CN105002163A - 一种用于提取水稻dna的试剂盒和水稻dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水稻DNA的提取方法，包括：在水稻幼苗或叶片中加入氢氧化钠水溶液，沸水中煮20s～40s后加入盐酸水溶液和缓冲溶液，继续在沸水中煮1～3min，得到水稻DNA样品；所述缓冲溶液包括Tris溶液和IGEPAL-630溶液。本发明还提供了一种水稻DNA提取试剂盒，包括：氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液，所述缓冲溶液包括Tris溶液和IGEPAL-630溶液。本发明提供的方法提取的水稻DNA可用于PCR，简单、准确、快速、经济。

Description

一种用于提取水稻DNA的试剂盒和水稻DNA的提取方法

技术领域

本发明属于DNA提取技术领域，尤其涉及一种用于提取水稻DNA的试剂盒和水稻DNA的提取方法。

背景技术

随着生物技术的不断发展，基于PCR技术为基础的分子标记已广泛应用用于杂交种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。为了应用PCR检测技术，人们需要从组织样品中提取DNA。然而，DNA提取是一项耗费人力、物力的繁琐工作。尽管人们一直致力于改进DNA抽提方法的技术探讨，但目前应用的主要方法仍然烦琐费时。因此，建立高效、快速、简便的用于PCR的基因型检测的模板DNA制备显得非常重要。目前较为常用的提取水稻DNA方法为CTAB法，但其仍存在着如下缺陷：1：需要碾磨破碎组织样品；2：需要离心、沉淀、抽提等过程；3：需要使用氯仿、异戊醇等有毒化学试剂。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于提取水稻DNA的试剂盒和水稻DNA的提取方法，本发明提供的方法提取的水稻DNA可用于PCR，简单、准确、快速、经济。

本发明提供了一种水稻DNA的提取方法，包括：

在水稻幼苗或叶片中加入氢氧化钠水溶液，沸水中煮20s～40s后加入盐酸水溶液和缓冲溶液，继续在沸水中煮1～3min，得到水稻DNA样品；所述缓冲溶液包括Tris溶液和IGEPAL-630溶液。

本发明以水稻幼苗或叶片作为原料，所述水稻幼苗或叶片按照以下方法获得：

将水稻种子浸种1～2天，30～32℃发芽3～7天，优选32℃发芽3～7天。

发芽后，剪取1cm长的幼苗或叶片放入96孔PCR板中，每孔1根苗，可立即用于DNA提取或贮存于-20℃冰箱中保存备用。

提取DNA时，向每孔加入氢氧化钠水溶液，在沸水中煮20～40s，优选煮30s，然后加入盐酸水溶液和缓冲溶液，沸水中煮1～3min，优选2min，即可得到水稻DNA样品。

其中，所述氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液的体积比为1～3:1～3:1～3，优选为2:2:1。所述氢氧化钠水溶液的浓度为250mmol/L；所述盐酸水溶液的浓度为250mmol/L；所述缓冲溶液包括Tris溶液和IGEPAL-630溶液，所述Tris溶液的浓度为500mmol/L，所述IGEPAL-630溶液的体积浓度为0.25％。

使用96孔PCR板进行水稻DNA提取时，根据水浴锅的大小，依次可提1～4块PCR板样品，即1×96～4×96个样品。提取时，每孔加入40微升浓度为250mmol/L的氢氧化钠水溶液，沸水中煮30s，然后加入40微升浓度为250mmol/L的盐酸水溶液和20微升缓冲溶液，其中，缓冲溶液包括500mmol/L、pH值为8.0的Tris溶液和体积浓度为0.25％的IGEPAL-630溶液，在沸水中煮2min，获得水稻DNA样品。

按照本发明获得的水稻DNA样品可用于PCR反应，其中，1微升DNA样品溶液可用于10微升PCR反应体积进行PCR反应。该DNA样品在-4℃冰箱中可保持1星期左右，在-20℃冰箱中可保持1个月左右。本发明使用的提取试剂可在常温下保存。

本发明还提供了一种水稻DNA提取试剂盒，包括：氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液，所述缓冲溶液包括Tris溶液和IGEPAL-630溶液。

其中，所述氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液的体积比为1～3:1～3:1～3，优选为2:2:1。所述氢氧化钠水溶液的浓度为250mmol/L；所述盐酸水溶液的浓度为250mmol/L；所述缓冲溶液中，所述Tris溶液的浓度为500mmol/L，所述IGEPAL-630溶液的体积浓度为0.25％。

与现有技术相比，本发明提供的DNA提取方法具有如下优点：

1、简单：本发明提供的DNA提取方法简单，不需要使用高速冷冻离心机等贵重仪器，不需要使用氯仿、异戊醇等有毒化学试剂，也不需要离心、沉淀、抽提等过程。整个DNA提取只有2个简单的加样过程，一般的技术工人便可以进行操作。

2、准确：实验结果表明，采用本发明提供的提取水稻DNA方法与通用的CTAB提取的DNA，PCR结果比较没有差别。

3、快速：本发明提供的提取水稻DNA用于PCR的方法快速简单，提取一批样品只需2.5分钟，一个训练工作人员在1小时内可完成10000份水稻幼苗的DNA提取，简便快捷，经济实用。

4、经济：本发明提供的提取水稻DNA用于PCR的方法与通用的CTAB方法提取DNA相比，每个样品的试提取成本降低1000倍(劳动力成本除外)，详细比较见表1。

表1 CTAB法与本发明提供的DNA提取方法比较

项目	CTAB方法	本发明
			所用试剂种类	10种以上	4种
一次提取样品量	小于16个	大于96个
			一次样品提取所需时间	6小时以上	2.5分钟
每个样品试剂提取成本	每个样品大于5元	100个样品小于2.5元
			方法的难易度	难度大，需专门培训	易于操作，人人都能做

5、本发明提供的提取水稻DNA用于PCR的方法除可用于水稻幼苗和叶片外，可适用于所有禾本科作物幼苗和叶片用于PCR的DNA的提取，同时可用于西瓜、油菜、辣椒等作物幼苗和叶片用于PCR的DNA的提取。

附图说明

图1为本发明实施例4提供的方法获得的水稻DNA PCR扩增结果图；

图2为本发明实施例提供的水稻DNAPCR扩增结果图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下各实施例中，DNA提取试剂1为250mM NaoH。DNA提取试剂2为250mM HCl。DNA提取试剂3为500mM Tris(pH8.0)和0.25％(V/V)IGEPAL-630。

实施例1

以袁隆平院士为组长的专家组用威20A、威优46、密阳46，培矮64S、两优培九、R9311等6个材料，分别取上述种子浸泡2天后，32℃下发芽7天；每个品种分别剪取1cm长的2个幼苗，放入96孔PCR板的12个孔中，每孔1根苗。每孔加入40μl DNA提取缓冲液1，在沸水中30秒，然后加入40微升DNA提取试剂2和20微升DNA提取试剂3,放入沸水中2分钟，分别提取得到不同品种的DNA样品进行PCR扩增。结果表明，采用本发明提供的方法可在2.5小时内将6个品种准确区分，准确率为100％。

实施例2

四川省种子站用水稻种子浸泡2天后，32℃下发芽7天；剪取1cm长的幼苗，放入96孔PCR板孔中，每孔1根苗。每孔加入40μl DNA提取缓冲液1，在沸水中30秒，然后加入40微升DNA提取试剂2和20微升DNA提取试剂3,放入沸水中2分钟，提取得到水稻DNA样品。结果表明，采用本发明提供的方法可快速提取水稻幼苗DNA进行水稻纯度的鉴定，提取的DNA可以满足PCR的用量。同时，该方法操作简单，提高了水稻纯度鉴定的速度。

实施例3

湖北省种子站用水稻种子浸泡2天后，32℃下发芽7天；剪取1cm长的幼苗，放入96孔PCR板孔中，每孔1根苗。每孔加入40μl DNA提取缓冲液1，在沸水中30秒，然后加入40微升DNA提取试剂2和20微升DNA提取试剂3,放入沸水中2分钟，提取得到水稻DNA样品。结果表明，采用本发明提供的方法提取一批样品DNA平均只需2.5分钟，速度快，提取方法简单，需不要离心、沉淀、抽提等过程，操作简单，不使用高速离心机等仪器和氯仿、异戊醇等时机，具有较强的经济性和实用性。PCR扩增后利用琼脂糖凝胶电泳检测效果蠡县，可满足纯度鉴定试验的要求。

实施例4

江西省种子质量监督管理站用水稻种子浸泡2天后，32℃下发芽7天；剪取1cm长的幼苗，放入96孔PCR板孔中，每孔1根苗。每孔加入40μl DNA提取缓冲液1，在沸水中30秒，然后加入40微升DNA提取试剂2和20微升DNA提取试剂3,放入沸水中2分钟，提取得到水稻DNA样品。结果参见图1，图1为本发明实施例4提供的方法获得的水稻DNAPCR扩增结果图。结果表明，本发明提供的方法操作简单快捷不需要离心、沉淀、抽提等过程，一名实验员一个工作日内能完成数千粒种子的DNA提取；提取效果高，从1cm水稻嫩苗中提取的量足以完成PCR检测，而且可以保证无空管；能够在室内实现多次重复检测种子纯度，参见图2，图2为本发明实施例提供的水稻DNAPCR扩增结果图。

本发明利用上述方法对来自全国500余家种子企业26661份杂交水稻样品(26661×96个样本)的进行纯度检测，检测出不合格样品9546份。检出不合格样品9546份，按每份样品1万公斤种子计算，检出了9546万公斤不合格种子，不合格种子的平均纯度88.05％(2009-2014年不合格种子的平均纯度为88.4％)。按1公斤样品种植1亩大田，可种植大田9546万亩。按国家不合格种子的赔偿标准，纯度低于96％，每降低一个百分点，赔偿4公斤，累计减少稻谷损失303562.8(9546×4×7.95)万公斤。按2008年稻谷收购价2元/公斤计算，为企业避免经济损失607125.6万元。为粮食生产安全提供了保障。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种用于提取水稻DNA的试剂盒，包括：氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液，所述缓冲溶液包括Tris溶液和IGEPAL-630溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液的体积比为1～3:1～3:1～3。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液的体积比为2:2:1。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述氢氧化钠水溶液的浓度为250mmol/L；

所述盐酸水溶液的浓度为250mmol/L；

所述缓冲溶液中，所述Tris溶液的浓度为500mmol/L，所述IGEPAL-630溶液的体积浓度为0.25％。

5.一种水稻DNA的提取方法，包括：

在水稻幼苗或叶片中加入氢氧化钠水溶液，沸水中煮20s～40s后加入盐酸水溶液和缓冲溶液，继续在沸水中煮1～3min，得到水稻DNA样品；所述缓冲溶液包括Tris溶液和IGEPAL-630溶液。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述水稻幼苗或叶片按照以下方法获得：

将水稻种子浸种1～2天，30～32℃发芽3～7天。

7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液的体积比为1～3:1～3:1～3。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液的体积比为2:2:1。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述氢氧化钠水溶液的浓度为250mmol/L；

所述盐酸水溶液的浓度为250mmol/L；

所述缓冲溶液中，所述Tris溶液的浓度为500mmol/L，所述IGEPAL-630溶液的体积浓度为0.25％。