JP2003506066A - Ｔａｐｅｓｉａｙａｌｌｕｎｄａｅ及びＴａｐｅｓｉａａｃｕｆｏｒｍｉｓの、ＰＣＲに基づく検出および定量 - Google Patents

Ｔａｐｅｓｉａｙａｌｌｕｎｄａｅ及びＴａｐｅｓｉａａｃｕｆｏｒｍｉｓの、ＰＣＲに基づく検出および定量

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JP2003506066A
JP2003506066A JP2001515323A JP2001515323A JP2003506066A JP 2003506066 A JP2003506066 A JP 2003506066A JP 2001515323 A JP2001515323 A JP 2001515323A JP 2001515323 A JP2001515323 A JP 2001515323A JP 2003506066 A JP2003506066 A JP 2003506066A
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ジョーゼフ ベック，ジェイムズ
ジェイスン バーネット，チャールズ
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Abstract

(57)【要約】 Tapesia yallundaeおよびTapesia acuformisの、PCRに基づく検出および定量本発明は、Tapesia yallundae(Pseudocercosporella herpotrichoides W型と同義)およびTapesia acuformis(Pseudocercosporella herpotrichoides R型と同義)の検出のためのTaqMan(登録商標)定量的PCR検定における使用のためのプライマーおよびプローブを提供する。本発明はさらに、小麦DNAの検出のためのTaqMan(登録商標)定量的PCR対照検定に使用するためのプライマーおよびプローブを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、Tapesia yallundae(Pseudocercosporella herpotrichoides W型と
同義)およびTapesia acuformis(Pseudocercosporella herpotrichoides R型と同
義)の検出のためのTaqMan(登録商標)定量的PCR検定におけるプライマーおよびプ
ローブの使用に関するものである。これらの検定の使用は、特定の真菌病原体の
検出と、植物集団中でのそれらの定量を可能にする。さらに本発明は、内因性反
応対照として使用するための宿主小麦DNAの検出のための、TaqMan(登録商標)定
量的PCR検定におけるプライマーおよびプローブの使用に関するものである。
【０００２】 植物の疾病は年々相当な収穫減損を招いており、その結果、農業家に経済的損
失をもたらし、そして世界の数多くの地域で地域住民の栄養供給の不足をもたら
している。殺真菌薬の広範な使用は植物病原体の攻撃に対してかなりの防護手段
を提供してきた。しかしながら、殺真菌薬に対する十億ドルの消費にも拘わらず
、1981年の全世界の収穫損失は、収穫のおよそ10%になった(James、1981; Seed
Sci.& Technol. 9:679-685)。
【０００３】 疾病の破壊的プロセスの重篤度は、病原体の攻撃性および宿主の反応に依存す
る。殆どの植物育種プログラムの一つの目的は、疾病に対する宿主植物の耐性を
増大させることである。典型的には、異なる種の病原体は同一作物種の異なる変
種と特異に相互作用し、宿主耐性の多くの供給源は、特定の病原体種に対する防
護をするに過ぎない。さらに、幾つかの病原体種は、疾病症状の初期徴候を示し
はするが、作物に殆ど被害を惹起しない。JonesおよびClifford(1983；Cereal D
iseases、John Wiley)は、宿主である栽培変種に耐性を導入したことに応答して
、病原体集団にその病原体の悪性型が現れると予想されること、そしてそれ故、
病原体集団の監視が必要であることを報告している。加えて、特定の殺真菌薬に
耐性の真菌株が進化した、幾つかの報告症例がある。早くも1981年に、Fletcher
およびWolfe(1981；Proc. 1981 Brit.Crop Prot.Conf.)は、春大麦由来のウドン
コ病集団の24%、そして冬大麦由来のウドンコ病集団の53%が、殺真菌薬トリアジ
メノールに対する応答においてかなりの変異を示すこと、そしてこれらの集団の
分布は変種間で相違し、最も感受性の高い変種もまた、より感受性の低い型のう
ちで最も高い発生数を与えるということを主張した。殺真菌薬に対する真菌の感
受性における同様の変異は、小麦ウドンコ病(これもまたトリアジメノールに対
して)、Botrytis(ベノミルに対して)、Pyrenophora(有機水銀に対して)、Pseudo
cercosporella(MBC型殺真菌薬に対して)およびトリアゾール類に対するMycospha
erella fijiensisについて報告されており、これらはほんの一例に過ぎない(Jon
esおよびClifford；Cereal Diseases、John Wiley、1983)。
【０００４】 穀物種は全世界で栽培されており、世界の食物生産の主たる部分をなしている
。多くの病原体によって収穫の損失が招かれているが、ヨーロッパおよび北アメ
リカの主要穀物栽培地域では、壊死病原体SeptoriaおよびPseudocercosporella
が特に重要である(JonesおよびClifford；Cereal Diseases、John Wiley、1983)
。特に、これらの真菌の異なる単離物および種によって引き起こされる様々な症
候は、疾病による損失の可能性を正確に予測決定することを困難にしている。し
たがって、特定の病原体の迅速且つ正確な同定のための改良診断技術の利用可能
性が、現場の病理学者にとってかなり有用となる。
【０００５】 小麦のeyespotは、病原体Tapesia acuformisおよびTapesia yallundaeによっ
て引き起こされる。これらはかつて同じ種Pseudocercosporella herpotrichoide
s(Fron) Deightonの変種であると考えられていた。小麦、ライ麦、オート麦およ
びその他のイネ科草本はeyespot病に罹患し易く、これは冷涼で湿潤な気候で発
生し、ヨーロッパ、北および南アメリカ、アフリカおよびオーストラリアで流行
している。小麦は最も感受性の高い穀物種であるが、他の穀物に対して悪性であ
る単離菌もまた同定されている。例えば、この真菌のR菌株(Tapesia acuformis)
はライ麦からも単離されており、小麦上で、小麦から単離されたW菌株(Tapesia
yallundae)よりもゆっくりと増殖する。eyespotは植物の基稈に限定され、腋芽
または植物を直ちに殺滅し得る。しかしながら、lodgingを招きそして／または
穀粒のサイズおよび数の低下をもたらすのが、より普通である。eyespotに伴う
収量の損失は、Septoria triticiおよびSeptoria nodorumに伴う損失よりさらに
大きい。eyespotを制御する典型的な手段は、節間を強化する成長調節剤による
処置、および殺真菌薬処置を包含する。しかしながら、異なる真菌菌株に対する
栽培品種の感受性の相違は、殺真菌薬による処置の有効性の予測を困難にしてい
る。
【０００６】 上記のことに鑑み、真菌病原体の特定の種を、感染プロセスの初期に同定可能
とする技術の開発が真に必要とされている。農作物の植生で疾病症状が明白とな
る前に病原体の特定の種を同定することによって、農学者は、同定された作物変
種でのその病原体のさらなる発達で起こりそうな影響を評価でき、また、殺真菌
薬の適用が必要であると考えられる場合は適切な殺真菌薬を選択することができ
る。
【０００７】 TaqMan(登録商標)化学およびABI7700(Perkin Elmer、Applied Biosystems Div
ision、フォスターシティー、CA)は、DNAとRNAの正確な再現性ある定量検定を行
う手段を提供する。TaqMan(登録商標)化学の基礎はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
である。常套的なPCR検定では、目的とするDNA配列の5’および3’末端に対し相
補的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。加熱サイクルの間に、DNAが
まず熱変成する。次いで試料をアニーリングおよび伸長温度とし、ここでプライ
マーはそれらの特異的相補体と結合し、Taqポリメラーゼによるヌクレオチド三
燐酸の添加により伸長する。反復的な加熱サイクルにより、鋳型DNAの量は増幅
する。
【０００８】 TaqMan(登録商標)化学では、PCRアンプリコン内のプライマーの間にある配列
領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドプローブを設計する。このプローブは、
5’末端に蛍光リポーター色素を、そして3’末端に消光剤色素を含んでいる。プ
ローブが無傷である時、蛍光の放出は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の現象によ
って止む。加熱サイクルの間にこのプローブは、一方のプライマーの下流にある
標的DNAとハイブリダイズする。TaqMan(登録商標)化学は、蛍光色素をプローブ
から開裂させるTaqポリメラーゼの5’エキソヌクレアーゼ活性に依拠している。
PCR生成物が蓄積するにつれて蛍光シグナルは増強する。このシグナルを測定す
ることにより、増幅した生成物を定量することができる。病原体DNAを標的とす
ることにより、この方法は疾病圧力の定量を可能にする。PCRプライマーと協力
して、このプローブは、病原体を識別する検定で別のレベルの特異性を提供する
。
【０００９】 したがって本発明は、 配列番号3-6、8-23、25-26、28、30、42および43より成る群から選ばれる、と
りわけ該プライマーが配列番号3-6、8-23、25-26、28および30より成る群から選
ばれる、オリゴヌクレオチドプライマー、 ・ プライマーのうち少なくとも一方が前記のオリゴヌクレオチドプライマー
である、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、 ・ その対が、配列番号14と配列番号18または配列番号3と配列番号8で構成さ
れる、前記のオリゴヌクレオチドプライマーの対、 ・ 該プライマーが配列番号42および43より成る群から選ばれる、前記のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、 ・ プライマーのうち少なくとも一方が配列番号42および43で構成されるオリ
ゴヌクレオチドプライマーである、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、 ・ その対が、配列番号42および配列番号43で構成される、一対のオリゴヌク
レオチドプライマー、 を提供する。
【００１０】 本発明はさらに、 ・ 真菌病原体、特にTapesia yallundaeおよびTapesia acuformisの検出のた
めの方法であって、 (a) 病原体に感染した植物の葉からDNAを単離し； (b) このDNAを、本発明に係る少なくとも1個のプライマーを用いるポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅に付し；そして、 (c) このポリメラーゼ連鎖反応増幅の生成物または生成物群を視覚化するこ
とにより、当該真菌病原体を検出する、 ことを含む方法、 ・ 真菌病原体、特にTapesia yallundaeおよびTapesia acuformisの検出のた
めの方法であって、 (a) この真菌病原体に感染した植物組織からDNAを単離し； (b) この真菌病原体の内部転写スペーサー配列の一部を、該DNAを鋳型として
用いて、請求項3に記載の一対のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応で増
幅し；そして、 (c) 内部転写スペーサー配列の増幅部分を視覚化することにより、当該真菌
病原体を検出する、 ことを含む方法、 を提供する。
【００１１】 さらに本発明は、前記のプライマーを含む、真菌病原体の検出に使用する診断
キットを提供する。
【００１２】 さらに本発明は、 (a) 病原体に感染した小麦組織からDNAを単離し； (b) このDNAを、本発明に係る一対のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反
応増幅に付し；そして、 (c) このポリメラーゼ連鎖反応増幅の生成物または生成物群を視覚化するこ
とにより、当該小麦DNAを検出する、 ことを含む、小麦DNAの検出のための方法を提供する。
【００１３】 さらに、本発明は、真菌の内部転写スペーサー配列の、増幅に基づく検出に使
用するための、オリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブが、 (a) Tapesia yallundaeのITS1、Tapesia yallundaeのITS2、Tapesia acuform
isのITS1およびTapesia acuformisのITS2より成る群から選ばれる配列の少なく
とも10の連続するヌクレオチドに対し相補的なヌクレオチド配列； (b) 該ヌクレオチド配列の5’末端の蛍光リポーター色素；および、 (c) 該ヌクレオチド配列の3’末端の消光剤色素、 を含む、オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００１４】 本発明はさらに、前記のようなオリゴヌクレオチドプローブであって、該ヌク
レオチド配列が、配列番号37のヌクレオチド31-263、配列番号37のヌクレオチド
420-570、配列番号38のヌクレオチド31-262、および配列番号38のヌクレオチド4
19-568より成る群から選ばれる配列の、少なくとも10の連続するヌクレオチドに
対し相補的である［ここで、特に当該ヌクレオチド配列は、配列番号7、配列番
号24、配列番号27、および配列番号29より成る群から選ばれる］、オリゴヌクレ
オチドプローブを提供する。
【００１５】 本発明はさらに、小麦DNAの、増幅に基づく検出に使用するための、オリゴヌ
クレオチドプローブ［ここでこのプローブは、 (a) 配列番号41または配列番号44の少なくとも10の連続するヌクレオチドに
対し相補的なヌクレオチド配列； (b) 該ヌクレオチド配列の5’末端の蛍光リポーター色素；および、 (c) 該ヌクレオチド配列の3’末端の消光剤色素、 を含む］を提供する。
【００１６】 本発明はさらに、真菌DNAを定量するためのオリゴヌクレオチドプライマー対
／プローブセット［ここで該プライマー対は、本発明に係るプライマーの対で構
成され、プローブは、配列番号24、配列番号7または配列番号44である］を提供
する。
【００１７】 本明細書および請求項の明瞭且つ首尾一貫した理解を確実とするため、以下の
定義を提供する： 遺伝子：これは、コード化配列がRNA、例えばmRNA、rRNA、tRNA、snRNA、セン
スRNAまたはアンチセンスRNAに転写される、コード化配列および付随の調節配列
を指す。調節配列の例は、プロモーター配列、5’および3’非翻訳配列および終
止配列である。存在し得るさらなる要素は、例えばイントロンである。
【００１８】 一致：配列一致のパーセンテージは、動的プログラミングアルゴリズムに基づ
くコンピュータープログラムを用いて決定する。本発明の範囲内で好ましいコン
ピュータープログラムは、質問が蛋白であるかDNAであるかに拘わらず、利用可
能な全ての配列データベースを探索するよう設計された、BLAST(Basic Local Al
ignment Search Tool)探索プログラムを包含する。この探索手段のバージョンBL
AST 2.0(Gapped BLAST)は、インターネット上で一般に利用可能とされている(現
在、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。これは、包括的並置とは対照的に
部分的並置を探索する発見的アルゴリズムを使用しており、故に、孤立した領域
のみを共有する配列間の関係を検出できる。BLAST探索に割り当てられた評点は
、良好に定義された統計学的解釈を有する。このプログラムは、好ましくはデフ
ォルト値に対して設定した自由選択パラメータを用いて作動させる。
【００１９】 植物：これは、任意の植物、特に種子植物を指す。
【００２０】 植物材料：これは、葉、茎、根、花もしくは花の一部、果実、花粉、花粉管、
胚珠、胚嚢、卵子、接合子、胚、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養、または
植物のその他任意の部分もしくは生成物を指す。
【００２１】 本発明から、異なる種の植物病原性真菌の同定および定量方法が導かれる。本
発明は、TaqMan(登録商標)定量的PCR検定に有用なプライマーおよびプローブDNA
配列を提供する。このようなDNA配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびTaqM
an(登録商標)に基づく診断検定に使用されることから、本発明方法において有用
である。これらのプライマーは、DNA鋳型が特異的真菌病原体によって提供され
るPCR反応において、ユニークなフラグメントを生成する。TaqMan(登録商標)プ
ローブのハイブリダイゼーションと組み合わせると、これらを用いて、疾病症状
が発現する前に、宿主植物材料中の特異的病原体を検出および定量することがで
きる。
【００２２】 好ましい態様において、本発明は、Tapesia yallundae(Pseudocercosporella
herpotrichoides W型と同義)およびTapesia acuformis(Pseudocercosporella he
rpotrichoides R型と同義)の検出のための、ITS由来診断プライマーおよびTaqMa
n(登録商標)プローブを提供する。
【００２３】 本発明は、特定の農作物の変種-病原体菌株の関係における損害の可能性の評
価、および、利用し得る多様な殺真菌薬の蓄積を賢明に利用する可能性を提供す
る。さらに本発明を用いて、広大な地理的領域にわたる特定の病原体種の発達と
広がりに関する詳細な情報を提供することができる。本発明は、与えられた農作
物への疾病圧力の定量法を提供する。
【００２４】 本発明の実施において有用なキットもまた提供される。このキットは、真菌病
原体Tapesia yallundaeおよびTapesia acuformisの同定および定量に特別な用途
を見出す。
【００２５】 配列表の配列の簡単な説明 配列番号1-34は、真菌病原体Tapesia yallundaeおよびTapesia acuformisのPC
Rに基づく検出に有用な、以下のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー
である：
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】 配列番号35は前進配列決定プライマーである。
【００３０】 配列番号36は逆配列決定プライマーである。
【００３１】 配列番号37は、5’から3’の向きに、小サブユニットrRNA遺伝子の3’末端(ヌ
クレオチド1-30)、内部転写スペーサー1(ヌクレオチド31-263)、5.8 S rRNA遺伝
子(ヌクレオチド264-419)、内部転写スペーサー2(ヌクレオチド420-570)、およ
び大サブユニットrRNA遺伝子の5’末端(ヌクレオチド571-627)を含む、Tapesia
acuformis(P.herpotrichoides R型と同義)、NRRL受理番号B-21234の内部転写ス
ペーサーのDNA配列である。
【００３２】 配列番号38は、5’から3’の向きに、小サブユニットrRNA遺伝子の3’末端(ヌ
クレオチド1-30)、内部転写スペーサー1(ヌクレオチド31-262)、5.8 S rRNA遺伝
子(ヌクレオチド263-418)、内部転写スペーサー2(ヌクレオチド419-569)、およ
び大サブユニットrRNA遺伝子の5’末端(ヌクレオチド570-626)を含む、Tapesia
yallundae(P.herpotrichoides W型と同義)、NRRL受理番号B-21231の内部転写ス
ペーサーのDNA配列である。
【００３３】 配列番号39は、Tapesia acuformisに感染した3つの異なる場所(Barton、Elmdo
n、Teversham)由来の小麦抽出物からPCR増幅した部分的ITS領域のコンセンサスD
NA配列であって、5’から3’の向きに、部分的内部転写スペーサー1配列、5.8 S
rRNA遺伝子、および部分的内部転写スペーサー2配列を含む。 配列番号40は、Tapesia yallundaeに感染した3つの異なる場所(Barton、Elmdo
n、Teversham)由来の小麦抽出物からPCR増幅した部分的ITS領域のコンセンサスD
NA配列であって、5’から3’の向きに、部分的内部転写スペーサー1配列、5.8 S
rRNA遺伝子、および部分的内部転写スペーサー2配列を含む。
【００３４】 配列番号41は、小麦葉緑体DNA中のシトクロムb-559の遺伝子のヌクレオチド配
列である(Hird, et al.、Mol.Gen.Genet. 203:95-100(1986))。
【００３５】 配列番号42-44は、小麦葉緑体DNAのPCRに基づく検出にとって有用な以下のオ
リゴヌクレオチドプライマーおよびプローブである：
【００３６】
【表４】
【００３７】 本発明は、植物病原性真菌の、異なる病原型の同定および定量において有用な
、ユニークなDNA配列を提供する。特にこのDNA配列は、真菌病原型の同定のため
のTaqMan(登録商標) PCRに基づく分析のプライマーとして使用できる。本発明に
係るDNA配列は、特定の病原体を同定できる、特定の真菌病原体のリボソームRNA
遺伝子領域の内部転写スペーサー(ITS)配列から誘導したプライマーおよびプロ
ーブを包含する。或る病原体の種または属の中の異なる病原型由来のITS DNA配
列(これはその種または属の、異なる成員の間で相違している)を使用して、それ
らの特異的成員を同定することができる。
【００３８】 生物医学研究者等は、かつてPCRに基づく技術を使用し、感染動物組織中の病
原体の検出にまずまずの成功を収めてきた。しかしながら、この技術が植物病原
体の検出に応用されたのはごく最近のことである。感染した小麦中のGaumannomy
ces graminisの存在が、この病原体のミトコンドリアゲノムに特異的な配列のPC
Rを用いて検出され(Schlesser et al.、1991；Applied and Environ.Microbiol.
57:553-556)、無作為に増幅された多型性DNA(即ちRAPD)マーカーが、多くの種
のGremmeniella abietina、針葉樹のscleroderris根瘤病の原因菌を識別できた
。米国特許第5585238号(引用によりその全体を本明細書の一部とする)は、Septo
ria、Pseudocercosporella、およびMycosphaerellaの菌株のリボソームRNA遺伝
子領域のITS配列から誘導したプライマーと、PCRに基づく技術を用いたこれらの
真菌単離物の同定におけるそれらの使用を記載している。加えて、WO95/29260(
引用によりその全体を本明細書の一部とする)は、Fusariumの菌株のリボソームR
NA遺伝子領域のITS配列から誘導したプライマーと、PCRに基づく技術を用いたこ
れらの真菌単離物の同定におけるそれらの使用を記載している。さらに、米国特
許第5800997号(引用によりその全体を本明細書の一部とする)は、Cercospora、H
elminthosporium、Kabatiella、およびPucciniaの菌株のリボソームRNA遺伝子領
域のITS配列から誘導したプライマーと、PCRに基づく技術を用いたこれらの真菌
単離物の同定におけるそれらの使用を記載している。
【００３９】 リボソーム遺伝子は、その高いコピー数の故に、分子プローブ標的としての使
用に適している。成熟rRNA配列間の高い保存性にもかかわらず、非転写および転
写スペーサー配列は通常あまり保存されておらず、したがって最近の進化の分岐
を検出するための標的配列として好適である。真菌rRNA遺伝子はユニットで組織
されており、その各々が18S(小サブユニット)、5.8S、および28S(大サブユニッ
ト)という三つの成熟サブユニットをコードしている。これらのサブユニットは
、300bp前後の二つの内部転写スペーサー、ITS1およびITS2で隔てられている(Wh
ite et al.、1990；PCR Protocols；Innes et al.編；315-322頁)。加えて、転
写ユニットは非転写スペーサー配列(NTS)により隔てられている。ITSおよびNTS
配列は、異なる真菌病原体の特異的病原型の検出に特に好適である。本発明に係
るDNA配列は、特定の植物病原体のリボソームRNA遺伝子領域の内部転写スペーサ
ー配列由来のものである。或る病原体の種または属の中の異なる病原型由来のIT
S DNA配列は、その種または属の、異なる成員の間で相違している。或る病原体
のITS配列を決定したならば、これらの配列を別のITS配列と並置することができ
る。このようにして、そのITS配列からプライマーを誘導することができる。即
ち、真菌病原型の配列間で最も大きな相違を含むITS配列の内部の領域に基づい
てプライマーを設計できる。これらの配列と、これらの配列に基づくプライマー
を用いて特異的病原体を同定することができる。
【００４０】 ITS配列から誘導される代表的オリゴヌクレオチドプライマーの配列を配列番
号1-34に開示する。この配列は、目的とする病原体の、定量的なTaqMan(登録商
標)PCRに基づく同定にその用途を見いだせる。
【００４１】 PCR分析における、本発明に係るプライマー配列の使用方法は、当分野でよく
知られている。例えば、米国特許第4683195および4683202号、ならびにSchlesse
r et al.(1991) Applied and Environ. Microbiol. 57:553-556を参照されたい
。さらに、PCR増幅を使用してVerticillium albo-atrumおよびVerticillium dah
liaeのITS領域の相違を開拓し、それにより二つの種を識別した、Nazar et al.(
1991；Physiol. and Molec.Plant Pathol. 39:1-11)；および、同様の技術を使
用してバナナの病原体Mycosphaerella fijiensisおよびMycosphaerella musicol
aを識別した、JohansonおよびJeger(1993；Mycol.Res. 97:670-674)をも参照さ
れたい。
【００４２】 TaqMan(登録商標)法は近年、宿主動物中の寄生微生物の検出のため、獣医学に
おいて(J.Clin.Microbiol. 37(5):1329-31(1999年5月))臨床試料中の単純ヘルペ
スウイルス(HSV)DNAの定量的検出のための医学研究に使用されており(J.Clin.Mi
crobiol. 37(6):1941-7(1999年6月))、そして、牛挽肉を細菌性病原体について
スクリーニングする際に有用であることが示されている(Appl.Envir.Micro. 62(
4):1347-1353(1996年4月))。TaqMan(登録商標)法が作物植物中の真菌病原体の同
定および／または定量に使用されたのはごく最近のことである(Phytopathology
89(9):796-804(1999)。
【００４３】 本発明に係るITS DNA配列は、当分野で既知の方法により真菌病原体からクロ
ーニングできる。一般に、真菌単離物からDNAを単離する方法は既知である。Rae
derおよびBroda(1985) Letters in Applied Microbiology 2:17-20；Lee et al.
(1990) Fungal Genetics Newsletter 35:23-24；ならびにLeeおよびTaylor(1990
)：PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications、Innes et al.(編)
；282-287頁を参照されたい。異なる種および／または菌株を識別するためのTaq
Man(登録商標)PCR検定での試験に有用であると思われる相違を位置決定するため
、ITS配列を、各病原体群の中で比較する。相違の同定から、各々のプローブに
ついて多数のプライマーを合成し、TaqMan(登録商標)検定で試験する。TaqMan(
登録商標)検定に使用する鋳型は、最初は、精製した病原体DNAである、その後は
、感染した宿主植物組織から単離したDNAである。したがって、診断性の、即ち
或る特定の病原体の種または菌株は同定するが、同じ病原体の別の種または菌株
は同定しない、プローブ-プライマーの組み合わせを同定することが可能である
。
【００４４】 好ましいプライマー-プローブの組み合わせは、感染した宿主組織、即ち、特
定の病原体種または菌株にかつて感染した宿主組織の、異なる種または菌株を区
別することができる。本発明は、Tapesia yallundaeおよびTapesia acuformisの
ためのこの基準を満たす、数多くのプライマー-プローブの組み合わせを提供す
る。本発明に係るプライマーおよびプローブは、真菌ITS領域間の配列相違に基
づいて設計する。配列間の最小限1塩基対の相違が、識別的プライマーまたはプ
ローブの設計を可能にできる。特異的真菌病原体のITS領域に対して設計したプ
ライマー-プローブの組み合わせは、リボソーム遺伝子コード化領域内の保存配
列領域に対して作製したプライマーまたはプローブと組み合わせて使用し、種特
異的PCRフラグメントの増幅を検出することができる。一般にプライマーは、良
好な感度を達成するために59℃付近の理論的融解温度(TM)を持たねばならず、ま
た、著しい二次構造およびプライマー組み合わせ間の3’部分重複があってはな
らない。プライマー対のTMは、典型的には互いのTMの2℃以内にある。プライマ
ーは一般に、ITS1またはITS2の少なくとも約5-10の連続するヌクレオチド塩基と
の配列一致を有する。好ましい態様では、プライマーはおよそ5-30ヌクレオチド
塩基長のいずれかである。プローブは一般に、プライマーより10℃高いTMを有す
るよう設計する。小麦抽出物は全て、存在する真菌病原体DNAと共に、宿主小麦
のDNAを含んでいる。したがって、試料抽出物間の相違を説明するための小麦DNA
を標的とする内因性対照検定を抽出物に対して実施できる。本発明は、シトクロ
ムb-559遺伝子を標的とする対照検定を説明している。シトクロムb-559遺伝子は
、宿主植物の生命にとって必要な、小麦の変種間で保存されている遺伝子である
。これらの対照検定が、偽陰性に対する対照を提供する。即ち、PCR反応の阻害
に帰することのできる、真菌DNAに関する陰性の結果が、内因性対照検定によっ
て立証される。これらの対照検定はさらに標的を提供し、この標的に対して真菌
DNA量が、試料対試料の比較のために標準化される。本発明は、真菌病原体検定
とは別個の反応および複合的反応におけるこれら対照検定の使用を記載している
。本発明は、このプロセスの実施に必要な要素を含む「キット」の製造に容易に
役立つ。このようなキットは、管またはバイアルのような1またはそれ以上の容
器を、密に閉じこめて収容する、区画に分けた担体を含むことができる。この容
器のうち一つは、非標識の、または検出できるよう標識した、DNAプライマーを
含むことができる。標識したDNAプライマーは凍結乾燥型で、または必要に応じ
て適当な緩衝液中に存在させることができる。1またはそれ以上の容器は、TaqMa
n(登録商標)PCR反応に利用する1またはそれ以上の酵素または試薬を含み得る。
これらの酵素はそれ自身のみで、または混合物として存在し得、凍結乾燥型また
は適当な緩衝液中に存在し得る。最後に、このキットは、本発明に係る技術の実
施に必要なさらなる要素の全て、例えば緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、平
板、核酸、ヌクレオシド三燐酸、濾紙、およびその他の消耗品等を含むことがで
きる。
【００４５】 以下の実施例は、適切なプライマーおよびプローブ配列の選択に使用できる典
型的実験プロトコル、選択的および診断的有効性のためのプライマーおよびプロ
ーブの試験、ならびに疾病および真菌単離物の検出および定量のための係るプラ
イマーおよびプローブの使用を示すものである。このような実施例は、限定のた
めではなく例示のために提供するものである。
【００４６】 実施例 本明細書で使用する標準的組換えDNAおよび分子クローニング技術は当分野で
周知であり、J.Sambrook、E.F.FritschおよびT.Maniatis、Molecular cloning:A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbor laboratory、コールドスプリングハ
ーバー、NY(1989)ならびにT.J.Silhavy、M.L.Berman、およびL.W.Enquist、Expe
riments with Gene Fusions、Cold Spring Habor Laboratory、コールドスプリ
ングハーバー、NY(1984)ならびにAusubel,F.M. et al.、Current Protocols in
Molecular Biology、Greene Publishing Assoc.およびWilley-Interscience(198
7)出版、に記載されている。
【００４７】 実施例1：真菌単離物および真菌ゲノムDNA抽出 第1表は、使用した真菌試験単離物およびそれらの供給源のリストを示す。真
菌は、PDA(馬鈴薯デキストロース寒天)培地由来の菌糸フラグメントを接種した
馬鈴薯デキストロースブロス150mL中で生育させる。培養は軌道振盪機上、28℃
で7-11日間インキュベートする。これとは別に、菌糸をPDA平板から直接単離す
る。菌糸を遠心分離によりペレット化し、次いで液体窒素中で粉砕し、Leeおよ
びTaylorのプロトコル(1990；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applicat
ions；Innes et al.編；282-287頁)を用いて全ゲノムDNAを抽出する。
【００４８】
【表５】
【００４９】
【表６】
【００５０】 実施例2：小麦の茎組織からのDNA抽出 小麦の茎組織(第2表に明記)から以下のようにDNAを抽出する： (1) 清浄な面に25個までの小麦試料を置く。滅菌したメスを用いて茎を、第
一腋芽または根のすぐ上で切断する。この切断の4cm上にもう一つの切断を施す
。この4cmの切片が茎組織試料を構成し、これを、バルク離解のため、さらなる
小麦試料と共にプールする。
【００５１】 (2) 茎試料をBioreba(Reinach、スイス)の丈夫なポリ袋(cat#490100)に入れ
る。試料を入れたポリ袋から風袋(ポリ袋の重量)を差し引いて、この植物組織を
秤量する。
【００５２】 (3) 小麦組織重量(g)当たり等体積(mL)のミュラー抽出緩衝液(0.1%w/v Tween
-80；0.040M Tris塩基；0.15M塩化ナトリウム；0.1%w/v牛血清アルブミン(Pente
x Fraction V)；0.01%w/vアジドナトリウム；0.20M EDTA；pH7.7とし、4℃で保
存)を加える。70に設定したBioreba Homex 6ホモジナイザーを用いて組織を離解
する。この組織を繊維状となるまで粉砕する。
【００５３】 (4) 抽出液を氷上のエッペンドルフ管中にアリコート化する。
【００５４】 (a) 抽出物を5分間煮沸する。
【００５５】 (b) 煮沸した抽出物を氷上に保持する。煮沸した抽出物を12000xGで5分間遠
心分離する。
【００５６】 (c) 遠心分離した抽出物から、dH2Oで上清の1:20希釈液を作製する。
【００５７】 (d) 希釈抽出液を使用時まで氷上で保存する。
【００５８】
【表７】
【００５９】
【表８】
【００６０】
【表９】
【００６１】 実施例3：Tapesia yallundaeおよびTapesia acuformisに感染した小麦試料由
来の内部転写スペーサー(ITS)領域DNAの単離および配列決定 およそ420bpの末端切除ITS領域フラグメントを、Tapesia yallundaeに特異的
なプライマーJB537(配列番号31)およびJB541(配列番号32)を用いてTapesia yall
undaeに感染させた第2表に明記の小麦抽出物からPCR増幅する。同様に、Tapesia
acuformis末端切除ITSフラグメントを、Tapesia acuformis特異的プライマーJB
540(配列番号33)およびJB542（配列番号34）を用いてTapesia acuformis感染小
麦抽出物から増幅する。各200μMのdTTP、dATP、dCTP、およびdGTP、50pmolの各
プライマー、2.5単位のTaqポリメラーゼおよび1μLの1:10希釈小麦抽出物を含有
する、最終体積50μLの50mM KCl、2.5mM MgCl2、10mL Tris-HCl、pH8.3を使用す
るPerkin-ElmerのGeneAmpキット(フォスターシティー、CA；part no. N808-0009
)により、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する。反応は、Perkin-Elmer Model 9700
サーマルサイクラー中、94℃15秒間および1分間75℃で35サイクル実施する。
【００６２】 このPCR生成物を、TOPO-TAクローニングキット(Invitrogen、カールスバッド
、CA；part no.K4550-40)を使用し、製造者の指示に従ってpCR(登録商標)2.1-TO
PO TA-クローニングベクター中にクローニングする。ITSフラグメント挿入物を
含むクローンを、TAクローニングベクターのFORWARD(5’-gtaaaacgacggccagt-3
’；配列番号35)およびREVERSE(5’-caggaaacagctatgac-3’；配列番号36)プラ
イマーを用いて配列決定する。配列決定は、ABI PRISM 377(登録商標)DNAシーク
エンサー(Perkin Elmer Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォル
ニア)上で実施する。
【００６３】 実施例4：オリゴヌクレオチドの合成および精製 オリゴヌクレオドおよびTaqMan(登録商標)プローブ(プライマーおよびプロー
ブ)は、例えばIntegrated DNA Technologies(コラルヴィル、IA)またはMidland
Certified Reagent Company(ミッドランド、テキサス)のいずれかによって合成
および精製される。
【００６４】 実施例5：種特異的プライマーおよびプローブの選択 実施例3に記載のように感染小麦組織から取得したTapesia yallundae(配列番
号40)およびTapesia acuformis(配列番号39)のITS領域コンセンサス配列で、複
数の配列並置を作製する。この並置には、米国特許第5585238号に引用されたTap
esia yallundaeおよびTapesia acuformis真菌DNA由来のITS領域配列も含まれて
いる。PCRプライマーおよびTaqMan(登録商標)プローブは、この真菌種間の配列
中、最大の相違を含む領域に対して設計する。これにより、Tapesia acuformis
またはTapesia yallundaeのいずれかに対し特異的であるよう設計されたプライ
マーおよびプローブが作られる。下記の第3表および第4表に示すオリゴヌクレオ
チドプライマーおよびプローブは実施例4に従って合成する。かつて記載された(
米国特許第5585238号)Tapesia yallundae特異的プライマーJB537(配列番号31)お
よびJB541(配列番号32)、ならびにTapesia acuformis特異的プライマーJB540(配
列番号33)およびJB542(配列番号34)もまた合成する。さらに、White et al.(199
0：PCR Protocols；Innes et al.編315-322頁)の公表したリボソーム遺伝子特異
的プライマーITS1(配列番号1)およびITS4(配列番号2)を、これらのITS領域に特
異的なプライマーと組み合わせて試験するために合成する。
【００６５】
【表１０】
【００６６】
【表１１】
【００６７】
【表１２】
【００６８】
【表１３】
【００６９】 実施例6：プライマー-プローブライブラリーの最初のスクリーニング 実施例5で設計した種特異的プライマーライブラリーを、最初のTaqMan(登録商
標)スクリーニングで試験する。プライマーとプローブの組み合わせを、標的病
原体のDNAから増幅するそれらの能力について試験する。他の全ての反応条件は
一定に保つ(1X TaqMan(登録商標) Universal Master Mix(Perkin Elmer、ノルウ
ォーク、CT；part no. N430-4447)、200nMの各プライマー、100nMのプローブ、0
.04ng/μLの真菌標的ゲノムDNA、加熱サイクル：50℃2分間、95℃10分間、40サ
イクルの95℃15秒間、60℃60秒間)。病原体特異的プライマーおよびプローブを
、標的DNAを最も良好に増幅するものを同定することによって決定する。
【００７０】 実施例7：TaqMan(登録商標)プライマーの最適化 標的病原体のDNAに特異的なプライマー対が同定されたなら、このプライマー
濃度を1回のTaqMan(登録商標)実施で最適化する。前進プライマーの、異なる濃
度のマトリックスを、逆プライマーのそれに対して、他の全ての反応条件を一定
に保ちつつ実施する(1X TaqMan(登録商標) Universal Master Mix(Perkin Elmer
)、100nMプローブ、0.4ng/μL真菌標的ゲノムDNA、加熱サイクル：50℃2分間、9
5℃10分間、40サイクルの95℃15秒間、60℃60秒間)。
【００７１】 実施例8：TaqMan(登録商標)プローブの最適化 実施例7のようにして最適なプライマー濃度を決定したならば、プローブ濃度
を最適化する。最適濃度のプライマーを用いる場合、典型的なTaqMan(登録商標)
では異なる濃度のプローブを使用する。PCR増幅の報告において最良のシグナル
を与えるプローブ濃度を選択する。Tapesia acuformisおよびTapesia yallundae
の定量にとって最適なプライマーおよびプローブを、それらの最適反応濃度と共
に記録する(それぞれ第5および6表)。Tapesia acuformisおよびTapesia yallund
ae検定は、35サイクルにわたる60℃のアニーリング温度によって確立する。
【００７２】
【表１４】
【００７３】
【表１５】
【００７４】 実施例9：真菌ゲノムDNAに対するTaqMan(登録商標)検定特異性の決定 他の穀物病原体由来のDNAのパネルに対し、TaqMan(登録商標)検定を交差反応
性について確認する(第1表)。TaqMan(登録商標)反応を実施例7および8で決定し
た最適なプライマーおよびプローブ濃度を用いて準備し、実施例1で調製した穀
物病原体由来のゲノムDNA 0.2ng/μLに対して試験する。この結果に応じて、検
定をより緊縮とするため加熱サイクルパラメータに変更を施す。これらは、アニ
ーリング／伸長温度または実施サイクルの回数の変更を包含する。成功したTaqM
an(登録商標)検定は、穀物病原体のパネルまたはその植物DNAに対する交差反応
性が無く、ピコグラム以下の量の標的DNAに対して感受性である。実施例8に記載
のTapesia acuformis(R型)およびTapesia yallundae(W型)検定の結果を第8表に
示す。CT値を用いて、スクリーニングした単離物の増幅を示す。CT値が35の単離
物は、この検定で増幅を示さない。
【００７５】
【表１６】
【００７６】
【表１７】
【００７７】 註：CT値または域値サイクルは、基線シグナル以上のリポーター蛍光の増強が最
初に検出され得るPCRサイクルを表す。配列検出ソフトウェアは、全ての標準に
ついてのCT対(LogN)開始コピー数の標準曲線を作製し、次いで内挿により未知試
料の開始コピー数を決定する。
【００７８】 実施例10：感染小麦中の病原体に対するTaqMan(登録商標)検定の特異性の決定 実施例3に記載の検定を用いる分析に基づき、小麦試料をTapesia acuformisお
よび／またはTapesia yallundaeに感染していると同定する。小麦試料はさらに
、第6表に列挙したプライマーの組み合わせおよび実施例8のPCR条件を用いて試
験する。配列検出系ソフトウェア(Perkin Elmer-Applied Biosciences)を使用し
て、小麦試料由来の病原体DNAの増幅を、真菌標的のゲノムDNAの標準曲線に対し
て定量する(第9表)。Tapesia acuformis特異的検定の結果を第10表に示す。全て
の感染試料でTapesia acuformis由来のDNAを検出し、定量する。Tapesia yallun
dae特異的検定の結果を第11表に示す。全ての感染試料でTapesia yallundae由来
のDNAを検出し、定量する。いずれの検定でも、非感染小麦組織には交差反応性
は観察されない。
【００７９】
【表１８】
【００８０】
【表１９】
【００８１】
【表２０】
【００８２】
【表２１】
【００８３】
【表２２】
【００８４】 実施例11：真菌病原体TaqMan(登録商標)検定と共に使用すべき内因性対照 小麦抽出物は全て、存在する真菌病原体DNAと共に宿主の小麦DNAを含んでいる
。したがって、試料抽出物間の何らかの相違を説明するため、小麦DNAを標的と
する内因性対照検定を実施する。これらの検定は偽陰性に対する対照を提供する
。即ち、PCR反応の阻害に帰することのできる真菌DNAに関する陰性の結果が、こ
の内因性対照検定によって立証される。さらにこれらの検定は、標的を提供し、
この標的に対して真菌DNA量が試料対試料の比較のために標準化される。
【００８５】 実施例12：内因性対照プライマーおよびプローブの選択 小麦葉緑体DNAの増幅および検出のためのプライマーとプローブを、シトクロ
ムb-599遺伝子のコード化配列(配列番号41)に対して求める。プライマーおよび
プローブ配列の選択は、ABI Primer Expressプログラム(PE Applied Biosystems
、フォスターシティー、CA、米国)を使用し製造者の指示に従って行う。このプ
ログラムは、融解温度、二次構造、塩基組成、およびアンプリコン長によって最
適化されたTaqMan(登録商標)プライマーおよびプローブセットを選択する。この
ソフトウェアにより選択したセットから、3’末端の熱力学的に安定な塩基の数
が最も少ないプライマーを手動で見つけることにより、最良のセットを選択する
。小麦DNAの増幅のために内因性対照として選択したプライマー／プローブのセ
ットを第12表に示す。これらは実施例4のようにして合成する。
【００８６】
【表２３】
【００８７】 実施例13：小麦抽出物中の小麦DNAを定量するためのTaqMan(登録商標)検定の
使用 小麦組織の抽出物を実施例2のようにして作製する。実施例11に示した検定を
これらの組織に対して以下のように実施する：薄壁の光学等級PCR管に反応を準
備する(PE Applied Biosystems、フォスターシティー、CA、米国)。TaqMan Univ
ersal Master Mix(PE Applied Biosystems、フォスターシティー、CA、米国)の1
X溶液中、前進および逆プライマー濃度を900nMに、そしてプローブ濃度を250nM
とすることにより、反応混合物を作製する。1:20希釈小麦抽出物1マイクロリッ
トルを加える。さらに、真菌DNAとの交差反応性を、5ng/μL真菌DNA調製物1μL
を添加することによって試験する。反応はABI 7700装置(PE Applied Biosystems
、フォスターシティー、CA、米国)で、加熱サイクル：50℃2分間、95℃10分間、
40サイクルの95℃15秒間、60℃60秒間)で実施する。ABI 7700ソフトウェアは、
各反応の蛍光が域値0.4に達するCT値を決定する。このデータは第13表に示す。
示されたCT値は、各試料中に存在する小麦標的DNAの量と逆比例対応する。40のC
Tが報告された試料は、増幅無しを示す。第13表は、内因性対照検定が、小麦の
多数の変種でシトクロムb-559遺伝子を検出することを示す。小麦葉緑体DNAに対
するTaqMan(登録商標)はまた、異なる量の宿主DNAが各々の試料に存在すること
を示す。標的DNAの希釈液を使用することにより、実施例10に記載のように標準
曲線が作製でき、これに対して小麦DNAを定量できる。
【００８８】
【表２４】
【００８９】 実施例14：真菌病原体に対するTaqMan(登録商標)検定および宿主DNAに対する
対照検定の多重化 実施例13に示した反応を、両方の試験が同じ反応管で起こるように、真菌DNA
の定量反応と多重化する。第6表に記載の、Tapesia acuformisのための最適濃度
のプローブおよびプライマーを、実施例13に記載の反応に添加する。これらの反
応は感染小麦組織について記載したように実施する。ここに示したデータは、Ta
qMan(登録商標)真菌病原体検定が、小麦組織に対する内因性対照反応と同じ反応
管で実施できることを示している。
【００９０】
【表２５】
【００９１】 本発明を特定の態様に言及しつつ記載してきたが、数多くの変形、修飾、およ
びさらなる態様が可能であり、したがってそのような変形、修飾および態様は、
全て本発明の範囲内にあるとみなすべきであるという事が理解できるであろう。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA13 CA01 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ07 QQ42 QR55 QR62 QS25 QS34

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号3-6、8-23、25-26、28、30、42、および43より成る
    群から選ばれるオリゴヌクレオチドプライマー。
  2. 【請求項２】 当該プライマーが配列番号3-6、8-23、25-26、28、および30
    より成る群から選ばれる、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
  3. 【請求項３】 プライマーのうち少なくとも一方が請求項2に記載のオリゴ
    ヌクレオチドプライマーである、一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
  4. 【請求項４】 当該プライマーが配列番号14および配列番号18で構成される
    、請求項3に記載の一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
  5. 【請求項５】 当該プライマーが配列番号3および配列番号8で構成される、
    請求項3に記載の一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
  6. 【請求項６】 当該プライマーが配列番号42および43より成る群から選ばれ
    る、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
  7. 【請求項７】 プライマーのうち少なくとも一方が請求項6に記載のオリゴ
    ヌクレオチドプライマーである、一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
  8. 【請求項８】 当該プライマーが配列番号42および配列番号43で構成される
    、請求項7に記載の一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
  9. 【請求項９】 (a) 病原体に感染した植物の葉からDNAを単離し； (b) このDNAを、請求項2に記載の少なくとも1個のプライマーを用いてポリメラ
    ーゼ連鎖反応増幅に付し；そして、 (c) 当該ポリメラーゼ連鎖反応増幅の生成物または生成物群を視覚化することに
    より、その真菌病原体を検出する、 ことを含む、真菌病原体の検出のための方法。
  10. 【請求項１０】 当該真菌病原体がTapesia yallundaeおよびTapesia acufo
    rmisから選ばれる、請求項9に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 (a) 真菌病原体に感染した植物組織からDNAを単離し； (b)当該真菌病原体の内部転写スペーサー配列の一部を、このDNAを鋳型として用
    いて、請求項3に記載の一対のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応で増幅
    し；そして、 (c) 増幅された内部転写スペーサー配列の一部を視覚化することにより、その真
    菌病原体を検出する、 ことを含む、真菌病原体の検出のための方法。
  12. 【請求項１２】 当該真菌病原体がTapesia yallundaeおよびTapesia acufo
    rmisから選ばれる、請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 請求項2に記載のプライマーを含む、真菌病原体を検出す
    る際に使用する診断キット。
  14. 【請求項１４】 請求項3に記載のプライマーの対を含む、真菌病原体を検
    出する際に使用する診断キット。
  15. 【請求項１５】 (a) 病原体に感染した小麦組織からDNAを単離し； (b) このDNAを、請求項7に記載の1対のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反
    応増幅に付し；そして、 (c) 当該ポリメラーゼ連鎖反応増幅の生成物または生成物群を視覚化することに
    より、当該小麦DNAを検出する、 ことを含む、小麦DNAの検出のための方法。
  16. 【請求項１６】 真菌の内部転写スペーサー配列の、増幅に基づく検出に使
    用するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、当該プローブが、 (a) Tapesia yallundaeのITS1、Tapesia yallundaeのITS2、Tapesia acuformis
    のITS1およびTapesia acuformisのITS2より成る群から選ばれる配列の少なくと
    も10の連続するヌクレオチドに対し相補的なヌクレオチド配列； (b) 当該ヌクレオチド配列の5’末端の、蛍光リポーター色素；および、 (c) 当該ヌクレオチド配列の3’末端の、消光剤色素、 を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
  17. 【請求項１７】 当該ヌクレオチド配列が、配列番号37のヌクレオチド31-2
    63、配列番号37のヌクレオチド420-570、配列番号38のヌクレオチド31-262、お
    よび配列番号38のヌクレオチド419-568より成る群から選ばれる配列の少なくと
    も10の連続するヌクレオチドに対し相補的である、請求項16に記載のオリゴヌク
    レオチドプローブ。
  18. 【請求項１８】 当該ヌクレオチド配列が、配列番号7、配列番号24、配列
    番号27、および配列番号29より成る群から選ばれる、請求項17に記載のオリゴヌ
    クレオチドプローブ。
  19. 【請求項１９】 当該プローブが、 (a) 配列番号41の少なくとも10の連続するヌクレオチドに対し相補的なヌクレオ
    チド配列； (b) 当該ヌクレオチド配列の5’末端の、蛍光リポーター色素；および、 (c) 当該ヌクレオチド配列の3’末端の、消光剤色素、 を含む、小麦DNAの、増幅に基づく検出に使用するためのオリゴヌクレオチドプ
    ローブ。
  20. 【請求項２０】 当該ヌクレオチド配列が配列番号44である、請求項19に記
    載のオリゴヌクレオチドプローブ。
  21. 【請求項２１】 当該プライマー対が請求項4に記載のプライマーの対で構
    成され、そしてそのプローブが配列番号24である、真菌DNAを定量するためのオ
    リゴヌクレオチドプライマー対／プローブセット。
  22. 【請求項２２】 当該プライマー対が請求項5に記載のプライマーの対で構
    成され、そしてそのプローブが配列番号7である、真菌DNAを定量するためのオリ
    ゴヌクレオチドプライマー対／プローブセット。
  23. 【請求項２３】 当該プライマー対が請求項8に記載のプライマーの対で構
    成され、そしてそのプローブが配列番号44である、小麦DNAを定量するためのオ
    リゴヌクレオチドプライマー対／プローブセット。
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