CN108866228B - 一种不同产地红花的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定红花产地的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1～40所示的20对SSR引物。本发明还提供了一种鉴定红花产地的方法。本发明提供的检测方法可以准确、有效地区分红花种子的产地，成本低廉，为红花种子的真实性和纯度快速鉴定提供了条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种红花产地的鉴别方法，
背景知识
红花(Carthamus tinctorius L.)是菊科的一种重要的经济作物。红花的干燥管状花，为活血化瘀常用中药，也是重要的染料及化妆品原料。其种子是重要的油料来源，由于其富含亚油酸，越来越为品质生活所追求。此外，红花叶还可作为保健茶使用。
随着红花大面积的种植，亟待加强对红花种质质量的检测。品种真实性和品种纯度鉴定是种子质量检测中最为重要的因素之一。不同产地红花彼此引种而不加强种子真实性和纯度的检测，将会严重影响农户红花的产量和质量。目前植物品种的鉴定方法主要有形态学鉴定、细胞学鉴定和生理学鉴定，但这些方法的标记物少、分辨率低，很难满足红花繁多产地的鉴定需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种利用SSR位点多态性扩增检测红花产地的方法。
本发明提供了一组引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～40所示。
本发明还提供了一种用于鉴定红花产地的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～40所示的20对SSR引物。
其中，所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂。
其中，所述试剂盒还包括DNA提取用试剂和电泳用试剂。
本发明还提供了前述试剂盒在鉴定红花产地中的用途。
其中，所述红花是产地为云南大理巍山县、云南楚雄元谋县、新疆伊犁霍城县果子沟、新疆焉耆县永宁镇、新疆乌鲁木齐米东区、新疆塔城裕民县、新疆塔城托里县新疆昌吉奇台县、新疆昌吉吉木萨尔县、新疆伊犁察县海努克、四川简阳市、内蒙古乌海市乌达区或甘肃玉门市花海镇的红花。
本发明还提供了一种鉴定红花产地的方法，它是采用前述试剂盒鉴定。
所述方法包括如下步骤：
(1)提取样本DNA：取待检红花样品，提取其中的DNA；
(2)基因扩增：用前述的试剂盒对待检样本进行PCR扩增；
(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
步骤(1)中，所述待检红花样品是产地为云南大理巍山县、云南楚雄元谋县、新疆伊犁霍城县果子沟、新疆焉耆县永宁镇、新疆乌鲁木齐米东区、新疆塔城裕民县、新疆塔城托里县新疆昌吉奇台县、新疆昌吉吉木萨尔县、新疆伊犁察县海努克、四川简阳市、内蒙古乌海市乌达区或甘肃玉门市花海镇的红花。
步骤(3)中，将扩增结果与图4进行比对，确定红花产地。
本发明提供的试剂盒和方法可以有效鉴别不同产地的红花，克服现有方法鉴别红花存在的问题，成本低廉，为红花种子真实性和纯度快速鉴定提供了条件，应用前景优良。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1DNA琼脂糖电泳检测图。M：2000bp DNA Marker，1-13分别对应A-M，代表13个不同产地的红花DNA提取；
图2差异引物筛选示例。1-6代表不同产地红花材料，1代表A云南大理巍山县；2代表C新疆伊犁霍城县果子沟；3代表E新疆乌鲁木齐米东区；4代表K四川简阳市；5代表L内蒙古乌海市乌达区；6代表M甘肃玉门市花海镇；
图3SSR指纹图谱构建过程(以编号E新疆乌鲁木齐米东区为例)。M：1500bp DNAMarker，1-20代表筛选的20对引物；
图4不同产地红花SSR指纹图谱。M：1500DNA Marker，1-20代表筛选的20对差异引物，A-M代表不同产地红花，具体产地的对应关系如表1所示。
具体实施方式
实施例1红花鉴别方法的建立
1、材料
红花材料：全国13个产地红花为课题组实地采样收集，于2017年10月种植于成都中医药大学温江校区药用植物园。13个产地信息见表1。实验时取其叶片。
备选引物：SSR引物基于在线红花基因组数据进行设计[Bowers J E,Pearl S A,Burke J M.Genetic Mapping of Millions of SNPs in Safflower(CarthamustinctoriusL.)via Whole-Genome Resequencing:[J].G3Genesgenetics,2016,6(7):2203-2211.]，设计了93对引物，由北京擎科新业生物技术有限公司合成(Tsingke,Beijing,China)(引物序列见表2)。
试剂：同实施例1的试剂。
表1红花产地信息
表2SSR候选引物信息
2、试验方法
2.1、DNA提取
对13个产地的红花叶片进行DNA提取，严格按照试剂盒操作进行。
2.2、DNA检测
对提取得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，均提取成功；结果如图1所示。
2.3、引物筛选
实验选择6个产地距离较远的6个红花材料用于引物筛选，实验采用了93份引物与6个红花DNA分子进行PCR扩增，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测反应体系：总体积20μl，包括2μl的引物(一个体系对应一对引物)、1μl的DNA模板、7μl的ddH2O、10μl Mastermix酶(蓝色)。
反应程序：95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共34个循环；72℃延伸8min，12℃保温。
选取条带清晰、重复性好、差异较大的引物，差异引物筛选过程如图2。经选择，最终从93份引物中筛选到20对SSR引物可以用于鉴别红花。
20对可用于鉴别红花的SSR引物：
2.4、图谱构建
对同一个产地(以编号E新疆乌鲁木齐米东区为例)，利用筛选的20个引物，首先进行PCR反应，进行聚丙烯凝胶电泳。同时，绘制表格，对应聚丙烯泳带，将聚丙烯电泳条带绘制在表格上，构建该产地SSR指纹图谱。具体过程如图3所示。
3、结果
如图4所示，13个产地的红花均得到了清晰且特异的指纹图谱。
实验结果说明，本发明寻找到了能够鉴别表1所示13个产地的红花的SSR引物，可以用于表1所示13个产地的红花鉴别。
实施例2红花产地鉴定方法
1、SSR引物
表3 20对SSR引物(由北京擎科新业生物技术有限公司合成)：
2、材料和试剂
材料：红花叶片
引物：表3所述引物。
试剂：Master mix酶和去离子水(ddH2O)以及提取植物基因组DNA提取试剂盒均由天根公司提供。琼脂糖粉、硼酸、EDTA。以及电泳用的试剂，见表4。
表4聚丙烯酰胺凝胶电泳所需溶液配制
3、检测方法
3.1DNA提取
严格按照试剂盒说明书提取红花叶片的DNA。
3.2SSR-PCR引物扩增
反应体系：总体积20μl，包括2μl的引物(一个体系对应一对引物)、1μl的DNA模板、7μl的ddH2O、10μl Mastermix酶(蓝色)。
反应程序：95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共34个循环；72℃延伸8min，12℃保温。
3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
将长、短两玻璃板用清水洗净擦干后喷洒无水乙醇并擦拭干净。将长板用无尘卫生纸涂亲和硅烷2ml，涂抹均匀；短板用无尘卫生纸涂剥离硅烷2ml，涂抹均匀；晾干后将玻璃板两侧分别放置胶条，并用均匀对称的夹子加紧长、短两玻璃板。取50ml PAGE胶，在灌胶前加入180μl 10％过硫酸铵和45μl TEMED。水平灌胶，胶成形后安装垂直电泳仪((PS9009BIOMETRA)，在电泳槽上下加入1x TBE，并用移液枪冲洗电泳孔，1200V或75W下进行预电泳15min，预电泳后再次冲洗电泳孔。将样品中加入二甲苯青染色液约4μl，1200V或75W下进行电泳40min。电泳完后取下玻璃板并分离长、短两玻璃板，将长玻璃板放入固定液中固定约30min(指示剂由蓝变黄)后用超纯水漂洗1-3min，再将长玻璃板放入银染液中银染30min，并用超纯水漂洗30s。将长玻璃板放入显影液中显影，待条带清晰后终止显影，照相以便分析。
3.4构建图谱和对比图谱
根据20对引物分别扩增得到的电泳图谱，与图4的图谱相比较，即可鉴定所测红花样品的产地。
本发明提供的试剂盒和方法可以有效鉴别不同产地的红花，克服现有方法鉴别红花存在的问题，为快速检测红花种子真实性提供了条件，应用前景优良。
序列表
<110> 成都中医药大学
<120> 一种不同产地红花的鉴别方法
<130> GY041-18P1339
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 1
acccatgtca atgtactctt cgt 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 2
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<210> 3
<211> 22
<212> DNA
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<400> 3
atccgttctt cttctagcac ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 4
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<212> DNA
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agaggagtcg atcttgtgaa gg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 14
gagaggtgat acgagaagcc at 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 15
gattccgtgc attctacaca aa 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 16
gaggaacgaa ctaggaaggg tt 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 17
ctgtaattct gcaactgaga ccc 23
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 18
gaagccattt tccacgattt c 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 19
aataccccgc catcatagat ta 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 20
gagctattcg acaaccaaat cc 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 21
tgcgacttgt gtttcttctt ccc 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 22
aaaagccgtc cggtgaaatt g 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 23
aacctgtgta ccatctgcta attg 24
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 24
atgagatccg aagtccattg tt 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 25
gagcatgaaa cggagaatta gg 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 26
tcaacagtag cagatccttc ca 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 27
gttgttcgtt tgccccaatc tg 22
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 28
cagagccaca agatgccgaa tta 23
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 29
aagtatttga acaagtgtac cggc 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 30
agatgatgaa ggaaggaggt aatg 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 31
taagaaaggg caccattgaa gtag 24
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 32
gatatgagca gaggagtttg tgc 23
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 33
cagggacatc agtttgagga g 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 34
tgttggtgct aacaaagaac c 21
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 35
aagtaacaga taagatttca acagctc 27
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 36
cgatggtatg aatagtcgtc gt 22
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 37
gtccaagacc cgagatgaag 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 38
agattggatt gccgataaat g 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 39
taacccgcat tcttggtttt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 20对SSR引物(artificial)
<400> 40
ccctatctgt gtgagcctga 20
Claims (8)
1.一种用于鉴定红花产地的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1~40所示的20对SSR引物；所述红花是产地为云南大理巍山县、云南楚雄元谋县、新疆伊犁霍城县果子沟、新疆焉耆县永宁镇、新疆乌鲁木齐米东区、新疆塔城裕民县、新疆塔城托里县、新疆昌吉奇台县、新疆昌吉吉木萨尔县、新疆伊犁察县海努克、四川简阳市、内蒙古乌海市乌达区或甘肃玉门市花海镇的红花。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA提取用试剂和电泳用试剂。
4.权利要求1~3任意一项所述试剂盒在鉴定红花产地中的用途；所述红花是产地为云南大理巍山县、云南楚雄元谋县、新疆伊犁霍城县果子沟、新疆焉耆县永宁镇、新疆乌鲁木齐米东区、新疆塔城裕民县、新疆塔城托里县、新疆昌吉奇台县、新疆昌吉吉木萨尔县、新疆伊犁察县海努克、四川简阳市、内蒙古乌海市乌达区或甘肃玉门市花海镇的红花。
5.一种鉴定红花产地的方法，其特征在于：它是采用权利要求1~3任意一项所述试剂盒鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
（1）提取样本DNA：取待检红花样品，提取其中的DNA；
（2）基因扩增：用权利要求1~3任意一项所述的试剂盒对待检样本进行PCR扩增；
（3）结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述待检红花样品是产地为云南大理巍山县、云南楚雄元谋县、新疆伊犁霍城县果子沟、新疆焉耆县永宁镇、新疆乌鲁木齐米东区、新疆塔城裕民县、新疆塔城托里县新疆昌吉奇台县、新疆昌吉吉木萨尔县、新疆伊犁察县海努克、四川简阳市、内蒙古乌海市乌达区或甘肃玉门市花海镇的红花。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，将扩增结果与产地SSR指纹图谱进行比对，确定红花产地。
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Citations (2)
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