CN108977562A - 一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，属于生物安全技术领域；所述的RPA引物基于小麦纹枯病菌ITS序列设计，RPA引物序列如SEQ ID No：1和2所示；所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，其序列大小为45bp‑54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3‑Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。本发明还提供含有所述的RPA引物和探针的试剂盒。本发明进一步提供基于所述的RPA引物和探针建立的RPA检测方法，首次将RPA技术应用到土壤中小麦纹枯病菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为小麦纹枯病的早期诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法。

Description

一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的RPA引物、探针、试剂盒 及检测方法
技术领域
本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
小麦纹枯病是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的土传真菌性病害，在温带小麦种植区均有发生，是影响小麦高产稳产的重要病害之一。在我国，小麦纹枯病主要发生在江淮流域和黄河中下游冬麦区，发病程度呈逐年增长的趋势。小麦纹枯病主要以菌核或病残体上的菌丝在土壤中越夏和越冬，在小麦的整个生长季节都可以发生危害。因此，快速准确检测麦田土壤中小麦纹枯病菌，对小麦纹枯病的早期诊断、预测预报和综合防治具有重要意义。
小麦纹枯病菌的检测手段主要包括传统的形态、生理生化检测和现代分子生物学检测。传统检测方法包含组织分离、形态观察和融合群鉴定等流程，程序较繁琐、周期较长。近年来，基于DNA的分子生物学检测技术广泛应用于小麦纹枯病的检测，主要包括聚合酶链式反应(PCR)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)和实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)。PCR和Real-time PCR具备准确、灵敏度高的特点，同时可实现对发病组织和土壤中小麦纹枯病菌的定量检测，但该技术对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高的不足。因此，继续开发对小麦纹枯病菌高效、精确、对仪器设备要求低的检测技术具有重要的实践价值。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种新兴的恒温扩增技术，扩增反应由重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶(Ploymerase)完成。在ATP作用下，重组酶与RPA引物结合形成核蛋白微丝，向模板DNA移动，并将引物与模板DNA序列进行比对。引物与模板DNA发生碱基互补配对时，核蛋白微丝与模板DNA发生重组反应，并在单链结合蛋白的作用下，模板DNA解链。随后，在DNA聚合酶的作用下，进行RPA扩增反应。RPA反应在37℃-42℃恒温反应20min即可完成，同时结合侧向流层析试技术，可在10min内完成RPA扩增产物的检测，即利用RPA技术可在30min内完成对小麦纹枯病菌的可视化检测。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在小麦纹枯病菌检测方面的报道。
发明内容
1、要解决的问题
针对小麦纹枯病菌尚无有效进行RPA技术检测的问题，本发明提供一种用于检测土壤小麦纹枯病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，为土壤中小麦纹枯病菌的现场检测和早期诊断提供新方法。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的RPA引物和RPA探针，
所述的RPA引物基于小麦纹枯病菌ITS序列设计，
所述的RPA引物的上游引物如SEQ ID No：1所示，
所述的RPA引物的下游引物如SEQ ID No：2所示；
所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，
所述的RPA探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
优选地，所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No：2所示的序列，且其5’端用Biotin修饰；所述的RPA探针包括如SEQ ID No：3所示的序列，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
一种含有上述所述的RPA引物和RPA探针的用于检测土壤中小麦纹枯病菌的试剂盒。
优选地，所述的试剂盒还包括RPA反应管、阳性对照模板、阴性对照模板中的至少一种。
一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的检测方法，
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用上述所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增产物。
优选地，步骤(1)中所述的样品为小麦纹枯病菌菌丝，所述的RPA引物和RPA探针的检出限为1pg/μLDNA。
优选地，步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
优选地，步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-45℃(具体应用时，可以选择37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃)下反应20分钟，随后冰上终止反应。
优选地，步骤(3)中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带(即为检测带)，而且质控线位置出现条带(即为质控带)，则表明该样品中含有小麦纹枯病菌，若试纸条仅质控线位置出现条带(即为质控带)，则表明该样品中不含有小麦纹枯病菌。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将RPA技术应用到小麦纹枯病菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点；其中RPA引物和探针基于小麦纹枯病菌ITS序列设计，可稳定扩增且特异性较高，对小麦纹枯病菌的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，可在38℃下和30min内完成对小麦纹枯病菌DNA的恒温扩增和可视化检测，无需PCR仪、凝胶电泳和成像系统，极大提高检测效率，解决了现有常规检测手段所需时间较长、对仪器设备条件和实验人员素质要求高的现象。由此可见，建立的土壤中小麦纹枯病菌RPA检测方法操作简单且结果易判定，为小麦纹枯病的早期诊断和指导科学施药提供有力技术支持。
附图说明
图1为实施例2小麦纹枯病菌RPA检测方法的建立的检测结果图；
图2为实施例3小麦纹枯病菌RPA引物和探针的特异性检测结果图；
图3为实施例4小麦纹枯病菌RPA引物和探针的灵敏度检测结果图；
图4为实施例5皖北麦区小麦纹枯病发病情况的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液均购自英国TwistDX公司，商品编号TANFO02KIT；其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以RPA冻干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个RPA扩增反应在RPA反应管中进行。
实施例1
将小麦纹枯病菌用于RPA引物和探针的筛选。根据TwistDX操作手册要求，以小麦纹枯病菌ITS序列为靶标，设计用于RPA试剂盒(TwistAmp nfo)的引物并进行筛选，得到扩增效率高、灵敏度和特异性最好的引物对。筛选得到的最佳引物(即为RPA引物的上下游引物)序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。随后，对上述引物进行修饰，在RPA引物的下游引物5’端加入一个生物素(Biotin)标记位点，另外，根据RPA引物扩增片段设计一条大小为45bp-54bp的探针，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3-Spacer修饰，且在探针中间距5’端33bp处进行THF修饰。最后根据要求筛选得到用于检测小麦纹枯病菌的灵敏度高、特异性强的RPA引物和探针，它们的序列如下：
上游引物Rc-RPA-F(SEQ ID No.1)：5’-TTTTGCAGATTCACGTCTGCTCCTCTTAAATGC-3’，
下游引物Rc-RPA-R(SEQ ID No.2)：5’-Biotin-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTT-3’；
探针Rc-LF-Probe(SEQ ID No.3)：5’-FAM-CGGTTCCACTCGGCGTGATAAGTATCACTCGC-(THF)-TGAGGACGCTCTTGAAAA-(C3-Spacer)-3’。
实施例2
小麦纹枯病菌RPA检测方法的建立
本实施例的用于检测小麦纹枯病菌的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用实施例1中所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：38℃下反应20分钟，随后冰上终止反应；
步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
(3)分析RPA扩增产物；取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液(取上述1μL RPA扩增产物加入49μL PBST缓冲液中混匀，其中所述的PBST缓冲液中含0.1％吐温-20的PBS缓冲液)，将试纸条(Milenia Genline Hybridetect-1，德国Milenia Biotec公司)上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有小麦纹枯病菌，若试纸条仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有小麦纹枯病菌。
如图1所示，分别进行阳性对照模板与阴性对照模板的试验，阳性对照模板为小麦纹枯病菌的DNA，阴性对照模板为ddH2O。图1中的标号“1”指的是阳性对照模板的检测结果图，可见试纸条的检测线位置出现条带，且质控线位置出现条带；图1中的标号“2”指的是阴性对照模板的检测结果图，可见试纸条仅质控线位置出现条带。
上述图1的检测结果图表明本发明RPA引物和探针可稳定扩增。
实施例3
小麦纹枯病菌RPA引物和探针的特异性检测
本实施例的用于检测小麦纹枯病菌的检测方法同实施例2，不同在于：
所述的样品分别为小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、根腐平脐乳孢、禾谷镰孢菌、假禾谷镰刀菌、玉米纹枯病菌、层出镰孢菌、棉花立枯病菌。
如图2所示，图2中的标号“1”指的是小麦纹枯病菌的检测结果，图2中的标号“2”指的是小麦全蚀病菌的检测结果，图2中的标号“3”指的是根腐平脐乳孢的检测结果，图2中的标号“4”指的是禾谷镰孢菌的检测结果，图2中的标号“5”指的是假禾谷镰刀菌的检测结果，图2中的标号“6”指的是玉米纹枯病菌的检测结果，图2中的标号“7”指的是层出镰孢菌的检测结果，图2中的标号“8”指的是棉花立枯病菌的检测结果；
上述图2的检测结果图表明，仅小麦纹枯病菌的检测结果的检测线位置和质控线位置同时出现条带，而其他病菌的检测结果仅质控线位置出现条带，这表明本发明RPA引物和探针特异性较高。
实施例4
小麦纹枯病菌RPA引物和探针的灵敏度检测
本实施例的用于检测小麦纹枯病菌的检测方法同实施例2，不同在于：
提取小麦纹枯病菌菌丝的基因组DNA，按10倍梯度依次稀释为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0fg/μL。
如图3所示，其标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”、“9”、“10”分别指的是不同浓度(100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0fg/μL)基因组DNA的检测结果。
上述图3的检测结果图表明，小麦纹枯病菌DNA的检出限为1pg/μL。
实施例5
皖北麦区小麦纹枯病菌发病情况
为了验证小麦纹枯病菌的RPA检测技术的实用性，对采集自皖北麦区10份小麦纹枯病菌发病田块的土壤分别进行RPA检测，土壤中小麦纹枯病菌的RPA检测方法同实施例2。
图4为发病土壤的检测结果图，标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”、“9”、“10”分别指的是10份小麦纹枯病菌发病田块的土壤，标号“11”指的是健康土壤。
上述图4的检测结果图表明，10份小麦纹枯病菌发病田块的土壤中均能检测到小麦纹枯病菌，而健康土壤中未能检测到小麦纹枯病菌，这表明本发明小麦纹枯病菌RPA引物和探针具有较强的实用性。
综上所述，由实施例1-5可见，本发明RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将RPA技术应用到小麦纹枯病菌的分子检测方面，可在30min内完成小麦纹枯病菌的可视化检测，极大提升了土壤中小麦纹枯病菌的检测效率，同时降低对仪器设备、实验人员素质的要求，为小麦纹枯病的早期诊断、病害测报和农药减量使用提供了有力的技术支持。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法
<141> 2018-08-05
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)
<400> 1
ttttgcagat tcacgtctgc tcctcttaaa tgc 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)
<400> 2
ttagtttctt ttcctccgct tattgatatg ctt 33
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)
<400> 3
cggttccact cggcgtgata agtatcactc gctgaggacg ctcttgaaaa 50

Claims (9)

1.一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的RPA引物和RPA探针，其特征在于：
所述的RPA引物基于小麦纹枯病菌ITS序列设计，
所述的RPA引物的上游引物如SEQ ID No：1所示，
所述的RPA引物的下游引物如SEQ ID No：2所示；
所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，
所述的RPA探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
2.根据权利要求1所述的用于检测土壤中小麦纹枯病菌的RPA引物和RPA探针，其特征在于：
所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No：2所示的序列，且其5’端用Biotin修饰；
所述的RPA探针包括如SEQ ID No：3所示的序列，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
3.一种含有权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针用于检测土壤中小麦纹枯病菌的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括RPA反应管、阳性对照模板、阴性对照模板中的至少一种。
5.一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的检测方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增产物。
6.根据权利要求5所述的用于检测土壤中小麦纹枯病菌的检测方法，其特征在于：所述的RPA引物和RPA探针的检出限为1pg/μL。
7.根据权利要求5所述的用于检测土壤中小麦纹枯病菌的检测方法，其特征在于：步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
8.根据权利要求5所述的用于检测土壤中小麦纹枯病菌的检测方法，其特征在于：步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-45℃下反应20分钟，随后冰上终止反应。
9.根据权利要求5-8任意一项所述的用于检测土壤中小麦纹枯病菌的检测方法，其特征在于：步骤(3)中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有小麦纹枯病菌，若试纸条的仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有小麦纹枯病菌。
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