JP2003519493A - Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｃｅｒｅａｌｉｓのｐｃｒに基づく検出 - Google Patents

Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｃｅｒｅａｌｉｓのｐｃｒに基づく検出

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JP2003519493A JP2001551227A JP2001551227A JP2003519493A JP 2003519493 A JP2003519493 A JP 2003519493A JP 2001551227 A JP2001551227 A JP 2001551227A JP 2001551227 A JP2001551227 A JP 2001551227A JP 2003519493 A JP2003519493 A JP 2003519493A
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Abstract

(57)【要約】 リボゾームＲＮＡ遺伝子領域からのInternal Transcribed Spacer(ITS)ＤＮＡ配列を、コムギ真菌病原体であるRhizoctonia cerealisの種々の菌株について記載する。これらの配列ないからの特定のプライマーを、ＰＣＲに基づく技術を使用するRhizoctonia cerealisの同定のために有用であるとして同定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、コムギの真菌病原体である、Rhizoctonia cerealisの検出のための
ポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおける種特異的プライマーの使用に関する。こ
れらのプライマーの使用によって、植物集団の病気発生の監視が可能になる。
【０００２】 植物の病気は、年々かなりの作物喪失を引き起こし、農家の経済的剥奪および
、世界の多くの部分で、局地的集団について栄養提供の不足の両方を生じる。殺
菌剤の広範な使用は、植物病原体攻撃に対するかなりの安全を提供した。しかし
、＄１０億に値する殺菌剤の支出にもかかわず、世界的な作物喪失は、１９８１
年で作物価値のおよそ１０％にのぼる（James, 1981; Seed Sci. & Technol. 9:
679-685）。
【０００３】 病気の破壊進行の重度は、病原体の病原力および宿主の応答に依存する。ほと
んどの植物育種計画の１つの目的は、宿主植物の病気に対する抵抗性を増加させ
ることである。典型的には、病原体の異なるレースは、同じ作物種の異なる変種
（variety）と特異に相互作用し、そして宿主抵抗性の多くの源は、特定の病原
体レースに対してのみ保護する。さらに、ある種の病原体レースは、病気の症状
の早期サインを示すが、作物にほとんど損害を生じない。JonesおよびClifford(
1983; Cereal Disease, John Wiley)は、病原体の感染性形態は、宿主品種（cul
tivar）への抵抗性の導入に応答して、病原体集団中に出現することが予測され
、そしてしたがって病原体集団を監視することが必要であることを報告している
。加えて、特定の殺菌剤に対して抵抗性である真菌菌株の進化のいくつかの報告
されたケースがある。
【０００４】 １９８１年には、FletcherおよびWolfe(1981; Proc. 1981 Brit. Crop Prot.
Conf)は、春オオムギからのウドンコ病集団の２４％および冬オオムギからの５
３％が、殺菌剤トリアジメノールに対する応答におけるかなりの変異を示し、そ
してこれらの集団の分布が変種間で異なり、最も感受性の変種がまたより低い感
受性のタイプの最高の発生率を与えることを主張した。真菌の殺菌剤に対する感
受性の同様の変異は、wheat mildew(またトリアジメノールに対して）、ボトリ
チス（ベノミルに対して）、Pyrenophora（有機水銀に対して）、Pseudocercosp
orella（ＭＢＣ−タイプ殺菌剤に対して）およびトリアゾールに対するMycospha
erella fijiensisについて報告されたが、ごくわずかしか説明されていない（Jo
nes and Clifford; Cereal Deseases, John Wiley, 1983）。
【０００５】 コムギは、現在、国際市場で最も重要な農業的物資であり、そして世界農地の
約２０％を占める（1977; Compendium of Wheat Diseases, Amer. Phytopath. S
c. page 1）。世界の小麦の供給の８０％は北米、ヨーロッパ、中国、およびソ
ビエト連邦で育成される。コムギの世界的生産のおよそ２０％は、病気のために
毎年失われる。
【０００６】 シャープアイスポット（sharp eyespot）は、Rhizoctonia cerealis van der
Hoeven(teleomorph Ceratobasidium cereale Murray & Burpee)によって引き起
こされ、そしてコムギ、オオムギ、燕麦およびライムギで発生する（1977; Comp
endium of Wheat Diseases, Amer. Phytopath. Soc. Page 50）。病原体のある
種の単離菌株がまた、芝草に感染し、イエローパッチ(yellow patch)を生じるこ
とができる。重度のコムギ感染は、不時成熟および倒伏を生じ、それによって収
量に影響を及ぼす。現在、既知のシャープアイスポット抵抗性品種はない。
【０００７】 前記の観点から、特定の真菌病原体を、感染進行の早期に同定することを可能
とする技術の開発の真の必要がある。立毛（crop stand）中に病気症状が明白と
なる前に特定の病原体を同定することによって、農学者は、それが同定された作
物変種における病原体のさらなる発生のありうる影響を評価することができ、そ
してそのような適用が必要と考えられるならば、適用可能な殺菌剤を選択するこ
とができる。
【０００８】 本発明はこうして、 （ａ）ここで、Rhizoctonia cerealisのＩＴＳ１は、配列番号１７のヌクレオチ
ド３１−２４３、配列番号１８のヌクレオチド３１−２４２、配列番号１９のヌ
クレオチド３１−２４３、配列番号２０のヌクレオチド３１−２４１、配列番号
２１のヌクレオチド３１−２４３、配列番号２２のヌクレオチド３１−２４３、
配列番号２４３のヌクレオチド３１−１８０、配列番号２４のヌクレオチド３１
−２４０、配列番号２５のヌクレオチド３１−２４２、または配列番号２６のヌ
クレオチド３１−２４２を含む、Rhizoctonia cerealisのＩＴＳ１；および （ｂ）ここでRhisoctonia cerealisのＩＴＳ２は、配列番号１７のヌクレオチド
３９７−６３０、配列番号１８のヌクレオチド３９６−６２９、配列番号１９の
ヌクレオチド３９７−６３０、配列番号２０のヌクレオチド３９５−６２８、配
列番号２１のヌクレオチド３９７−６３０、配列番号２２のヌクレオチド３９７
−６３０、配列番号２３のヌクレオチド３９７−６３０、配列番号２４のヌクレ
オチド３９４−６２７、配列番号２５のヌクレオチド３９６−６２９、または配
列番号２６のヌクレオチド３９６−６２９を含む、Rhizoctonia cerealisのＩＴ
Ｓ２： からなる群より選択されるＩＴＳ配列（Internal Transcribed Spacer sequence
）を含む単離ＤＮＡ分子、 を提供する。
【０００９】 本発明はさらに、 ・真菌ＩＴＳＤＮＡ配列の、増幅に基づく検出における使用のためのオリゴヌク
レオチドプライマーであって、ここで当該プライマーは前記のＩＴＳ配列の少な
くとも１０連続ヌクレオチドと配列同一性を有する、オリゴヌクレオチドプライ
マー、 ・真菌ＩＴＳＤＮＡ配列の増幅に基づく検出における使用のためのオリゴヌクレ
オチドプライマーの対であって、ここで当該プライマーの少なくとも１つは、前
記のオリゴヌクレオチドプライマーである、オリゴヌクレオチドプライマーの対
、 ・配列番号７−１６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー、
・オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、ここで当該プライマーの少なく
とも１つは、配列番号７−１６からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドプ
ライマーである、オリゴヌクレオチドプライマーの対、 ・前記のオリゴヌクレオチオドプライマーの対であって、ここで当該対は、以下
のプライマー対から選択される、オリゴヌクレオチドプライマーの対：
【００１０】 配列番号１２および配列番号９、 配列番号１および配列番号１０、 配列番号１および配列番号９、 配列番号１および配列番号１４、 配列番号１２および配列番号４、 配列番号７および配列番号９、 配列番号１５および配列番号９、 配列番号１６および配列番号９、 配列番号１５および配列番号４、 配列番号１６および配列番号４、 配列番号１５および配列番号１０、および 配列番号１６および配列番号１０、
【００１１】 ・ここでプライマーの当該対は配列番号１２および配列番号９である、前記のオ
リゴヌクレオチオプライマーの対、 を提供する。
【００１２】 本発明はさらに、 ・（ａ）病源体で感染した植物葉からＤＮＡを単離する段階、 （ｂ）当該ＤＮＡを、本発明に従う少なくとも１のプライマーを使用してポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅に付する段階、 （ｃ）当該ポリメラーゼ連鎖反応増幅の産物（複数含む）を可視化することによ
って当該真菌病原体を検出する段階、 の段階を含む、真菌病原体の検出のための方法であって、特に、ここで当該真菌
病原体がRhizoctonia cerealisである、方法、
【００１３】 ・（ａ）病源体で感染した植物葉からＤＮＡを単離する段階、 （ｂ）本発明に従うプライマーの対でのポリメラーゼ連鎖反応において、テンプ
レートとして当該ＤＮＡを使用して、当該病原体のＩＴＳ配列の一部を増幅する
段階、 （ｃ）ＩＴＳ配列の増幅した部分を可視化することによって、当該真菌病原体を
検出する段階、 の段階を含む、真菌病原体の検出のための方法であって、特に、ここで当該真菌
がRhizoctonia cerealisである、方法、
【００１４】 ・（ａ）Rhizoctonia cerealisで感染した植物葉からＤＮＡを単離する段階、 （ｂ）本発明に従うプライマーの対でポリメラーゼ連鎖反応においてテンプレー
トとして当該ＤＮＡを使用してRhizoctonia cerealisのＩＴＳ配列の一部を増幅
する段階、 （ｃ）ＩＴＳ配列の増幅した部分を可視化することによってRhizoctonia cereal
isを検出する段階、 の段階を含む、Rhizoctonia cerealisの検出のための方法、 ・前記の方法であって、ここでプライマーの当該対は配列番号１２および配列番
号９である、前記の方法、 を提供する。
【００１５】 本発明は、さらに本発明に従うプライマーを含む、真菌病原体の検出において
使用される診断用キット、 を提供する。
【００１６】 本発明は、植物病原性真菌の異なる表現型の同定の方法を得る。本発明は異な
る真菌表現型間の変異性を示すＩＴＳ ＤＮＡ配列を提供する。そのようなＤＮ
Ａ配列は本発明の方法で有用であり、これらをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
に基づく診断アッセイにおける使用のためのプライマーを誘導するために使用す
ることができる。これらのプライマーはＰＣＲ反応において独特なフラグメント
を生成し、ここにＤＮＡテンプレートは特定の真菌表現型によって提供され、そ
してこうして病気症状の開始の前に、宿主植物体における特定の表現型の存在ま
たは不存在を同定するために使用することができる。
【００１７】 好ましい実施態様では、本発明は、病原体Rhizoctonia cerealisのための、Ｉ
ＴＳ１およびＩＴＳ２ＤＮＡ配列（例えば配列番号１７−２６）を提供する。さ
らなる好ましい実施態様では、本発明は、Rhizoctonia cerealisの検出のための
ＩＴＳに由来する診断用プライマー（例えば配列番号７−１６）を提供する。
【００１８】 本発明は、特定作物変種−病原体菌株関連性におけるあり得る損害を評価する
、および利用可能である殺菌剤の多様な重要な資源の蓄積を賢明に利用する可能
性を提供する。さらに、本発明を使用し、広範囲の地理的領域にわたる特定病原
体レースの発生および蔓延の詳細な情報を提供することができる。本発明は、長
い潜在相を有する病気に特に好適である検出の方法を提供する。
【００１９】 本発明の実施化で有用なキットをまた提供する。このキットは、真菌病原体Rh
izoctonia cerealisの同定における特別の使用を見出す。
【００２０】 配列表の配列の簡単な説明 配列番号１、オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ１。 配列番号２、オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ２。 配列番号３、オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ３。 配列番号４、オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ４。 配列番号５、Ｍ１３ ユニバーサル−２０ プライマー。 配列番号６、実施例２で使用する、リバースプライマー。 配列番号７、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６４３。 配列番号８、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６４４。 配列番号９、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６４５。 配列番号１０、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６４６。 配列番号１１、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６４７。 配列番号１２、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６４８。 配列番号１３、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６４９。 配列番号１４、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６５０。 配列番号１５、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６８７。 配列番号１６、オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６８８。 配列番号１７、R. cerealis単離株４４２３５からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域
のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４３）、
５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４４−３９６）、ＩＴＳ２（ヌクレオ
チド３９７−６３０）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（ヌク
レオチド６３１−６８７）を含むもの。
【００２１】 配列番号１８、R. cerealis単離株ＡＧＤＣ５７からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ
領域のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝
子の３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４２
）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４３−３９５）、ＩＴＳ２（ヌク
レオチド３９６−６２９）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（
ヌクレオチド６３０−６８６）を含むもの。
【００２２】 配列番号１９、R. cerealis単離株ＣＡＧ１ＢＮ１からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ
領域のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝
子の３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４３
）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４４−３９６）、ＩＴＳ２（ヌク
レオチド３９７−６３０）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（
ヌクレオチド６３１−６８７）を含むもの。
【００２３】 配列番号２０、R.cerealis単離株ＡＧＤＣ７３からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域
のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４１）、
５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４２−３９４）、ＩＴＳ２（ヌクレオ
チド３９５−６２８）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（ヌク
レオチド６２９−６８５）を含むもの。
【００２４】 配列番号２１、R. cerealis単離株５２１８２からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域
のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４３）、
５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４４−３９６）、ＩＴＳ２（ヌクレオ
チド３９７−６３０）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（ヌク
レオチド６３１−６８７）を含むもの。
【００２５】 配列番号２２、R. cerealis単離株Ｂｎ５０５からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域
のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４３）、
５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４４−３９６）、ＩＴＳ２（ヌクレオ
チド３９７−６３０）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（ヌク
レオチド６３１−６８６）を含むもの。
【００２６】 配列番号２３、R. cerealis単離株Ｒ８８−３０３からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ
領域のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝
子の３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４３
）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４４−３９６）、ＩＴＳ２（ヌク
レオチド３９７−６３０）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（
ヌクレオチド６３１−６８７）を含むもの。
【００２７】 配列番号２４、R. cerealis単離株５２１８４からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域
のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４０）、
５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４１−３９３）、ＩＴＳ２（ヌクレオ
チド３９４−６２７）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（ヌク
レオチド６２８−６８４）を含むもの。
【００２８】 配列番号２５、R. cerealis単離株６２０６３からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域
のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４２）、
５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４３−３９５）、ＩＴＳ２（ヌクレオ
チド３９６−６２９）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（ヌク
レオチド６３０−６８６）を含むもの。
【００２９】 配列番号２６、R. cerealis単離株５２１８３からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域
のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
３'末端（ヌクレオチド１−３０）、ＩＴＳ１（ヌクレオチド３１−２４２）、
５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４３−３９５）、ＩＴＳ２（ヌクレオ
チド３９６−６２９）、および大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端（ヌク
レオチド６３０−６８６）を含むもの。
【００３０】 配列番号２７、R. cerealisからのＩＴＳ領域のＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ配
列（アクセッション＃ＡＦ０６３０１９）表であって、５'ないし３'方向で：小
サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３'末端（ヌクレオチド１−２９）、ＩＴＳ１（
ヌクレオチド３０−２４１）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子（ヌクレオチド２４２−
３９４）、ＩＴＳ２（ヌクレオチド３９５−６２８）、および大サブユニットｒ
ＲＮＡ遺伝子の５'末端（ヌクレオチド６２９−６８５）を含むもの。
【００３１】 配列番号２８、P. herpotrichoides 単離株Ｒ１からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領
域のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子
の３'末端、ＩＴＳ１、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ２、および大サブユニ
ットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端を含むもの。
【００３２】 配列番号２９、S. nodorum単離株２４４２５からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域の
ＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３
'末端、ＩＴＳ１、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ２、および大サブユニット
ｒＲＮＡ遺伝子の５'末端を含むもの。
【００３３】 配列番号３０、S. tritici単離株２６５１７からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域の
ＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３
'末端、ＩＴＳ１、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ２、および大サブユニット
ｒＲＮＡ遺伝子の５'末端を含むもの。
【００３４】 配列番号３１、P. tritici-repentis単離株６７１５からＰＣＲ−増幅したＩＴ
Ｓ領域のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺
伝子の３'末端、ＩＴＳ１、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ２、および大サブ
ユニットｒＲＮＡ遺伝子の５'末端を含むもの。
【００３５】 配列番号３２、F. culmorum単離株６２２１５からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域
のＤＮＡ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
３'末端、ＩＴＳ１、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ２、および大サブユニッ
トｒＲＮＡ遺伝子の５'末端を含むもの。
【００３６】 配列番号３３、M. nivale単離株５２０からＰＣＲ−増幅したＩＴＳ領域のＤＮ
Ａ配列であって、５'ないし３'方向で：小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３'末
端、ＩＴＳ１、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ２、および大サブユニットｒＲ
ＮＡ遺伝子の５'末端を含むもの。
【００３７】 本発明は、植物病原性真菌の異なる表現型を同定することにおいて有用である
独特のＤＮＡ配列を提供する。特に、それらのＤＮＡ配列を真菌表現型の同定の
ためのＰＣＲに基づく分析でのプライマーとして使用することができる。本発明
のＤＮＡ配列は、特定の真菌病原体のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のInternal T
ranscribed Spacer(ＩＴＳ)配列、並びに特定の病原体を同定することのできる
、これらの領域に由来するプライマーを含む。病原体種または属内の異なる表現
型からのこれらのＩＴＳ ＤＮＡ配列であって、種または属の異なるメンバー間
で異なるものを使用して、これらの特定のメンバーを同定することができる。
【００３８】 生物医学研究者は、あるときにＰＣＲに基づく技術を使用し、感染性動物組織
の病原体を検出することにある程度の成功を収めた。最近になって、しかし、こ
の技術は植物病原体を検出するために適用された。感染性コムギのGaumannomyce
s graminisの存在は、病原体ミトコンドリアゲノムに特異的な配列のＰＣＲを使
用して検出され（Schlesser et al., 1991; Applied and Environ. Microbiol.
57:553-556）、そしてランダム増幅多型性ＤＮＡ（すなわちＲＡＰＤ）マーカー
は、針葉樹のscleroderris cankerの原因物質である、Gremmeniella abietinaの
多くのレースを区別することができた。米国特許番号５５８５２３８（引用によ
りその全体をここに含める）は、Septoria、Pseudocercosporella、およびMycos
phaerellaの菌株のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列から由来するプラ
イマーおよびＰＣＲに基づく技術を使用するこれらの真菌単離株の同定でのこれ
らの使用を記載している。
【００３９】 加えて、ＷＯ９５／２９２６０（引用によりその全体をここに含める）は、Fu
sariumの菌株のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列に由来するプライマー
およびＰＣＲに基づく技術を使用するこれらの真菌単離株の同定での使用を記載
する。さらに、米国特許番号５８００９９７（引用によりその全体をここに含め
る）は、Cerocospora、Helminthosporium、Kabatirlla、およびPucciniaの菌株
のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列に由来するプライマーおよびＰＣＲ
に基づく技術を使用するこれらの真菌単離株の同定におけるこれらの使用を記載
する。
【００４０】 リボゾーム遺伝子は、それらの高いコピー数のために分子プローブ標的として
の使用のために好適である。成熟ｒＲＮＡ配列間の高い保存にもかかわらず、非
転写および転写スペーサー配列が通常あまり保存されておらず、そしてこうして
最近の進化分岐の検出のための標的配列として好適である。
【００４１】 真菌ｒＲＮＡ遺伝子は、そのそれぞれが１８Ｓ（小サブユニット）、５．８Ｓ
、および２８Ｓ（大サブユニット）のこれらの成熟サブユニットをコードしてい
る、単位として構成される。これらのサブユニットは、３００ｂｐ周辺で、２種
のＩＴＳ、すなわちＩＴＳ１およびＩＴＳ２に分けられる（White et al., 1990
; In: PCR Protocols; Eds.:Innes et al.; pages 315-322）。加えて、転写単
位は、non-transcribed spacer sequences(ＮＴＳ)によって分けられる。ＩＴＳ
およびＮＴＳ配列は特に、種々の真菌病原体の特定表現型の検出について好適で
ある。
【００４２】 本発明のＤＮＡ配列は、種々の植物病原体のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩ
ＴＳ配列に由来する。ある病原体種または属内の種々の表現型からのＩＴＳ Ｄ
ＮＡ配列は、その種または属の異なるメンバーの間で異なる。病原体のＩＴＳ配
列をひとたび決定すると、これらの配列を他のＩＴＳ配列とアラインメントする
ことができる。この態様では、プライマーをそれらのＩＴＳ配列から誘導するこ
とができる。すなわち、プライマーを、真菌表現型中の配列において最も大きな
相違を含むＩＴＳ配列内の領域に基づいて設計することができる。これらの配列
およびこれらの配列に基づいたプライマーを使用して、特定の病原体を同定する
ことができる。
【００４３】 所望の特別のＤＮＡ配列は、Rhizoctonia cerealisからのＩＴＳ ＤＮＡ配列
を含む。そのようなＩＴＳ ＤＮＡ配列を、配列番号１７−２６に記載する。こ
れらのＩＴＳ配列に由来する代表的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列を、
配列番号７−１６に開示する。これらの配列は、所望の病原体のＰＣＲに基づく
同定における使用を見出す。
【００４４】 ＰＣＲ分析での本発明のプライマー配列の使用のための方法は、当業界で周知
である。例えば、米国特許番号４６８３１９５、並びにSchlesser et al.(1991)
Applied and Environ. Microbiol. 57:553-556参照。また、ＰＣＲ増幅を使用し
て、Verticilllium albo-atrumおよびVerticillium dahliaeのＩＴＳ領域の相違
を探索し、そしてしたがって２種間を区別した、Nazar et al.( 1991; Physiol.
and Molec. Plant Pathol. 39: 1-11)；および同様の技術を使用して、バナナ
病原体Mycosphaerella fijiensisおよびMycosphaerella musicaleを区別した、J
ohanson and Jeger(1993; Mycol. Res.97: 670-674)参照。
【００４５】 本発明のＩＴＳ ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法によって、真菌病原体から
クローン化することができる。一般に、真菌単離株からのＤＮＡの単離のための
方法は既知である。Raeder & Broda (1985) Letters in Applied Microbiology
2:17-20; Lee et al. (1990) Fungal Genetics Newsletter 35:23-24;およびLee
and Taylor (1990) In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicati
ons, Innes et al. (Eds.); pages 282-287参照。
【００４６】 または、所望のＩＴＳ配列をＰＣＲ増幅によって決定することができる。例示
的実施態様では、完全ＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーを、White et al.
(1990; In: PCR Protocols; Eds.: Innes et al. pages 315-322)にしたがって
設計し、そして増幅したＩＴＳ配列をｐＣＲ２．１クローニングベクターにサブ
クローン化する。サブクローン化した配列は、レフトハンドＩＴＳ（ＩＴＳ１）
、ライトハンドＩＴＳ（ＩＴＳ２）、並びに中央に位置する５．８ＳｒＲＮＡ遺
伝子を含む。これを、Rhizoctonia cerealisの幾つかの単離株について企てる。
【００４７】 決定したＩＴＳ配列を、それぞれの病原体群内で比較し、異なる種および／ま
たは菌株を区別するためＰＣＲで試験するために有用であり得る分岐を位置決定
する。例示的決定ＩＴＳ ＤＮＡ配列を配列番号１７−２６に示す。これらのＩ
ＴＳ ＤＮＡ配列を比較するアラインメントを作成する。分岐の同定から、多く
のプライマーを合成し、そしてＰＣＲ増幅で試験する。ＰＣＲ増幅試験のために
使用するテンプレートは、最初に精製病原体ＤＮＡ、そしてその後は感染性宿主
植物組織から単離されるＤＮＡである。こうして、診断用である、すなわち、あ
る特別の病原体種または菌株であるが、同じ病原体の別の種または菌株ではない
、ある特別の病原体または菌株を同定する、プライマーの対を同定することが可
能である。
【００４８】 好ましいプライマー組み合わせは、感染性宿主組織、すなわち前に特定の病原
体種または菌株で感染した宿主組織の異なる種または菌株の間を区別することが
できる。本発明は、Rhizoctonia cerealisの検出のための基準を履行する多くの
プライマー組み合わせを提供する。本発明のプライマーを、真菌ＩＴＳ領域の間
の配列の相違に基づいて設計する。配列間の最小１塩基対の相違により、識別プ
ラマーの設計が許容されることができる。特定真菌ＤＮＡのＩＴＳ領域に対して
設計されるプライマーを、リボゾームＤＮＡのコード領域内の保存配列領域に対
して作成されるプライマーと組み合わせて使用して、種特異的ＰＣＲフラグメン
トを増幅することができる。一般に、プライマーは良好な感受性を達成するため
に約６０ないし約７０℃の間の理論的融解温度を有するものとし、そしてプライ
マー組み合わせ間で有意な二次構造および３’オーバーラップがないものとする
。プライマーは一般的に、ＩＴＳ１またはＩＴＳ２の少なくとも約５−１０連続
ヌクレオチド塩基と、１００％同一性を有する。好ましい実施態様では、プライ
マーは近似的に５−３０ヌクレオチド塩基長からならどこでもよい。
【００４９】 本発明は、本プロセスを実施するために必要な要素を含む「キット」の調製に
容易に役立つ。そのようなキットは、密閉して１または２以上の容器、例えば管
またはバイアルをその中に受けるための区画化されたキャリアーを含み得る。容
器の１つは、非標識または検出可能に標識されたＤＮＡプライマーを含み得る。
標識したＤＮＡプライマーは、必要に応じて凍結乾燥形態でまたは適当なバッフ
ァー中で存在し得る。１または２以上の容器は、ＰＣＲ反応に利用されるべき、
１または２以上の酵素または試薬を含み得る。これらの酵素は、それ自体でまた
は混合物として、凍結乾燥形態でまたは適当なバッファー中で存在し得る。
【００５０】 最終的に、このキットは本発明の技術を実施するために必要な付加的要素、例
えば、バッファー、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオチド
三フォスフェート、濾紙、ゲル材料、移動材、オートラジオグラフィー補給、そ
の他のすべてを含み得る。
【００５１】 以下の実施例は、ＩＴＳ配列の単離、好適なプライマー配列の選択、選択およ
び診断効率についてのプライマーの試験、および病気および真菌単離株のための
そのようなプライマーの使用において使用することができる、典型的な実験プロ
トコルを示す。そのような実施例は、例示のために提供し、限定のためではない
。
【００５２】 実施例 ここで使用される標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当業界
で周知であり、そしてJ. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecula
r Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spr
ing Harbor, NY (1989)によって、そしてT.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W.
Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY (1984)によって、そしてAusubel, F.M. et al., Curre
nt Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and
Wiley-Interscience (1987)によって記載される。
【００５３】 実施例１： 真菌単離株およびゲノム真菌ＤＮＡ抽出 使用した真菌単離株およびこれらの源の列挙のための表１を参照。真菌を１５
０ｍｌポテトデキストロース培地で増殖させ、ＰＤＡ（ポテトデキストロースア
ガー）カルチャーからの菌糸体断片で接種する。カルチャーをオービタルシェー
カーにおいて２８℃で７−１１日間インキュベートする。または、菌糸体を、Ｐ
ＤＡプレートから直接単離する。菌糸体を遠心分離によってペレット化し、それ
から液体窒素で粉砕し、そして総ゲノムＤＮＡを、Lee and Taylor (1990; In:
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Eds.: Innes et al.;
pages 282-287)のプロトコルを使用して抽出する。
【００５４】 表１：試験単離株の源
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】1 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA2 Dr. Marc Cubeta, North Carolina State University, Raleigh, North Caroli
na, USA3 Dr. Lee Burpee, University of Georgia, Athens, Georgia, USA4 Dr. Simon Edwards, Harper Adams Agricultural College, Newport, Shropshi
re, UK5 Novartis Crop Protection AG, CH-4002 Basel, Switzerland6 Dr. Paul Nelson, Penn State University, Pennsylvania, USA7 Novartis, Vero Beach, Florida, USA8 Dr. Cynthia Ocambi, Oregon State University, Corvallis, Oregon, USA9 Dr. Paul Nicholson, John Innes Centre, Norwich, UK
【００５７】 実施例２： Internal Transcribed Spacer(ＩＴＳ)領域の単離 近似的に７００ｂｐ長のＩＴＳ領域フラグメントを、表１に列挙した選択され
た真菌単離株から単離したゲノムＤＮＡの１０ｎｇから、５０ｐｍｐｌのプライ
マーＩＴＳ１（5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'; 配列番号１）およびＩＴＳ４（5'-
tcctccgcttattgatatgc-3'; 配列番号４）を使用して、ＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ
は実施例４に記載されるように実施する。ＰＣＲ産物を、Invitrogen Corporati
on(San Diego, CA)のＴＡクローニングキット（part no. K2000-01）を使用し、
ＰＣＲ２．１クローニングベクターを使用して、クローン化する。
【００５８】 ＩＴＳ領域のＤＮＡ配列を、プライマーＩＴＳ１（配列番号１）、ＩＴＳ４（
配列番号４）、Ｍ１３ユニバーサル−２０（5'-gtaaaacgacggccagt-3'; 配列番
号5)およびリバース(5'-aacagctatgaccatg-3'; 配列番号6) プライマーで、Appl
ied Biosystems(Foster City, CA)自動シーケンサーを使用して、ジデオキシ法
によって決定する。ＩＴＳプライマーである、ＩＴＳ１およびＩＴＳ４は、Whit
e et al. (1990; In: PCR Protocols; Eds.: Innes et al. pages 315-322)に
詳しい。
【００５９】 実施例３： コムギからのＤＮＡ抽出 バルクマセレーション法（bulk maceration method）を使用してＤＮＡをコム
ギから抽出する。バルクマセレーション法を使用し、圃場から幾つかの天然で感
染したコムギ茎からＤＮＡを単離し、ハイスループット分析のための圃場サンプ
リング方法を最適化する。
【００６０】 バルクマセレーション法： （１）主分げつから切った適当な数の４ｃｍコムギ茎セクションを、Bioreba（R
einach, Switzerland）重量（heavy duty）プラスチックバッグ（cat#490100）
の基カラムの上方に直接的に置く。植物組織を秤量し、プラスチックバッグと茎
セクションから風袋（プラスチックバッグの重量）をマイナスする。 （２）等体積（ｍｌ）のMuller Extraction Buffer(０．１％Ｗ／ＶTween−８０
；０．０４Ｍ トリス−Ｃｌ、ｐＨ７．７；０．１５Ｍ ＮａＣｌ；０．１％Ｗ
／Ｖ ＢＳＡ−PentexフラクションV；０．０１％ｗ／ｖアジ化ナトリウム；２
００ｍＭ ＥＤＴＡ)であってコムギ組織の重量（ｇ）当たりであるものを添加
する。Bioreba Homex 6ホモジナイザーセットを７０で使用して組織をマセレー
トする（macerate）。葉を組織が繊維状となるまで粉砕する。 （３）使用するならば、多重バッグからエキストラクトをプールし、よく撹拌す
る。エキストラクトジュースを氷上でエッペンドルフ管に等分する。 （ａ）１００μｌの濃縮エキストラクトを５分間ボイルする。 （ｂ）ボイルしたエキストラクトを氷上に置く。 （ｃ）ボイルした、濃縮したエキストラクトからの１０μｌを、滅菌したＨ２Ｏ
の９０μｌに添加することによって、１：１０希釈する。 （ｄ）使用まで、氷上で希釈したエキストラクトを貯蔵する。
【００６１】 実施例４： ポリメラーゼ連鎖反応増幅 ポリメラーゼ連鎖反応を、Perkin-Elmer/Cetus(Nortwalk, CT; part no. N808
-0009)からのGeneAmpキットで、５０ｍM ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１
０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３であって、２００μＭのそれぞれのｄＴＴ
Ｐ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを含むもの、５０ｐｍｐｌそれぞれの
プライマー、２．５単位のＴａｑポリメラーゼおよび１０ｎｇのゲノムＤＮＡま
たは１μｌの１：１０希釈植物エキストラクトであって５０μｌの最終体積であ
るものを使用して、実施する。反応を１５秒間９４℃、１５秒間５０℃−７０℃
、および４５秒間７２℃の３０−４０サイクルで、Perkin-Elmer/Cetus Model 9
600またはModel9700サーマルサイクラーにおいて稼動させる。産物を１０μｌの
それぞれのＰＣＲサンプルを１．０％アガロースゲル上に負荷し、そして電気泳
動することによって分析する。
【００６２】 実施例５： オリゴヌクレオチドの合成および精製 例えば、Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)またはMidland Cert
ified Reagent Company (Midland, Texas)のいずれかによって、オリゴヌクレオ
チドを合成する。
【００６３】 実施例６： 種特異的プライマーの選択 R. cerealis単離株４４２３４からのＩＴＳ領域を、S. nodorum、P. herpotri
choides R-型、P. tritici-repentis、F. culmorum、M. nivaleおよびS. tritic
iからのＩＴＳ領域とアラインメントする。以下の表２に示されるもののような
オリゴヌクレオチドプライマーを、アラインメント配列の分析に基づいて実施例
５にしたがって合成する。プライマーを、真菌種間の配列の最大の相違を含む領
域に対して設計する。付加的アラインメントを以下のR. cerealis単離株：４４
２３５、ＡＧＤＣ５７、ＣＡＧＢＮ１、ＡＧＤＣ７３、５２１８２、Ｂｎ５０５
、Ｒ８８／３０３および５２１８４からのＩＴＳ領域で作成する。プライマーを
また、R. cerealis単離株間で高度に保存された領域に対して設計する。加えて
、公開されたリボゾーム遺伝子特異的プライマーＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＩＴＳ３
およびＩＴＳ４(White et al., 1990; In: PCR Protocols; Eds.: Innes et al.
pages 315-322)を、ＩＴＳ領域について特異的なプライマーと組み合わせて試
験するために合成する。
【００６４】 表２： 真菌検出のために設計したプライマー
【表３】
【００６５】 実施例７：精製真菌ゲノムＤＮＡに特異的なプライマーの決定 ＰＣＲを実施例４にしたがって、種々のプライマー組み合わせを使用して（表
３）、単一の特定のフラグメントを増幅する試みにおいて、実施する。特定ＰＣ
Ｒ増幅産物を、所望のそれぞれの真菌菌株の小および大リボゾームＤＮＡサブユ
ニットの間のＩＴＳ領域から設計したプライマーから生産する。
【００６６】 表３： ＩＴＳに由来する診断用ＰＣＲプライマー
【表４】
【表５】
【００６７】 実施例８： 真菌で感染した植物組織に対するプライマー特異性および他の禾穀
類真菌病原体との交差反応性の決定 健康なコムギ茎から、およびR. cerealisで感染したコムギ茎から、実施例３
に記載のように、総ゲノムＤＮＡを単離する。ＰＣＲを実施例４に記載のように
実施し、コムギ組織からのＤＮＡに対する表３に列挙したもののようなプライマ
ー組み合わせを試験する。精製真菌ゲノムＤＮＡを、実施例１で記載したように
取得し、そして診断用プライマーを使用して実施例４で記載したようにＰＣＲア
ッセイする。他の真菌ＤＮＡ種および単離株を、診断用プライマーの、それらと
の交差反応性の能力について試験する。
【００６８】 R. cerealis特異的プライマー組み合わせである、ＪＢ６４８（配列番号１２
）およびＪＢ６４５（配列番号９）は、表１に列挙したすべてのR. cerealis単
離株から、およびR. cerealis感染したコムギ組織からのＤＮＡからの５２３ｂ
ｐフラグメントを増幅する。このプライマー組み合わせは、健康なコムギ組織か
らの診断用フラグメントを増幅しない。このプライマー組み合わせはまた、以下
の共通禾穀類病原体：P. herpotrichoides R-およびW-病原型、D. sorokiniana
、C. herbarum、S. tritici、C. arachidicola、S. nodorum、R. solani、F. cu
lmorum、F. graminearum、M. nivale、P. tritici-repentisおよびP. teresから
単離される精製ゲノムＤＮＡからの診断用フラグメントを増幅しない。同様の診
断結果を、表３に列挙した、他のR. cerealis特異的プライマー組み合わせで得
る。
【００６９】 本発明をその特定の実施態様に言及することで記載したが、多くの変形、修飾
、およびさらなる実施態様が可能であり、そしてしたがって、すべてのそのよう
な変形、修飾および実施態様は本発明の範囲内であるとしてみなされるべきであ
ることが認識される。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チャールズ・ジェイソン・バーネット アメリカ合衆国27514ノースカロライナ州 チャペル・ヒル、オードリー・レイン26番 Ｆターム(参考） 4B024 AA07 AA11 CA01 CA20 HA11 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ04 QQ07 QQ50 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR62 QS16 QS25 QS36 QX01

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１７のヌクレオチド３１−２４３、配列番号
    １８のヌクレオチド３１−２４２、配列番号１９のヌクレオチド３１−２４３、
    配列番号２０のヌクレオチド３１−２４１、配列番号２１のヌクレオチド３１−
    ２４３、配列番号２２のヌクレオチド３１−２４３、配列番号２４３のヌクレオ
    チド３１−１８０、配列番号２４のヌクレオチド３１−２４０、配列番号２５の
    ヌクレオチド３１−２４２、または配列番号２６のヌクレオチド３１−２４２を
    含む、Rhizoctonia cerealisのＩＴＳ１；および （ｂ）配列番号１７のヌクレオチド３９７−６３０、配列番号１８のヌクレオチ
    ド３９６−６２９、配列番号１９のヌクレオチド３９７−６３０、配列番号２０
    のヌクレオチド３９５−６２８、配列番号２１のヌクレオチド３９７−６３０、
    配列番号２２のヌクレオチド３９７−６３０、配列番号２３のヌクレオチド３９
    ７−６３０、配列番号２４のヌクレオチド３９４−６２７、配列番号２５のヌク
    レオチド３９６−６２９、または配列番号２６のヌクレオチド３９６−６２９を
    含む、Rhizoctonia cerealisのＩＴＳ２： からなる群より選択されるＩＴＳ配列（Internal Transcribed Spacer sequence
    ）を含む単離ＤＮＡ分子。
  2. 【請求項２】 真菌ＩＴＳ ＤＮＡ配列の増幅に基づく検出での使用のため
    のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで当該プライマーが、請求項１
    のＩＴＳ配列の少なくとも１０連続ヌクレオチドと配列同一性を有する、オリゴ
    ヌクレオチドプライマー。
  3. 【請求項３】 真菌ＩＴＳ ＤＮＡ配列の増幅に基づく検出での使用のため
    のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで少なくとも１の当該プライマ
    ーが請求項２のオリゴヌクレオチドプライマーである、オリゴヌクレオチドプラ
    イマー。
  4. 【請求項４】 配列番号７−１６からなる群より選択されるオリゴヌクレオ
    チドプライマー。
  5. 【請求項５】 少なくとも１の当該プライマーが請求項４のオリゴヌクレオ
    チドプライマーである、オリゴヌクレオチドプライマーの対。
  6. 【請求項６】 当該対が以下のプライマー対から選択される、請求項５に記
    載のオリゴヌクレオチドプライマーの対： 配列番号１２および配列番号９、 配列番号１および配列番号１０、 配列番号１および配列番号９、 配列番号１および配列番号１４、 配列番号１２および配列番号４、 配列番号７および配列番号９、 配列番号１５および配列番号９、 配列番号１６および配列番号９、 配列番号１５および配列番号４、 配列番号１６および配列番号４、 配列番号１５および配列番号１０、および 配列番号１６および配列番号１０。
  7. 【請求項７】 プライマーの当該対が配列番号１２および配列番号９である
    、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。
  8. 【請求項８】 真菌病原体を検出するための方法であって、 （ａ）病源体で感染した植物葉からＤＮＡを単離する段階、 （ｂ）当該ＤＮＡを、請求項２に記載の少なくとも１のプライマーを使用して、
    ポリメラーゼ連鎖反応増幅に付する段階、および （ｃ）当該真菌病原体を、当該ポリメラーゼ連鎖反応増幅の産物（複数含む）を
    可視化することによって検出する段階、 の段階を含む方法。
  9. 【請求項９】 当該真菌病原体がRhizoctonia cerealisである、請求項８の
    方法。
  10. 【請求項１０】 真菌病原体を検出するための方法であって、 （ａ）病源体で感染した植物葉からＤＮＡを単離する段階、 （ｂ）請求項３に記載のプライマーの対でのポリメラーゼ連鎖反応において、テ
    ンプレートとして当該ＤＮＡを使用して、当該病原体のＩＴＳ配列の一部を増幅
    する段階、および （ｃ）ＩＴＳ配列の増幅した部分を可視化することによって、当該真菌病原体を
    検出する段階、 の段階を含む方法。
  11. 【請求項１１】 当該真菌病原体がRhizoctonia cerealisである、請求項１
    ０の方法。
  12. 【請求項１２】 Rhizoctonia cerealisの検出のための方法であって、 （ａ）Rhizoctonia cerealisで感染した植物葉からＤＮＡを単離する段階、 （ｂ）請求項６に記載のプライマーの対でのポリメラーゼ連鎖反応において、テ
    ンプレートとして当該ＤＮＡを使用してRhizoctonia cerealisのＩＴＳ配列の一
    部を増幅する段階、 （ｃ）ＩＴＳ配列の増幅した部分を可視化することによってRhizoctonia cereal
    isを検出する段階、 の段階を含む方法。
  13. 【請求項１３】 プライマーの当該対が配列番号１２および配列番号９であ
    る、請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項２のプライマーを含む、真菌病原体を検出するとき
    に使用する診断用キット。
  15. 【請求項１５】 請求項３のプライマーの対を含む、真菌病原体を検出する
    ときに使用する診断用キット。
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