981；Proc.1981 Brit.Crop Prot.Conf.)就认为，来自春大麦的24％白粉菌群体和来自冬大麦的53％白粉菌群体在对杀真菌剂三唑醇的反应方面表现出相当大的差异，而且这些群体在各品种间的分布是不同的，最易感的品种也将给出最高发生率的较不敏感真菌类型。已有文献证明，小麦霉(也对三唑醇)、葡萄孢(Botrytis)(对苯菌灵)、核腔菌(Pyrenophora)(对有机汞)、Pseudocercosporella(对MBC型杀真菌剂)等真菌对杀真菌剂敏感性方面存在类似的差异，而Mycosphaerella fijiensis对三唑的敏感性差异亦略有提及(Jones和Clifford；谷物疾病，John Wiley，1983)。
谷物在全世界范围内种植，是世界粮食生产的一个主要部分。尽管许多病原体会造成产量的损失，但在欧洲和北美的主要谷物种植区域，引起坏死的病原体壳针孢(Septoria)和Pseudocercosporella尤其重要(Jones和Clifford；谷物疾病，John Wiley，1983)。特别是，由这些真菌的不同隔离群(isolate)和类型造成的差异症状使得难于准确地预先确定可能的疾病损失。因此，对于大田病理学家，获得可以快速和准确鉴定特定病原体的改良诊断技术将是相当有用的。
小麦的眼斑病(eyespot)是由病原体Tapesia acuformis和Tapesiayallundae引起的。这些病原体以前一直被认为是同一物种Pseudocercosporella herpotrichoides(Fron)Deighton的变种。小麦、黑麦、燕麦和其它禾本科植物均易感染此眼斑病，该疾病在冷湿气候下发生并盛行于欧洲、北美及南美、非洲和澳大利亚。小麦是最易受到感染的谷物，但在其它谷物上已鉴定到同样具有毒性的隔离群。例如，从黑麦中还分离出该真菌的R菌株(Tapesia acuformis)，该菌株比分离自小麦的W菌株(Tapesia yallundae)在小麦上生长慢。眼斑病局限在植物的茎杆基部，能够彻底杀死分蘖或植物；然而，更通常地它引起倒伏和/或导致种子大小和数量的降低。与眼斑病有关的产量损失量甚至比与小麦壳针孢(Septoria tritici)和颖枯壳针孢(Septoria nodorum)有关的产量损失还大。对眼斑病的典型控制措施包括生长调节剂处理以增强节间、和杀真菌剂处理。然而，栽培品种对不同真菌菌株的差异敏感性使得难于预测杀真菌剂处理的效力。
鉴于上述情况，确实需要开发允许在感染过程的早期鉴定病原体真菌特定种类的技术。在作物群从出现明显疾病症状之前通过鉴别特定种类的病原体，农学家可以评价在鉴定出该病原体的作物品种中该病原体进一步发展的可能结果，并可以在认为必需使用杀真菌剂时选择适合的杀真菌剂。
TaqManTM化学和ABI7700(Perkin Elmer，Applied BiosystemsDivision，Foster City，CA)为精确、可重复地定量测定DNA和RNA提供了手段。TaqManTM化学的基础是聚合酶链式反应(PCR)。在常规PCR测定中，设计与目的DNA序列的5’和3’末端互补的寡核苷酸引物。在热循环过程中，首先热变性DNA。然后样品被带到退火和延伸温度，在这些温度下引物与其特异互补序列结合并通过核苷三磷酸的加入在Taq聚合酶的作用下延伸。经过重复热循环，模板DNA的量得到扩增。
在TaqManTM化学中，设计与PCR扩增子的引物之间序列区域互补的寡核苷酸探针。该探针在其5’末端含有荧光报道染料(fluorescentreporter dye)，在其3’末端含有淬灭染料(quencher dye)。当探针完好时，其荧光释放由于荧光共振能量转移(FRET)现象而被淬灭。在热循环过程中，探针与一个引物下游的靶DNA杂交。TaqManTM化学依赖Taq聚合酶的5’外切核酸酶活性从探针上切下荧光染料。随着PCR产物的积累，荧光信号增强。通过测定该信号，即可对扩增产物定量。该方法使得可以通过靶向病原体DNA对疾病压力进行定量。在区分病原体的测定中，联合PCR引物，探针提供了另一水平的特异性。
发明的公开
因此本发明提供：
选自SEQ ID NOs：3-6、8-23、25-26、28、30、42和43的寡核苷酸引物，特别地，其中所述引物选自SEQ ID NOs：3-6、8-23、25-26、28和30；
·寡核苷酸引物对，其中至少一个所述引物是上文提及的寡核苷酸引物；
·上文提及的寡核苷酸引物对，其中所述引物对由SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18或由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8组成；
·上文提及的寡核苷酸引物，其中所述引物选自SEQ ID NO：42和43；
·寡核苷酸引物对，其中至少一个所述引物是由SEQ ID NO：42和43组成的寡核苷酸引物；
·寡核苷酸引物对，其中所述引物对由SEQ ID NO：42和43组成。
本发明还提供
·检测真菌病原体，尤其是Tapesia yallundae和Tapesiaacuformis，的方法，包括：
(a)从病原体感染的植物叶中分离DNA；
(b)采用至少一个根据本发明的引物，对所述DNA进行聚合酶链式反应扩增；和
(c)通过显现所述聚合酶链式反应扩增的产物，检测所述真菌病原体。
·检测真菌病原体，尤其是Tapesia yallundae和Tapesiaacuformis，的方法，包括：
(a)从感染所述真菌病原体的植物组织中分离DNA；
(b)采用所述DNA为模板在聚合酶链式反应中以根据权利要求3的引物对扩增所述真菌病原体的部分内部转录间隔区(InternalTranscribed Spacer)序列；和
(c)通过显现该扩增的部分内部转录间隔区序列，检测所述真菌病原体。
本发明还提供用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其包含上文提及的引物。
本发明还提供检测小麦DNA的方法，包括：
(a)从感染病原体的小麦组织中分离DNA；
(b)采用根据本发明的引物对对所述DNA进行聚合酶链式反应扩增；和
(c)通过显现所述聚合酶链式反应扩增的产物，检测所述小麦DNA。
而且，本发明提供在真菌内部转录间隔区序列的基于扩增的检测中使用的寡核苷酸探针，其中所述探针含有：
(a)与选自下组的序列中的至少10个连续核苷酸互补的核苷酸序列：
Tapesia yallundae的ITS1、Tapesia yallundae的ITS2、Tapesiaacuformis的ITS1和Tapesia acuformis的ITS2；
(b)位于所述核苷酸序列5’末端的荧光报道染料；和
(c)位于所述核苷酸序列3’末端的淬灭染料。
本发明还提供上文提及的寡核苷酸探针，其中所述核苷酸序列与选自下组的序列中的至少10个连续核苷酸互补：SEQ ID NO：37的第31-263位核苷酸、SEQ ID NO：37的第420-570位核苷酸、SEQ ID NO：38的第31-262位核苷酸、和SEQ ID NO：38的第419-568位核苷酸，但其中所述核苷酸序列特别选自：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29。
本发明还提供在小麦DNA的基于扩增的检测中使用的寡核苷酸探针，其中所述探针含有：
(a)与SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：44中的至少10个连续核苷酸互补的核苷酸序列；
(b)位于所述核苷酸序列5’末端的荧光报道染料；和
(c)位于所述核苷酸序列3’末端的淬灭染料。
本发明还提供用于定量真菌DNA的寡核苷酸引物对/探针组，其中所述引物对由根据本发明的引物对组成，而探针是SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：44。
为了确保清晰一致地理解本说明书和权利要求，提供以下定义：
基因：是指编码序列和相关的调节序列，其中编码序列可被转录成RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA。调节序列的例子是启动子序列、5’和3’非翻译序列和终止序列。可以存在的其它元件有例如内含子。
一致性：序列一致性百分数采用基于动态规划算法(dvnamicprogramming algorithms)的计算机程序来确定。在本发明范围中优选的计算机程序包括BLAST(基础局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool)搜索程序，该程序被设计用于探查所有可获得的序列数据库，而不论查询的是蛋白质还是DNA。此搜索工具的BLAST2.0版本(Gapped BLAST)已可在互联网(目前是http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上公开获得。它采用寻求局部而非整体比对的启发式算法(heuristic algorithm)，因此，能够检测仅共有分隔区域的序列之间的关系。BLAST搜索中给出的分数有十分明确的统计学解释。所述程序优选采用设定为默认值的任选参数运行。
植物：是指任何植物，尤其是种子植物。
植物材料：是指植物的叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、合子、胚胎、种子、插条、细胞或组织培养物、或任何其它部分或产物。
本发明涉及鉴定和定量不同植物病原性真菌物种的方法。本发明提供在TaqManTM定量PCR测定中有用的引物和探针DNA序列。这些DNA序列在本发明方法中是有用的，因为它们可以用于聚合酶链式反应(PCR)和基于TaqManTM的诊断测定中。在DNA模板由特定真菌病原体提供的PCR反应中，这些引物产生唯一的片段。与采用TaqManTM探针进行的杂交相结合，它们可以用于在疾病症状出现以前检测和定量宿主植物材料中的特定病原体。
在一个优选实施方案中，本发明提供用于检测Tapesia yallundae(syn.Pseudocercosporella Herpotrichoides W型)和Tapesiaacuformis(syn.Pseudocercosporella Herpotrichoides R型)的ITS衍生的诊断引物和TaqManTM探针。
本发明为评价特定作物品种-病原体株关系中的潜在破坏性提供了可能性，并使得可以明智地利用多样的可获得的杀真菌剂武器库。而且，本发明可以用于提供有关特定病原体种类在大范围地理区域中的发展和散布的详细信息。本发明提供用于在指定作物上定量疾病压力的方法。
本发明还提供用于实施本发明的试剂盒。该试剂盒对于鉴定和定量真菌病原体Tapesia yallundae和Tapesia acuformis尤其有用。
序列表中序列的简述
SEQ ID NOs：1-34是在真菌病原体Tapesia yallundae和Tapesiaacuformis的基于PCR的检测中有用的如下寡核苷酸探针和引物：
  序列标识   寡聚物名称   靶标   寡聚物序列(5’-＞3’)
  SEQ IDNO：1   ITS1   真菌18S rDNA   tccgtaggtgaacctgcgg
  SEQ IDNO：2   ITS4   真菌25S rDNA   tcctccgcttattgatatgc
  SEQ IDNO：3   J103W   Tapesia yallundae(W)   ggctaccctacttggtag
  SEQ IDNO：4   J104W   Tapesia yallundae(W)   cctgggggctaccctacttg
  SEQ IDNO：5   J105W   Tapesia yallundae(W)   gggggctaccctacttggtag
  SEQ IDNO：6   J106W   Tapesia yallundae(W)   tgggggctaccctacttggtag
  SEQ IDNO：7   J107W   Tapesia yallundae(W)   (FAM)-tttagagtcgtcaggcctctcggagaagc-(TAMRA)
  SEQ IDNO：8   J108W   Tapesia yallundae(W)   atttattcaagggtggaggtcctga
  SEQ IDNO：9   J109W   Tapesia yallundae(W)   aagggtggaggtctgaaccag
  SEQ IDNO：10   J110W   Tapesia yallundae(W)   aagggtggaggtctgaacca
  SEQ IDNO：11   J111W   Tapesia yallundae(W)   caagggtggaggtctgaacc
  SEQ IDNO：12   J112R   Tapesia acuformis(R)   tcaagggtggaggtctgaacc
  SEQ IDNO：13   J100R   Tapesia acuformis(R)   gggccaccctacttcggtaa
  SEQ IDNO：14   J101R   Tapesia acuformis(R)   gaaatcctgggggccaccctacttc
  SEQ IDNO：15   J102R   Tapesia acuformis(R)   cctgggggccaccctact
  SEQ IDNO：16   J113R   Tapesia acuformis(R)   gccaccctacttcggtaaggtt
  SEQ IDNO：17   J114R   Tapesia acuformis(R)   caccctacttcggtaaggtttagagtc
  SEQ IDNO：18   J115R   Tapesia acuformis(R)   aggtaatttattcaagggtggaggt
  SEQ IDNO：19   J116R   Tapesia acuformis(R)   aggtaatttattcaagggtggaggtc
  SEQ IDNO：20   J117R   Tapesia acuformis(R)   aaggtaatttattcaagggtggaggt
  SEQ IDNO：21   J118R   Tapesia acuformis(R)   ttattcaagggtggaggtctgg
  SEQ IDNO：22   J119R   Tapesia acuformis(R)   tattcaagggtggaggtctgga
  SEQ IDNO：23   J120R   Tapesia acuformis(R)   cctgccaaagcaacaaaggta
  SEQ IDNO：24   J121R   Tapesia acuformis(R)   (FAM)-cgggcctctcggagaagcctgg-(TAMRA)
  SEQ IDNO：25   J122R   Tapesia acuformis(R)   cctacttcggtaaggtttagagtcgt
  SEQ IDNO：26   J123R   Tapesia acuformis(R)   tctccgagaggcccgac
  SEQ IDNO：27   J124R   Tapesia acuformis(R)   (FAM)-aagcctggtccagacctccaccc-(TAMRA)
  SEQ IDNO：28   J125R   Tapesia acuformis(R)   aaggatcattaatagagcaatggatagac
  SEQ IDNO：29   J126R   Tapesia acuformis(R)   (FAM)-cgccccgggagaaatcctgg-(TAMRA)
  SEQ IDNO：30   J127R   Tapesia acuformis(R)   tgggggccaccctacttc
  SEQ IDNO：31   JB537   Tapesia yallundae(W)   gggggctaccctacttggtag
  SEQ IDNO：32   JB541   Tapesia yallundae(W)   ccactgattttagaggccgcgag
  SEQ IDNO：33   JB540   Tapesia acuformis(R)   gggggccaccctacttcggtaa
  SEQ IDNO：34   JB542   Tapesia acuformis(R)   ccactgattttagaggccgcgaa
SEQ ID NO：35是正向测序引物。
SEQ ID NO：36是反向测序引物。
SEQ ID NO：37是Tapesia acuformis(syn.P.Herpotrichoides R型)的内部转录间隔区DNA序列，NRRL保藏号为B-21234，按5’至3’方向含有：小亚基rRNA基因的3’末端(第1-30位核苷酸)、内部转录间隔区1(第31-263位核苷酸)、5.8S rRNA基因(第264-419位核苷酸)、内部转录间隔区2(第420-570位核苷酸)、和大亚基rRNA基因的5’末端(第571-627位核苷酸)。
SEQ ID NO：38是Tapesia yallundae(syn.P.Herpotrichoides W型)的内部转录间隔区DNA序列，NRRL保藏号为B-21231，按5’至3’方向含有：小亚基rRNA基因的3’末端(第1-30位核苷酸)、内部转录间隔区1(第31-262位核苷酸)、5.8S rRNA基因(第263-418位核苷酸)、内部转录间隔区2(第419-569位核苷酸)、和大亚基rRNA基因的5’末端(第570-626位核苷酸)。
SEQ ID NO：39是从来自三个不同地域(Barton、Elmdon、Teversham)、感染了Tapesia acuformis的小麦提取物中PCR扩增产生的部分ITS区的共有DNA序列，按5’至3’方向含有：部分内部转录间隔区1序列、5.8S rRNA基因、和部分内部转录间隔区2序列。
SEQ ID NO：40是从来自三个不同地域(Barton、Elmdon、Teversham)、感染了Tapesia yallundae的小麦提取物中PCR扩增产生的部分ITS区的共有DNA序列，按5’至3’方向含有：部分内部转录间隔区1序列、5.8S rRNA基因、和部分内部转录间隔区2序列。
SEQ ID NO：41是小麦叶绿体DNA中编码细胞色素b-559的基因的核苷酸序列(Hird等，Mol.Gen.Genet.203：95-100(1986))。
SEQ ID NO：42-44是在小麦叶绿体DNA的基于PCR的检测中有用的如下寡核苷酸引物和探针：
  序列标识   寡聚物名称   引物名称   寡聚物序列(5′-＞3′)
  SEQ IDNO：42   正向引物   WCP2   cagtgcgatggctggctatt
  SEQ IDNO：43   反向引物   WCP3   cgttggatgaactgcattgct
  SEQ IDNO：44   TaqManTM探针   WCP1   (VIC)-acggactagctgtacctactgtttttttcttgggatc-(TAMRA)
本发明提供在鉴定和定量植物病原性真菌的不同致病型中使用的独特DNA序列。具体地，这些DNA序列可以在鉴定真菌致病型的基于TaqManTMPCR的分析中用作引物。本发明DNA序列包括来源于特定真菌病原体核糖体RNA基因区域中的内部转录间隔区(ITS)序列的引物和探针，它们能够鉴别此特定病原体。来自病原体种或属中不同致病型的ITS DNA序列在这些种或属的不同成员之间是不同的，它们可以被用于鉴别这些特定成员。
生物医学研究者采用基于PCR的技术检测感染动物组织中的病原体已有一段时间，并获得了一定的成功。然而，仅在最近，该技术才被应用于检测植物病原体。通过对Gaumannomyces graminis线粒体基因组具有特异性的序列进行PCR，已经在感染的小麦中检测到该病原体的存在(Schlesser等，1991；Applied and Environ.Microbiol.57：553-556)；而且随机扩增多态性DNA(即RAPD)标记能够区分Gremmeniella abietina的许多种类，Gremmeniella abietina是导致松柏类植物中出现scleroderris canker的原因。美国专利5,585,238(完整地并入本文作为参考)描述了来源于壳针孢属(Septoria)、Pseudocercosporella和球腔菌属(Mycosphaerella)菌株核糖体RNA基因区域中ITS序列的引物，以及它们在采用基于PCR的技术鉴定这些真菌隔离群中的用途。此外，WO 95/29260(完整地并入本文作为参考)描述了来源于镰孢属(Fusarium)菌株核糖体RNA基因区域中ITS序列的引物，以及它们在采用基于PCR的技术鉴定这些真菌隔离群中的用途。而且，美国专利5,800,997(完整地并入本文作为参考)描述了来源于尾孢属(Cercospora)、长蠕孢属(Helminthosporium)、球梗孢属(Kabatiella)和柄锈菌属(Puccinia)菌株核糖体RNA基因区域中ITS序列的引物，以及它们在采用基于PCR的技术鉴定这些真菌隔离群中的用途。
由于具有高拷贝数，核糖体基因适合用作分子探针的靶标。尽管成熟rRNA序列之间具有高度保守性，但非转录和转录间隔区序列通常保守性差，因此适合作为靶序列用于检测新近的进化歧异。真菌的rRNA基因按单元组织，每个单元编码三个成熟亚基：18S(小亚基)、5.8S和28S(大亚基)。这些亚基之间由两个大约300bp的内部转录间隔区，ITS1和ITS2，分隔开(White等，1990；见《PCR实验指南》(PCR Protocols)；编者：Innes等；第315-322页)。此外，这些转录单元由非转录间隔区序列(NTS)分隔开。ITS和NTS序列对于检测不同真菌病原体的具体致病型尤其适合。本发明DNA序列来自特定植物病原体核糖体RNA基因区域中的内部转录间隔区序列。来自病原体种或属中不同致病型的ITS DNA序列在这些种或属的这些成员之间是不同的。一旦确定了一个病原体的ITS序列，即可将这些序列与其它ITS序列作比对。以此方式，可以从这些ITS序列得到引物。也就是说，可以根据这些ITS序列中的如下区域设计引物，所述区域在真菌致病型间具有最大的序列差异。可以将这些序列和基于这些序列的引物用于鉴定具体病原体。
来源于ITS序列的代表性寡核苷酸引物的序列公开于SEQ ID NO：1-34中。这些序列可以在基于TaqManTM定量PCR对目的病原体进行的鉴定中使用。
在PCR分析中使用本发明引物序列的方法是本领域熟知的。例如，见美国专利4,683,195和4,683,202，以及Schlesser等(1991)Appliedand Environ.Microbiol.57：553-556。还参见Nazar等(1991；Physiol.and Molec.Plant Pathol.39：1-11)，他们采用PCR扩增探索黄萎轮枝孢(Verticillium albo-atrum)和大丽花轮枝孢(Verticilliumdahliae)的ITS区的差异，并由此区分了这两个物种；还参见Johanson和Jeger(1993；Mycol.Res.97：670-674)，他们采用类似技术区分香蕉病原体Mycosphaerella fijiensis和Mycosphaerella musicola。
近来TaqManTM方法学在医学研究中被用于定量检测临床样品中的单纯疱疹病毒(HSV)DNA(J.Clin.Microbiol.37(6)：1941-7(1999年6月))、在兽医学中被用于检测宿主动物体内的寄生微生物(J.Clin.Microbiol.37(5)：1329-31(1999年5月))，并且该方法学已表现出可用于甄别牛肉末中的细菌病原体(Appl.Envir.Micro.62(4)：1347-1353(1996年4月))。仅在最近TaqManTM方法才被用于鉴定和/或定量作物中的真菌病原体(植物病理学(Phytopathology)，89(9)：796-804(1999))。
本发明ITS DNA序列可以通过本领域已知的方法从真菌病原体克隆。一般地，从真菌隔离群中分离DNA的方法是已知的。见，Raeder和Broda(1985)应用微生物学通讯(Letters in Applied Microbiology)2：17-20；Lee等(1990)真菌遗传学时事通讯(Fungal Genetics Newsletter)35：23-24；及Lee和Taylor(1990)《PCR实验指南：方法和应用指导》(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)，Innes等(编)；第282-287页。
将每个病原体组中的这些ITS序列进行比较，以定位可以在TaqManTMPCR测定中用于区分不同种和/或株的序列趋异差别。在鉴定了序列趋异后，为每个探针合成多个引物，并在TaqManTM测定中对这些引物进行测试。在TaqManTM测定中使用的模板首先是纯化的病原体DNA，其次是从感染的宿主植物组织中分离到的DNA。由此，可以鉴定出具有鉴别性(即识别出一个特定的病原体种或株而不是相同病原体的其它种或株)的探针-引物组合。
优选的引物-探针组合能够在感染的宿主组织(即先已感染了特定病原体种或株的宿主组织)中区分不同的种或株。本发明提供许多符合此标准用于Tapesia yallundae和Tapesia acuformis的引物-探针组合。本发明的引物和探针是以真菌ITS区域间的序列差异为基础设计的。序列间的最小一个碱基对差异就能够允许设计出具有辨别能力的引物或探针。设计针对于特定真菌病原体的ITS区域的引物-探针组合可以联合用于检测种特异性PCR片段扩增的针对核糖体基因编码区中保守序列区域的引物或探针一起使用。一般地，引物应具有59℃左右的理论解链温度(Tm)以便获得良好的灵敏度，而且应缺少显著的二级结构并在引物组合间缺少3’重叠区。引物对的Tm典型地彼此相差2℃以内。引物一般与ITS1或ITS12的至少约5-10个连续核苷酸具有序列一致性。在优选实施方案中，引物长度大致是约5至30个核苷酸碱基。探针的Tm一般设计为高于引物Tm 10℃。所有的小麦提取物均含有宿主小麦DNA和存在的任何真菌病原体DNA。因此，可以对提取物进行靶向小麦DNA的内源性对照测定，以说明提取物样品间的任何差异。本发明描述了靶向细胞色素b-559基因的对照测定。在小麦品种间细胞色素b-559基因是一个保守基因，是宿主植物生存所必需的。这些对照测定提供了对假阴性的控制。即，可能由于PCR反应抑制造成的阴性真菌DNA结果可以通过内源性对照测定来验证。这些对照测定还提供了一个靶标，针对此靶标可以对真菌DNA的量进行标化以便实现样品与样品的比较。本发明描述了这些对照测定在独立于真菌病原体测定的反应中和在多重反应中的应用。本发明本身容易地引出了含有实施本发明方法所必需要素的“试剂盒”的制备。该试剂盒可以含有带分隔的托架，以便在其中密集放置一或多个容器，如管或小瓶。其中一个容器可以含有未标记的或可检测标记的DNA引物。这些标记DNA引物可以按需要以冻干形式存在或处于适合的缓冲液中。一或多个容器可以含有在TaqManTM PCR反应中使用的一或多种酶或试剂。这些酶可以单独或混合地，以冻干形式存在或处于适当缓冲液中。最后，该试剂盒可以含有实施本发明技术所必需的所有其它成分，例如缓冲液、抽提试剂、酶、吸管、平板、核酸、核苷三磷酸、滤纸、和类似的其它消耗品。
以下实施例给出了典型的实验操作方法，这些操作方法可以用于选择适合的引物和探针序列、测试引物和探针的选择和鉴别效力、和应用这些引物和探针检测和定量疾病和真菌隔离群。提供这些实施例旨在作为举例说明而非进行限制。
实施例
此处所用标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的，并描述于J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)；和T.J. Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验(Experiments with GeneFusions)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.andWiley-interscience出版(1987)。
实施例1：真菌隔离群和真菌的基因组DNA提取
表1列出了使用的真菌测试隔离群和它们的来源。在150ml马铃薯右旋糖肉汤培养基中接种来自PDA(马铃薯右旋糖琼脂)培养物的菌丝体片段以培养真菌。培养物在定轨摇床上28℃孵育7-11天。或者，直接从PDA平板分离菌丝体。通过离心沉淀菌丝体，然后在液氮中将其研碎，采用Lee和Taylor(1990；《PCR实验指南：方法和应用的指导》；编者：Innes等；第282-287页)的方法提取总基因组DNA。
表1：测试隔离群的来源
  隔离群   生物   来源   产地
  358   Tapesia acuformis   Novartis1   ----
  308   Tapesia acuformis   Novartis1   ----
  44643   Tapesia yallundae   ATCC2   德国
  44614   Tapesia yallundae   ATCC2   爱尔兰
  60973   Tapesia acuformis   ATCC2   德国
  42040   Pseudocercosporellaherpotrichoides var.herpotrichoides   ATCC2   ----
  62012   Pseudocercosporella aestiva   ATCC2   德国
  24425   颖枯壳针孢(Septoria nodorum)   ATCC2   蒙大纳州
  26517   小麦壳针孢(Septoria tritici)   ATCC2   明尼苏达州
  38699   大豆壳针孢(Septoria glycines)   ATCC2   伊利诺伊州
  22585   大麦壳针孢(Septoria passerini)   ATCC2   明尼苏达州
  26380   Septoria avenae f.sp.triticea   Bergstrom/Ueng3   明尼苏达州
  52182   Ceratobasidium cereale   ATCC2   俄亥俄州
  11404   Drechslera sorokiniana   ATCC2   明尼苏达州
  R-5391   大刀镰孢(Fusarium culmorum)   Nelson4   德国
  4551   串珠镰孢(Fusarium moniliforme)   Novartis1   印地安那州
  R-8637   禾本科镰孢(Fusarium graminearum)   Nelson4   摩洛哥
  T-534   早熟禾镰孢(Fusarium poae)   Nelson4   宾夕法尼亚州
  18222   Gerlachia nivalis   ATCC2   英国
  093   Microdochium nivale var.majus   Novartis1   ----
1Novartis Agribusiness Biotechnology Research公司，ResearchTriangle Park，NC，USA
2美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，USA
3Dr.Gary Bergstrom，Cornell University，和Dr.Peter Ueng，USDA-ARS，Beltsville，Maryland
4Dr.Paul Nelson，Penn State University，State College，Pennsylvania
实施例2：从小麦茎组织中提取DNA
按如下从小麦茎组织(见表2)提取DNA：
(1)将多达25个小麦样品置于干净的表面上。采用无菌解剖刀将恰好位于第一个分蘖或根之上的茎切断。在此切口上方4cm处再次切断。此4cm切段构成茎组织样品，将此样品与其它小麦样品混合进行大块浸解。
(2)将茎样品置于Bioreba(Reinach，瑞士)重负荷塑料袋中(cat#490100)。给此植物组织称重，即装有样品的塑料袋的重量减去包装重量(塑料袋的重量)。
(3)每份重量(g)的小麦组织中加入等体积(mL)Muller提取缓冲液(0.1％w/v Tween-80；0.040M Tris碱；0.15M氯化钠；0.1％w/v牛血清白蛋白(Pentex Fraction V)；0.01％w/v叠氮化钠；0.20M EDTA；pH7.7，储存在4℃)。采用设置在70的Bioreba Homex 6匀浆器浸解组织。研磨组织直到形成纤维状。
(4)于冰上将提取汁液等分装在Eppendorf管中。
(a)煮沸提取物5分钟。
(b)将煮沸的提取物置于冰上。用小型离心机12,000×G离心(microfuge)此煮沸提取物。
(c)将来自该离心提取物的上清液按1：20稀释在dH2O中。
(d)将稀释的提取物一直储存在冰上直到临用前。
表2：用于开发引物和探针的小麦样品的产地
  样品   描述   产地
  W(Barton)   眼斑病感染的小麦   英国
  W(Elmdon)   眼斑病感染的小麦   英国
  W(Teversham)   眼斑病感染的小麦   英国
  R(Barton)   眼斑病感染的小麦   英国
  R(Elmdon)   眼斑病感染的小麦   英国
  R(Teversham)   眼斑病感染的小麦   英国
表3：用于开发测定方法的小麦样品的产地
  样品   描述  产地
  1999 H   未感染小麦  Greenhouse
  1999 #5   眼斑病感染的小麦  Fairfield，WA
  1999 #6   眼斑病感染的小麦  Genesee，ID
  1999 #8   眼斑病感染的小麦  Walla Walla，WA
  1999 #10   眼斑病感染的小麦  Connell，WA
  1999 #16   眼斑病感染的小麦  Connell，WA
  1999 #21   眼斑病感染的小麦  Colfax，WA
  1999 #23   眼斑病感染的小麦  Colfax，WA
  1999 #33   眼斑病感染的小麦  Athena，OR
  1999 #38   眼斑病感染的小麦  Leland，ID
  1999 #41   眼斑病感染的小麦  Coulee City，WA
  1999 #43   眼斑病感染的小麦  Genesee，ID
  1999 #46   眼斑病感染的小麦  Leland，ID
  1999 #47   眼斑病感染的小麦  Leland，ID
  1999 #54   眼斑病感染的小麦  Wilur，WA
  1999 #56   眼斑病感染的小麦  Ritzville，WA
  1999 #57   眼斑病感染的小麦  Sprague，WA
  1999 #72   眼斑病感染的小麦  Grangeville，IO
  1999 #73   眼斑病感染的小麦  Grangeville，IO
  1999 #74   眼斑病感染的小麦  Grangeville，IO
  1999 #80   眼斑病感染的小麦  Ritzville，WA
  1999 #82   眼斑病感染的小麦  Edwall，WA
  1999 #84   眼斑病感染的小麦  Genesee，ID
  1999 #93   眼斑病感染的小麦  Davenport，WA
  1999 #88   眼斑病感染的小麦  Wilbur，WA
  1999 #89   眼斑病感染的小麦  Coulee City，WA
  1999 #94   眼斑病感染的小麦  Plummee，ID
  1999 #95   眼斑病感染的小麦  Pendleton，OR
  1999 #96   眼斑病感染的小麦  Harrington，WA
  1999 #100   眼斑病感染的小麦  Creston，WA
  1999 #108   眼斑病感染的小麦  Wilbur，WA
  1999 #111   眼斑病感染的小麦  Ferdinand，ID
实施例3：从Tapesia yallundae和Tapesia acuformis感染的小麦样品中分离内部转录间隔区(ITS)DNA并测序
从表2中显示的感染了Tapesia yallundae的小麦提取物，采用Tapesia yallundae特异性引物JB537(SEQ ID NO：31)和JB541(SEQ IDNO：32)，PCR扩增大约420bp的截短ITS区片段。类似地，从Tapesiaacuformis感染的小麦提取物，采用Tapesia acuformis特异性引物JB540(SEQ ID NO：33)和JB542(SEQ ID NO：34)，PCR扩增Tapesia acuformis的截短ITS片段。聚合酶链式反应采用Perkin-Elmer的GeneAmp试剂盒(Foster City，CA；part no.N808-0009)进行，在50μl终体积中含有50mM KCl、2.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl(pH 8.3)，dTTP、dATP、dCTP和dGTP各200μM、引物各50pmol、2.5单位Taq聚合酶和1μl 1∶10稀释的小麦提取物。反应在Perkin-Elmer 9700型热循环仪中按94℃ 15s和75℃ 1min，运行35循环。
采用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA；part no.K4550-40)，根据厂家说明书，将PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO TA克隆载体中。采用此TA克隆载体的正向引物(5’-gtaaaacgacggccagt-3’；SEQID NO：35)和反向引物(5’-caggaaacagctatgac-3’；SEQ ID NO：36)，对含有ITS片段插入的克隆测序。测序在ABI PRISM 377TM DNA测序仪(PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City，California)上进行。
实施例4：寡核苷酸的合成和纯化
通过例如Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)或Midland Certified Reagent公司(Midland，Texas)合成和纯化寡核苷酸和TaqManTM探针(引物和探针)。
实施例5：种特异性引物和探针的选择
对实施例3中描述的从感染小麦组织获得的Tapesia yallundae(SEQID NO：40)和Tapesia acuformis(SEQ ID NO：39)的ITS区共有序列进行多序列比对。包括在该比对中的还有美国专利5,585,238引用的Tapesiayallundae和Tapesia acuformis真菌DNA的ITS区序列(分别是SEQ IDNO：37和SEQ ID NO：38)。针对在真菌种之间含有最大序列差异的区域设计PCR引物和TaqManTM探针。这就产生了对Tapesia acuformis或Tapesia yallundae具有特异性的设计引物和探针。根据实施例4合成显示在下表3和4中的寡核苷酸引物和探针。并合成前述(美国专利5,585,238)Tapesia yallundae特异性引物JB537(SEQ ID NO：31)和JB541(SEQ ID NO：32)、以及Tapesia acuformis特异性引物JB540(SEQID NO：33)和JB542(SEQ ID NO：34)。此外，还合成White等(1990；《PCR实验指南》；编者：Innes等，第315-322页)公开的核糖体基因特异性引物ITS1(SEQ ID NO：1和ITS4(SEQ ID NO：2)，用于联合这些ITS区特异性引物进行测试。
表4：用于TaqManTM扩增Tapesia acuformis DNA的引物和探针
  序列标识   寡聚物名称   靶标  寡聚物序列(5’-＞3’)
  SEQ IDNO：1   ITS1   真菌18S rDNA  tccgtaggtgaacctgcgg
  SEQ IDNO：2   ITS4   真菌25S rDNA  tcctccgcttattgatatgc
  SEQ IDNO：12   J112R   Tapesia acuformis(R)  tcaagggtggaggtctgaacc
  SEQ IDNO：13   J100R   Tapesia acuformis(R)  gggccaccctacttcggtaa
  SEQ IDNO：14   J101R   Tapesia acuformis(R)  gaaatcctgggggccaccctacttc
  SEQ IDNO：15   J102R   Tapesia acuformis(R)  cctgggggccaccctact
  SEQ IDNO：16   J113R   Tapesia acuformis(R)  gccaccctacttcggtaaggtt
  SEQ IDNO：17   J114R   Tapesia acuformis(R)  caccctacttcggtaaggtttagagtc
  SEQ IDNO：18   J115R   Tapesia acuformis(R)  aggtaatttattcaagggtggaggt
  SEQ IDNO：19   J116R   Tapesia acuformis(R)  aggtaatttattcaagggtggaggtc
  SEQ IDNO：20   J117R   Tapesia acufomis(R)  aaggtaatttattcaagggtggaggt
  SEQ IDNO：21   J118R   Tapesia acuformis(R)   ttattcaagggtggaggtctgg
  SEQ IDNO：22   J119R   Tapesia acuformis(R)   tattcaagggtggaggtctgga
  SEQ IDNO：23   J120R   Tapesia acuformis(R)   cctgccaaagcaacaaaggta
  SEQ IDNO：24   J121R   Tapesia acuformis(R)   (FAM)-cgggcctctcggagaagcctgg-(TAMRA)
  SEQ IDNO：25   J122R   Tapesia acuformis(R)   cctacttcggtaaggtttagagtcgt
  SEQ IDNO：26   J123R   Tapesia acuformis(R)   tctccgagaggcccgac
  SEQ IDNO：27   J124R   Tapesia acuformis(R)   (FAM)-aagcctggtccagacctccaccc-(TAMRA)
  SEQ IDNO：28   J125R   Tapesia acuformis(R)   aaggatcattaatagagcaatggatagac
  SEQ IDNO：29   J126R   Tapesia acuformis(R)   (FAM)-cgccccgggagaaatcctgg-(TAMRA)
  SEQ IDNO：30   J127R   Tapesia acuformis(R)   tgggggccaccctacttc
  SEQ IDNO：33   JB540   Tapesia acuformis(R)   gggggccaccctacttcggtaa
  SEQ IDNO：34   JB542   Tapesia acuformis(R)   ccactgattttagaggccgcgaa
表5：用于TaqManTM扩增Tapesia yallundae DNA的引物和探针
  序列标识   引物名称   靶标   寡聚物序列(5’-＞3’)
  SEQ IDNO：1   ITS1   真菌18S rDNA   tccgtaggtgaacctgcgg
  SEQ IDNO：2   ITS4   真菌25S rDNA   tcctccgcttattgatatgc
  SEQ IDNO：3   J103W   Tapesia yallundae(W)   ggctaccctacttggtag
  SEQ IDNO：4   J104W   Tapesia yallundae(W)   cctgggggctaccctacttg
  SEQ IDNO：5   J105W   Tapesia yallundae(W)   gggggctaccctacttggtag
  SEQ IDNO：6   J106W   Tapesia yallundae(W)   tgggggctaccctacttggtag
  SEQ IDNO：7   J107W   Tapesia yallundae(W)   (FAM)-tttagagtcgtcaggcctctcggagaagc-(TAMRA)
  SEQ IDNO：8   J108W   Tapesia yallundae(W)   atttattcaagggtggaggtcctga
  SEQ IDNO：9   J109W   Tapesia yallundae(W)   aagggtggaggtctgaaccag
  SEQ IDNO：10   J110W   Tapesia yallundae(W)   aagggtggaggtctgaacca
  SEQ IDNO：11   J111W   Tapesia yallundae(W)   caagggtggaggtctgaacc
  SEQ IDNO：31   JB537   Tapesia yallundae(W)   gggggctaccctacttggtag
  SEQ IDNO：32   JB541   Tapesia yallundae(W)   ccactgattttagaggccgcgag
实施例6：对引物-探针文库的最初筛选
在最初TaqManTM筛选中测试实施例5中设计的种特异性引物文库。测试引物和探针组合从靶病原体DNA进行扩增的能力。所有其它反应条件均保持恒定(1×TaqManTM通用母混合物(Perkin Elmer，Norwalk，CT；part no.N430-4447)，引物各200nM，100nM探针，0.04ng/μL真菌靶基因组DNA，热循环：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，以及95℃ 15秒、60℃ 60秒循环40周)。通过鉴定最佳扩增该靶DNA的那些引物和探针，确定病原体特异性引物和探针。
实施例7：TaqManTM引物优化
一旦确定了对靶病原体DNA特异的引物对后，在单次TaqManTM试验中优化引物浓度。试验不同浓度正向引物对不同浓度反向引物的矩阵，而所有其它反应条件保持恒定(1×TaqManTM通用母混合物(Perkin Elmer)，100nM探针，0.4ng/μL真菌靶基因组DNA，热循环：50℃ 2分钟，95℃10分钟，以及95℃ 15秒、60℃ 60秒循环40周)。
实施例8：TaqManTM探针优化
一旦按实施例7确定了最佳引物浓度后，即优化探针浓度。在引物处于最佳浓度时，在一个典型的TaqManTM试验中运行不同的探针浓度。选择在报道PCR扩增方面给出最佳信号的探针浓度。记录用于定量Tapesia acuformis和Tapesia yallundae的最佳引物和探针以及它们的最佳反应浓度(分别列于表5和6)。采用60℃的退火温度、35个循环建立对Tapesia acuformis和Tapesia yallundae的分析测定。
表6：Tapesia acuformis特异的引物和探针组合
  靶标   寡聚物   序列标识   引物名称   优化的浓度(nM)
  Tapesia acuformis(R)   正向引物   SEQ ID NO：14   J101R   50
  反向引物   SEQ ID NO：18   J115R   900
  TaqManTM探针   SEQ ID NO：24   J121R   700
表7：Tapesia yallundae特异的引物和探针组合
  靶标   寡聚物   序列标识   引物名称   优化的浓度(nM)
  Tapesia yallundae(W)   正向引物   SEQ ID NO：3   J103W   300
  反向引物   SEQ ID NO：8   J108W   300
  TaqManTM探针   SEQ ID NO：7   J107W   200
实施例9：确定TaqManTM测定对真菌基因组DNA的特异性
用一组来自其它谷类植物病原体的DNA，验证该TaqManTM测定的交叉反应性(表1)。采用实施例7和8中测定的最佳引物和探针浓度进行TaqManTM反应，对按实施例1制备的谷类植物病原体基因组DNA(0.2ng/μL)进行测试。根据结果，改变热循环参数以使该测定更严紧。这些改变包括改变反应中的退化/延伸温度或循环数。成功的TaqManTM测定对皮克级以下量的靶DNA敏感，并与该组谷类植物病原体或植物DNA无任何交叉反应。表8中显示了实施例8所确定的Tapesia acuformis(R型)和Tapesia yallundae(W型)测定方法的结果。Gr值用于显示在所选隔离群中的扩增。当采用这些测定方法时，CT值为35的那些隔离群不产生扩增。
表8：真菌基因组DNA样品的Tapesia acuformis TaqManTM测定结果
  隔离群   生物  CT值  CT值
 R型测定  W型测定
  358   Tapesia acuformis  18.52  35
  308   Tapesia acuformis  18.65  35
  44643   Tapesia yallundae  35
  44614   Tapesia yallundae  35  l7.18
  60973   Tapesia acuformis  31.36  35
  42040   Pseudocercosporella herpotrichoides var.herpotrichoides  35  18.7
  62012   Pseudocercosporella aestiva  35  35
  24425   颖枯壳针孢  35  35
  26517   小麦壳针孢  35  35
  38699   大豆壳针孢  35  35
  22585   大麦壳针孢  35  35
  26380   Septoria avenae f.sp.triticea  35  35
  52182   Ceratobasidium cereale  35  35
  11404   Drechslera sorokiniana  35  35
  R-5391   大刀镰孢  35  35
  4551   串珠镰孢  35  35
  R-8637   禾本科镰孢  35  35
  T-534   早熟禾镰孢  35  35
  18222   Gerlachia nivalis  35  35
  093   Microdochium nivale var.majus  35  35
注：CT值或循环阈值，是指PCR循环，在此循环首先可检测到高于基线信号的报道荧光增加。序列检测(Sequence Detection)软件就所有标准品产生CT对(LogN)起始拷贝数的标准曲线，然后通过内插法(interpolation)确定未知样品的起始拷贝数。
实施例10：确定TaqManTM测定对感染小麦中病原体的特异性
在采用实施例3所述测定进行分析的基础上，将小麦样品确定为感染Tapesia acuformis和/或Tapesia yallundae的样品。此外采用表6所列引物组合和实施例8的PCR条件测试小麦样品。采用序列检测系统(Sequence Detection Systems)软件(Perkin Elmer-AppliedBiosciences)，根据真菌靶标基因组DNA的标准曲线(表9)定量从小麦样品扩增的病原体DNA。关于Tapesia acuformis特异性测定的结果显示在表10中。在所有感染样品中均检测到来自Tapesia acuformis的DNA，并对之进行了定量。关于Tapesia yallundae特异性测定的结果显示在表11中。在所有感染样品中均检测到来自Tapesia yallundae的DNA，并对之进行了定量。对于任一个测定，在未感染小麦组织中均没有观察到交叉反应。
表9：Tapesia acuformis和T.yallundae基因组DNA分别在R型和W型测定中重复两次实验的标准曲线
  R-型测定 W-型测定
  Tapesia acuformis #308DNA   CT值 Tapesia yallundae #42040DNA   CT值
  5ng   18.5718.38 5ng   18.1317.92
  500pg   21.321.35 500pg   21.8322.02
  50pg   23.5724.27 50pg   25.2625.37
  5pg   27.8227.89 5pg   29.5329.88
  500fg   31.4731.17 500fg   33.3235
  50fg   34.1334.01 无模板对照   3535
  无模板对照   3535
表10：小麦提取物的Tapesia acuformis TaqManTM测定结果。样品进行两次重复实验并被常规PCR测定实验的结果证明
  样品号   Tapesia acuformis测定的TaqManTM结果     PCT测试结果(0至+5级)
  CT值   模板(pg)   标准差   平均值(pg)
  T.acuformis  T.yallundae
  H   35   0   0   0   -  -
  35   0   0   0
  6   35   2.50E-02   0   0.02   -  -
  35   2.50E-02   0   0.02
  57   31.07   4.60E-01   0.03   0.44   +  -
  31.20   4.20E-01   0.03   0.44
  47   31.13   4.40E-01   0.14   0.54   + -
  30.62   6.40E-01   0.14   0.54
  84   33.68   7.00E-02   0.01   0.06   + -
  33.96   5.70E-02   0.01   0.06
  23   29.42   1.50E+00   0.28   1.71   ++ -
  29.10   1.90E+00   0.28   1.71
  46   28.67   2.60E+00   0.44   2.90   ++ -
  28.37   3.20E+00   0.44   2.90
  73   30.54   6.70E-01   0.06   0.72   ++ -
  30.37   7.60E-01   0.06   0.72
  21   27.34   6.80E+00   2.28   5.15   +++ -
  28.24   3.50E+00   2.28   5.15
  38   30.04   9.70E-01   0.71   1.47   +++ -
  29.05   2.00E+00   0.71   1.47
  43   26.12   1.60E+01   0.97   16.94   +++ -
  26.01   1.80E+01   0.97   16.94
  41   24.07   7.20E+01   19.75   57.57   ++++ -
  24.75   4.40E+01   19.75   57.57
  72   28.01   4.20E+00   0.29   3.96   ++++ -
  28.16   3.80E+00   0.29   3.96
  74   26.01   1.80E+01   3.03   19.75   ++++ -
  25.71   2.20E+01   3.03   19.75
  5   26.72   1.10E+01   1.50   9.51   +++++ -
  27.03   8.50E+00   1.50   9.51
  82   26.74   1.00E+01   1.29   9.51   +++++ -
  27.01   8.60E+00   1.29   9.51
  93   26.05   1.70E+01   2.12   18.68   +++++ +
  25.82   2.00E+01   2.12   18.68
  96   24.07   7.10E+01   3.75   68.50   +++++ ++
  24.18   6.60E+01   3.75   68.50
表11：小麦提取物的Tapesia yallundae TaqManTM测定结果。样品进行两次重复实验并被常规PCR测定实验的结果证明
  样品号   Tapesia acuformis测定的TaqManTM结果       PCT测试结果(0至+5级)
  CT值   模板(pg)   标准差   平均值(pg)
  T.acuformis   T.yallundae
  H   35   0   0   0   -   -
  35   0   0   0
  6   35   0   0   0   -   -
  35   0   0   0
  82   33.41   4.5E-01   0.07   0.40   +++++   -
  33.78   3.6E-01
  94   33.29   5.2E-01   0.21   0.37   +   +
  34.68   2.2E-01
  108   34.41   2.6E-01   0   0.26   +++   +
  34.40   2.7E-01
  111   33.21   5.4E-01   0.02   0.53   ++   +
  33.28   5.2E-01
  33   24.67   9.1E+01   37.45   64.30   ++   ++
  26.13   3.8E+01
  54   28.09   1.2E+01   6.31   16.10   +++   ++
  27.14   2.1E+01
  80   26.43   3.1E+01   3.62   34.03   ++++   ++
  26.18   3.7E+01
  95   29.98   3.8E+00   0.08   3.7   -   ++
  30.03   3.6E+00
  100   27.16   2.0E+01   1.40   21.32   +++   +++
  27.01   2.2E+01
  8   25.63   5.1E+01   9.96   57.91   +   +++
  25.22   6.5E+01
  10   22.36   3.6E+02   79.1   418.46   ++  +++
  21.91   4.7E+02
  16   23.77   1.6E+02   6.18   150.78   ++  ++++
  23.87   1.5E+02
  56   25.14   6.8E+01   2.26   66.56   ++++  ++++
  25.22   6.5E+01
  88   24.48   1.0E+02   21.89   85.90   ++  ++++
  25.09   7.0E+01
  89   23.87   1.5E+02   16.48   157.85   ++++  +++++
  23.63   1.7E+02
实施例11：与真菌病原体TaqManTM测定一起使用的内源性对照
所有小麦提取物均含有宿主小麦DNA和存在的任何真菌病原体DNA。因此，为了说明样品提取物间的任何差异，对提取物进行靶向小麦DNA的内源性对照测定。这些测定提供对假阴性的控制。即，可能由于PCR反应抑制导致的阴性真菌DNA结果可以通过此内源性对照测定得到验证。这些测定还提供了一个靶标，通过该靶标可以对真菌DNA的量进行标化以便样品和样品间的比较。
实施例12：内源性对照引物和探针的选择
用于扩增和检测小麦叶绿体DNA的引物和探针涉及细胞色素b-599基因的编码序列(SEQ ID NO：41)。引物和探针序列的选择采用ABI PrimeExpress程序(PE Applies Biosystems，Foster City，CA，USA)根据厂家说明来实现。该程序选择在解链温度、二级结构、碱基组成和扩增子长度方面得到优化的TaqManTM引物和探针组。从该软件选择的这些引物和探针组，通过手工寻找在3’末端具有最少数目的热动力学稳定碱基的引物，由此筛选出最佳的组。选择用于扩增小麦DNA作为内源性对照的引物/探针组显示在表12中。它们均按实施例4的方法合成。
表12：靶向小麦(Triticum aestivum)叶绿体DNA的内源性对照反应所用的引物和探针组合
  寡聚物   序列标识 引物名称   寡聚物序列(5’-＞3’)
  正向引物   SEQ ID NO：42 WCP2   cagtgcgatggctggctatt
  反向引物   SEQ ID NO：43 WCP3   cgttggatgaactgcattgct
  TaqManTM探针   SEQ ID NO：44 WCP1   (VIC)-acggactagctgtacctactgtttttttcttgggatc-(TAMRA)
实施例13：采用TaqManTM测定在小麦提取物中定量小麦DNA
按实施例2所述制备小麦组织的提取物。按如下对这些组织进行实施例11所述的测定：在薄壁光学级PCR管(PE Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中制备反应物。通过在1×TaqMan通用母混合物溶液(PE Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中将正向和反向引物浓度调节至900nM并将探针浓度调节至250nM，制备反应混合物。加入1微升1∶20稀释的小麦提取物。此外，通过加入1μL 5ng/μL真菌DNA制备物，测试与真菌DNA的交叉反应性。反应在ABI 7700仪(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)中进行，热循环是：50℃ 2分钟，90℃ 10分钟，以及95℃ 15秒、60℃ 60秒的40个循环。ABI 7700软件确定每个反应的荧光达到0.4阈值时的CT值。该数据列于表13中。给出的此CT值与每个样品中存在的小麦靶DNA量负相关。产生40CT值的样品为无扩增。表13显示，此内源性对照测定在多个小麦品种中均检测到细胞色素b-599基因。对小麦叶绿体DNA的TaqManTM测定还显示出每个样品中存在不同量的宿主DNA。采用靶DNA的稀释物，可以按实施例10所述产生标准曲线，根据此曲线可以对小麦DNA进行定量。
表13：在小麦和真菌DNA提取物中靶向小麦叶绿体DNA的TaqManTM测定所报道的CT值
  样品号   小麦品种   CT值
  6   Madsen   17.17
  57   Madsen   19.48
  73   Lambert   20.71
  21   Brundage   18.9
  41   Eltan   20.23
  13   Mixed   19.99
  5   Madsen   19.19
  5ngTapesia acuformisDNA #308   40
  NTC   40
实施例14：用于真菌病原体的TaqManTM测定和用于宿主DNA的对照测定的合并
将实施例13中给出的反应和用于定量真菌DNA的反应合并在一起，以便在同一反应管中进行两个测试。列于表6中的针对Tapesiaacuformis的探针和引物按其最佳浓度加至实施例13所述的反应中。按所述对感染的小麦组织运行这些反应。此处给出的数据显示，TaqManTM真菌病原体测定可以和针对小麦组织的内源性对照反应在同一反应管中进行。
表14：在小麦DNA提取物中靶向小麦叶绿体DNA的TaqManTM测定所报告的CT值
  样品号   小麦测定CT值   R型测定   PCR测试结果(0至+5级)
  CT值   算的浓度(pg)
  T.acuformis   T.yallundae
  6   17.09   40   0   -   -
  41   27.70   20.65   24.3   ++++   -
  13   30.9   19.99   3.69   +++++   +
尽管本发明通过参考其具体实施方案进行了描述，但应当理解，可以有许多变化、修饰和其它实施方案，因此所有这些变化、修饰和实施方案都应被认为属于本发明的范围之内。
                             序列表
<110>Novartis AG
<120>基于PCR检测和定量Tapesia yallundae和Tapesia acuformis
<130>PB/5-31084A
<140>
<141>
<150>US 09/371,749
<151>1999-08-10
<150>US 60/168,326
<151>1999-12-01
<160>44
<170>patentIn Ver.2.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：ITS1
<400>1
tccgtaggtg aacctgcgg                                                   19
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<223>人工序列描述：J108W
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 atttattcaa gggtggaggt cctga                                           25
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caccctactt cggtaaggtt tagagtc                                          27
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aggtaattta ttcaagggtg gaggtc                                           26
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cgggcctctc ggagaagcct gg                                               22
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<213>人工序列
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<223>人工序列描述：J126R
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cgccccggga gaaatcctgg                                                  20
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<213>人工序列
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<223>人工序列描述：J127R
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<212>DNA
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<223>人工序列描述：JB537
<400>31
gggggctacc ctacttggta g                                                21
<210>32
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：JB541
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 ccactgattt tagaggccgc gag                                             23
<210>33
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：JB540
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gggggccacc ctacttcggt aa                                               22
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：JB542
<400>34
ccactgattt tagaggccgc gaa                                              23
<210>35
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：正向测序引物
<400>35
gtaaaacgac ggccagt                                                     17
<210>36
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：反向测序引物
<400>36
caggaaacag ctatgac                                                     17
<210>37
<211>627
<212>DNA
<213>Tapesia acuformis
<400>37
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atagagcaat ggatagacag cgccccggga 60
gaaatcctgg gggccaccct acttcggtaa ggtttagagt cgtcgggcct ctcggagaag 120
cctggtccag acctccaccc ttgaataaat tacctttgtt gctttggcag ggcgcctcgc 180
gccagcggct tcggctgttg agtacctgcc agaggaccac aactcttgtt tttagtgatg 240
tctgagtact atataatagt taaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat 300
gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat 360
ctttgaacgc acattgcgcc ctctggtatt ccggggggca tgcctgttcg agcgtcatta 420
taaccactca agctctcgct tggtattggg gttcgcgtct tcgcggcctc taaaatcagt 480
ggcggtgcct gtcggctcta cgcgtagtaa tactcctcgc gattgagtcc ggtaggttta 540
cttgccagca acccccaatt ttttacaggt tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg 600
aacttaagca tatcaataag cggagga                                     627
<210>38
<211>626
<212>DNA
<213>Tapesia yallundae
<400>38
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atagagcaat gaacagacag cgccccggga 60
gaaatcctgg gggctaccct acttggtagg gtttagagtc gtcaggccgc tcggagaagc 120
ctggttcaga cctccaccct tgaataaatt acctttgttg ctttggcagg gcgcctcgcg 180
ccagcggctt cggctgttga gtacctgcca gaggaccaca actcttgttt ttagtgatgt 240
ctgagtacta tataatagtt aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg 300
aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 360
tttgaacgca cattgcgccc tctggtattc cggggggcat gcctgttcga gcgtcattat 420
aaccactcaa gctctcgctt ggtattgggg ttcgcgtcct cgcggcctct aaaatcagtg 480
gcggtgcctg tcggctctac gcgtagtaat actcctcgcg attgagtccg gtaggtttac 540
ttgccagtaa cccccaattt tttacaggtt gacctcggat caggtaggga tacccgctga 600
acttaagcat atcaataagc ggagga                                      626
<210>39
<211>415
<212>DNA
<213>Tapesia acuformis
<400>39
gggggccacc ctacttcggt aaggtttaga gtcgtcgggc ctctcggaga agcctggtcc  60
agacctccac ccttgaataa attacctttg ttgctttggc agggcgcctc gcgccagcgg 120
cttcggctgt tgagtacctg ccagaggacc acaactcttg tttttagtga tgtctgagta 180
ctatataata gttaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg 240
cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac 300
gcacattgcg ccctctggta ttccgggggg catgcctgtt cgagcgtcat tataaccact 360
caagctctcg cttggtattg gggttcgcgt cttcgcgggc ctctaaaatc agtgg      415
<210>40
<211>415
<212>DNA
<213>Tapesia yallundae
<400>40
gggggctacc cctacttggt agggtttaga gtcgtcaggc ctctcggaga agcctggttc 60
agacctccca cccttgaata aattaccttt gttgctttgg cagggcgcct cgcgccagcg 120
gcttcggctg ttgagtacct gccagaggac cacaactctt gtttttagtg atgtctgagt 180
actatataat agttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagsac 240
gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa 300
cgcacattgc gccctctggt attccggggg gcatgcctgt tcgagcgtca ttataaccac 360
tcaagctctc gcttggtatt ggggttcgcg tcctcgcggc ctctaaaatc agtgg      415
<210>41
<211>554
<212>DNA
<213>小麦(Triticum aestivum)
<220>
<221>misc_feature
<222>(104)..(355)
<223>细胞色素b-559编码序列
<400>41
tctcacaagg aatgaaatat cagtaatttt ctatttactg gtcgatccca tcttttacgg 60
aatcaattcc tttttgaatg tacaaaaatt ttgggagttc agcatgtctg gaagcacggg 120
agaacgttct tttgctgata ttattaccag tattcgatac tgggttattc atagcattac 180
tataccttcc ctattcattg cgggttggtt atttgtcagt acgggtttag cttatgacgt 240
gtttggaagt cctaggccaa acgagtattt cacggaaagc cgacaaggaa ttccgttaat 300
aaccgaccgt tttgattctt tagaacaact cgatgaattt agtagatcct tttaggaggc 360
cctcaatgac catagatcga acctatccta tttttacagt gcgatggctg gctattcacg 420
gactagctgt acctactgtt tttttcttgg gatcaatatc agcaatgcag ttcatccaac 480
gataaaccaa attccaacta tagaactatg acacaatcaa acccgaatga acaaaatgtt 540
gaattgaatc gtag                                                   554
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：WCP2
<400>42
cagtgcgatg gctggctatt                                             20
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：WCP3
<400>43
cgttggatga actgcattgc t                                           21
<210>44
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：WCP1
<400>44
acggactagc tgtacctact gtttttttct tgggatc                          37

Claims (12)

1.寡核苷酸引物，其选自SEQ ID NOs：3、4、6、8-23、25-26、28和30。
2.寡核苷酸引物对，其中至少一个所述引物是权利要求1的寡核苷酸引物。
3.根据权利要求2的寡核苷酸引物对，其中所述引物对由SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18组成。
4.根据权利要求2的寡核苷酸引物对，其中所述引物对由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8组成。
5.检测真菌病原体的方法，包括：
(a)从感染病原体的植物叶中分离DNA；
(b)采用至少一个根据权利要求1的引物将所述DNA进行聚合酶链式反应扩增；和
(c)通过显现所述聚合酶链式反应扩增的产物，检测所述真菌病原体。
6.权利要求5的方法，其中所述真菌病原体选自Tapesia yallundae和Tapesia acuformis。
7.检测真菌病原体的方法，包括：
(a)从感染所述真菌病原体的植物组织中分离DNA；
(b)采用所述DNA作为模板在聚合酶链式反应中以根据权利要求2的引物对扩增所述真菌病原体的部分内部转录间隔区序列；和
(c)通过显现该扩增的部分内部转录间隔区序列，检测所述真菌病原体。
8.权利要求7的方法，其中所述真菌病原体选自Tapesia yallundae和Tapesia acuformis。
9.用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其含有权利要求1的引物。
10.用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其含有权利要求2的引物对。
11.根据权利要求3的寡核苷酸引物对与具有SEQ ID NO：24之序列的寡核苷酸探针的组合。
12.根据权利要求4的寡核苷酸引物对与具有SEQ ID NO：7之序列的寡核苷酸探针的组合。
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