CN102220428A - 一种利用ssr法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用SSR法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法，特别是一种利用SSR分子标记对丰两优一号或者丰两优香一号种子进行纯度检验的方法。其利用引物P1和P2分别对两系杂交水稻品种丰两优一号及其父母本，或者丰两优香一号及其父母本的基因组DNA进行扩增和琼脂糖电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对丰两优一号或丰两优香一号样品进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致。适用于对丰两优一号或丰两优香一号两系杂交水稻及其亲本真实性和品种纯度的检验。
Description
技术领域
本发明属于种子质量检验技术领域，涉及杂交水稻种子纯度的检验方法，特别是一种利用SSR标记对丰两优一号或丰两优香一号两系杂交稻种子进行纯度检验的方法。
背景技术
我国首创的两系杂交水稻技术经过多年的研究，目前已大面积推广应用。但由于两系杂交水稻的母本为一种光、温敏核不育系，易受外界环境影响，经研究，当环境温度低于23.5℃时，不育系的育性开始转化，能够自交结实，影响杂交种子纯度。为保证丰两优一号或丰两优香一号两系杂交水稻种子用种安全，必须强化对其纯度的检测。
目前。种子纯度的鉴定通常采用田间小区种植鉴定和室内纯度检验的方法。田间小区种植鉴定是一种后控检验法，杂交水稻通常在海南进行越冬种植鉴定，一般在次年3月下旬才获得鉴定结果，这往往滞后于种子的销售行为。因此，此法不能很好地满足种子生产经营的需要。室内纯度检验通常采用DNA指纹鉴定技术和蛋白质指纹鉴定。DNA指纹鉴定技术，直接检测品种DNA序列间的差异，不受环境和人为因素影响，是纯度分析的理想技术，该方法具有省时快速、便于操作、成本合理、准确性高等优点。其中，SSR(Simple Sequence Repeat)是在PCR(Polymerase Chain Reaction)基础上发展起来的一种新的分子标记技术，具有高度多态性、共显性、保守性、且仅需少量的DNA、操作简便、重复性好、稳定可靠等优点，在动物、植物、微生物等研究领域中得到了广泛应用。水稻中的SSR标记更是十分丰富，同时农业部也推荐了24对SSR引物用于水稻品种的指纹分析，这些标记资源为开发准确、稳定、快捷、实用的SSR纯度检测方法，并为用于两系杂交稻丰两优一号以及丰两优香一号的纯度检测提供了基础条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够对丰两优一号或丰两优香一号两系杂交稻种子的纯度进行准确、稳定、快捷、实用检测的方法。
其技术方案是：一种利用SSR法对丰两优或丰两优香一号两系杂交稻种子进行纯度检验的方法，其特征在于其具体步骤是：
1)样品DNA提取：将种子浸种24小时后，取发芽4-5天后的幼芽，剪取1cm左右的幼芽，放入PCR管中，并加入NaOH溶液，沸水中煮45sec后加入Tris-HCI(pH 3)，煮沸2min后置冰上冷却，4℃下保存备用；
2)PCR扩增：在PCR反应板内中加入样品DNA提取液、buffer、dNTP、引物、ddH2O和Taq酶；先进行94℃下的预变性4min；接着进行35个循环反应，即94℃下变性15sec，55℃复性15sec，72℃下延伸30sec；最后在72℃下延伸7min；反应完成后，加入buffer终止反应，置4℃环境下保存备用；
3)琼脂糖凝胶电泳：
制胶：在200ml浓度为3％的琼脂糖溶液中加入0.5μg/ml的EB后，倒入专用琼脂糖制胶模板内，插好梳子；
点样：待琼脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，将凝胶放入具有1×TBE电泳液的电泳槽中，使电泳液液面高出凝胶1cm左右；将步骤2)中的PCR扩增产物，对应加入琼脂糖凝胶的点样孔内；
电泳：设定电压200V，将电泳槽与电泳仪的电极连接通电，直至溴酚蓝指示剂迁移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，关闭电源，停止电泳；
4)利用凝胶成像系统拍照记录样品DNA片段的特征谱带；
5)受检种子纯度计算：
用上述方法获取丰两优一号及其父母本电泳谱带或丰两优香一号及其父母本电泳谱带，以杂交种的父母本特征谱带作为对照，找出杂交种与父母本差异的特征谱带，进行一致性分析和评价，并根据杂交种的一致性分析结果，采用下式计算受检样品的种子纯度：
受检样品的种子纯度(％)＝(供检样品幼苗株数-非本品种幼苗株数)/供检样品幼苗株数×100。
其技术效果是：本发明利用引物P1和P2分别对两系杂交水稻品种丰两优一号及其父母本，以及丰两优香一号及其父母本的基因组DNA进行扩增和琼脂糖电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带。通过受检种子纯度计算，对丰两优一号和丰两优香一号样品分别进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致(见附表1、2)：
附表1：丰两优一号SSR法检测纯度与田间种植鉴定纯度对照表
上表表明，采用本发明纯度检验的方法与田间种植纯度鉴定的方法所获得的检测纯度结果，经t测验：二者差异不显著，说明了该两种不同方法检测纯度结果的一致性，同时，也说明了利用SSR分子标记技术不仅适用于对丰两优一号品种及其亲本真实性和种子纯度的检验，而且相对于田间种植纯度鉴定的方法，其纯度检测准确、稳定、快捷、实用。
附表2：丰两优香一号SSR法检测纯度与田间种植鉴定纯度对照表
上表表明，采用本发明纯度检验的方法与田间种植纯度鉴定的方法所获得的检测纯度结果，经t测验：二者差异不显著，说明了该两种不同方法检测纯度结果的一致性；同时，也说明了利用SSR分子标记技术不仅适用于对丰两优香一号品种及其亲本真实性和种子纯度的检验，而且相对于田间种植纯度鉴定的方法，其纯度检测准确、稳定、快捷、实用。
附图说明
图1是以广占63S为母本、香恢一号为父本的两系杂交水稻亲本及其杂交一代丰两优香一号的特性谱带；
图2是以广占63S为母本、9311为父本的两系杂交水稻亲本及其杂交一代丰两优一号特性谱带。
图1、2中的♂表示父本，♀表示母本。
具体实施方式
一种利用SSR法对丰两优一号或丰两优香一号两系杂交稻种子进行纯度检验的方法，其特征在于其具体步骤是：
1)样品DNA提取：将种子浸种24小时后，取发芽4-5天后的幼芽，剪取1cm左右的幼芽，放入96孔PCR管中，每管中加入40μL 0.30mol/L的NaOH溶液，在沸水中煮45sec，然后加入40μL 0.17mol/L的Tris-HCI(pH 3)，在沸水中煮沸2min后置冰上冷却，4℃下保存备用。
2)PCR扩增
①反应体系
反应体系由样品DNA提取液、buffer、dNTP、引物、ddH2O和Taq酶构成。其体积比为：1∶0.8∶1∶0.5∶6.5∶0.2。其中，用于丰两优一号纯度检验的引物序列为，P1F：5’-CTTACAGAGAAACGGCATCG-3’，P1R：5’-GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG-3’。用于丰两优香一号纯度检验的引物序列为，P2F：5’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3’，P2R：5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’。
在配制mixture过程中，始终保持在冰上进行。在最后一步加入Taq酶后，迅速震荡5sec混匀，快速分装到96孔PCR反应板内。样品用矿物油覆盖后，在PCR仪上做扩增反应。
②反应条件
先进行94℃下的预变性4min；接着进行35个循环反应，即94℃下变性15sec，55℃(不同引物要求的适宜退火温度有差异，具体见附录1和附录2)下复性15sec，72℃下延伸30sec；最后在72℃下延伸7min。反应完成后，加入6×Loading buffer终止反应，置4℃环境下保存备用。
3)琼脂糖凝胶电泳
①琼脂糖凝胶制备
将3g琼脂糖加入100ml的5×TBE中搅拌混合均匀后加热，配制成浓度为3％的琼脂糖溶液，室温下冷却至60℃左右时，每200ml琼脂糖溶液中加入0.5μg/ml的EB，然后将琼脂糖溶液倒入专用琼脂糖制胶模板内，之后插好梳子。
②点样
待琼脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，将凝胶放入具有适量(根据电泳槽大小，以淹没琼脂糖溶液凝胶为宜)1×TBE电泳液的电泳槽中，使电泳液液面高出凝胶1cm左右为宜。用分样器分别吸取4μL PCR扩增产物，依次加入琼脂糖凝胶的对应点样孔内。
③电泳
连接好电泳槽与电泳仪的电极后，设定电压200V，接通电源，直至溴酚蓝指示剂迁移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时(约40min左右)，关闭电源，停止电泳。
4)利用凝胶成像系统拍照记录样品DNA片段的特征谱带；
5)受检种子纯度计算：
用上述方法获取丰两优一号及其父母本电泳谱带或丰两优香一号及其父母本电泳谱带，以杂交种的父母本特征谱带作为对照，找出杂交种与父母本差异的特征谱带，进行一致性分析和评价，并根据杂交种的一致性分析结果，采用下列算式计算受检样品的种子纯度：
受检样品的种子纯度(％)＝(供检样品幼苗株数-非本品种幼苗株数)/供检样品幼苗株数×100。
父母本的纯度以标准品种为对照进行一致性分析和评价，并采用上述算式计算受检样品的种子纯度。
Claims (5)
1.一种利用SSR法对丰两优或丰两优香一号两系杂交稻种子进行纯度检验的方法，其特征在于其具体步骤是：
1)样品DNA提取：将种子浸种24小时后，取发芽4-5天后的幼芽，剪取1cm左右的幼芽，放入PCR管中，并加入NaOH溶液，沸水中煮45sec后加入Tris-HCI(pH 3)，煮沸2min后置冰上冷却，4℃下保存备用；
2)PCR扩增：在PCR反应板内加入样品DNA提取液、buffer、dNTP、引物、ddH2O和Taq酶；先进行94℃下的预变性4min；接着进行35个循环反应，即94℃下变性15sec，55℃复性15sec，72℃下延伸30sec；最后在72℃下延伸7min；反应完成后，加入buffer终止反应，置4℃环境下保存备用；
3)琼脂糖凝胶电泳：
制胶：在200ml浓度为3％的琼脂糖溶液中加入0.5μg/ml的EB后，倒入专用琼脂糖制胶模板内，插好梳子；
点样：待琼脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，将凝胶放入具有1×TBE电泳液的电泳槽中，使电泳液液面高出凝胶1cm左右；将步骤2)中的PCR扩增产物，对应加入琼脂糖凝胶的点样孔内；
电泳：设定电压200V，将电泳槽与电泳仪的电极连接通电，直至溴酚蓝指示剂迁移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，关闭电源，停止电泳；
4)利用凝胶成像系统拍照记录样品DNA片段的特征谱带；
5)受检种子纯度计算：
用上述方法获取丰两优一号及其父母本电泳谱带或丰两优香一号及其父母本电泳谱带，以杂交种的父母本特征谱带作为对照，找出杂交种与父母本差异的特征谱带，进行一致性分析和评价，并根据杂交种的一致性分析结果，采用下式计算受检样品的种子纯度：
受检样品的种子纯度(％)＝(供检样品幼苗株数-非本品种幼苗株数)/供检样品幼苗株数×100。
2.根据权利要求1所述的一种利用SSR法对丰两优或丰两优香一号两系杂交水稻种子纯度检验的方法，其特征在于：所述样品DNA提取液中的NaOH溶液与Tris-HCI溶液的体积比为1∶1。
3.根据权利要求1所述的一种利用SSR法对丰两优或丰两优香一号两系杂交水稻种子纯度检验的方法，其特征在于：所述PCR扩增中的样品DNA提取液、buffer、dNTP、引物、ddH2O和Taq酶的体积比为：1∶0.8∶1∶0.5∶6.5∶0.2。
4.根据权利要求1或3所述的一种利用SSR法对丰两优或丰两优香一号两系杂交水稻种子纯度检验的方法，其特征在于：所述PCR扩增中的引物，用于丰两优一号纯度检验的引物序列为，P1F：5’-CTTACAGAGAAACGGCATCG-3’，P1R：5’-GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG-3’。用于丰两优香一号纯度检验的引物序列为，P2F：5’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3’，P2R：5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’。
5.根据权利要求1所述的一种利用SSR法对丰两优或丰两优香一号两系杂交水稻种子纯度检验的方法，其特征在于：所述浓度为3％的琼脂糖溶液由3g的琼脂糖溶解于100ml的5×TBE配制而成。
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Chen Qingquan Inventor after: Zhou Guilin Inventor after: Wang Zhaoxian Inventor after: Jiang Jiwu Inventor after: Gao Qianbao Inventor after: Zhu Xianfei Inventor after: Wang Huachun Inventor after: Cheng Guowang Inventor before: Zhou Guilin Inventor before: Chen Qingquan Inventor before: Wang Zhaoxian Inventor before: Jiang Jiwu Inventor before: Gao Qianbao Inventor before: Zhu Xianfei Inventor before: Wang Huachun Inventor before: Cheng Guowang |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHOU GUILIN CHEN QINGQUAN WANG ZHAOXIAN JIANG JIWU GAO QIANBAO ZHU XIANFEIWANG HUACHUN CHENG GUOWANG TO: CHEN QINGQUAN ZHOU GUILIN WANG ZHAOXIAN JIANG JIWU GAO QIANBAO ZHU XIANFEI WANG HUACHUN CHENG GUOWANG |
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| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20111019 |