CN105420235B - 黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的Indel标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明“黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的Indel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的Indel标记，其中所述标记引物的核苷酸序列为：Indelpe02‑F/Indelpe02‑R:TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG；所述Indel标记扩增的与黄瓜栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带为125bp，核苷酸序列见Seq ID No.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带为130bp，核苷酸序列见Seq ID No.2；采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断其表皮细胞结构为栅栏状还是扁平状，该标记具有高效、限制少的优点，对选育果实具有栅栏状表皮细胞的加工型黄瓜材料提高了效率，缩短了育种周期。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术辅助育种技术领域，特别涉及一种黄瓜栅栏状表皮细胞基因Pe的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
背景技术
黄瓜栽培广泛，历史悠久，类型和品种十分丰富，根据果实用途，可将黄瓜分为鲜食黄瓜和加工黄瓜。加工黄瓜对原材料果实有特殊的要求，一般要求瓜条顺直，皮色均匀，肉质较厚，皮质紧密。黄瓜果实表皮细胞指黄瓜果实最外层的一层细胞，表皮细胞能减少果实水分散失，保护果实免受物理伤害，位于表皮上的气孔能调节果实与外界气体的交换。不同结构形状的表皮细胞对于果实所起的作用存在差异，栅栏状的表皮细胞结构能更好的保护果实免受物理伤害，减少水分散失，同时使果实皮质紧密，更适合于加工；扁平状的表皮细胞结构在保护果实免受物理伤害、减少水分散失以及使皮质紧密方面的效果相对较差。
目前，在黄瓜上与果实相关的性状(比如，瓜长、把长、刺瘤、棱、纹等)研究较多，而对于黄瓜果实表皮细胞结构的研究极少，仅见一篇报道。1987年，国外学者Fanourakis以具有栅栏状表皮细胞结构的加工型黄瓜和具有扁平状表皮细胞结构的鲜食性黄瓜为材料，进行了果实栅栏状表皮细胞基因Pe的遗传分析，结果表明，杂交后代F1的果实表皮细胞呈栅栏状排列，F2群体出现了栅栏状结构和扁平状结构的分离，分离比符合栅栏状：扁平状＝3:1。结论认为，黄瓜果实栅栏状表皮细胞结构是由一个单基因(Pe)控制的，其中栅栏状对扁平状为显性，且该基因与果色一致基因u、果瘤基因Tu、无光泽基因D有连锁关系。截止目前，尚未见与Pe基因连锁的分子标记的报道。
发明内容
基于本领域的上述空白，本发明的目的在于提供了一种与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的Indel标记，并提供了该标记在筛选果实具有栅栏状结构表皮细胞的加工黄瓜种质资源上的应用。
本发明的技术方案如下：
一种与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的Indel标记Indelpe02的引物，其特征在于：具有如下核苷酸序列：
Indelpe02-F/Indelpe02-R：
TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG
所述引物扩增的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带为125bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；
所述引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带为130bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
用于筛选包含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的试剂盒，其特征在于，包括所述的Indel标记Indelpe02的引物。
所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。
用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的方法，其特征在于，采用所述的Indel标记Indelpe02的引物和/或所述的试剂盒进行如下步骤：
(1)采用所述Indel标记Indelpe02的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；
(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
(3)从检测结果中筛选出现与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带一致的材料，所述与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带为125bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/μl DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
所述凝胶电泳检测指，采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
所述试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括所述的Indel标记Indelpe02的引物，或
在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有所述的Indel标记Indelpe02的引物。
组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂，或
在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有PCR反应和/或电泳所需的试剂。
本发明提供一种与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的Indel标记Indelpe02的引物，该引物的核苷酸序列如下：Indelpe02-F/Indelpe02-R：
TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG；所述引物扩增的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带为125bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；所述引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带为130bp，其核苷酸序列如SeqID No.2所示。采用本发明所述的Indel标记Indelpe02的引物对黄瓜材料进行PCR扩增检测，能较为准确地测定待测材料中是否含有黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe，可被有效地应用于含有Pe基因的黄瓜材料的分子标记辅助选择育种，从而省去了传统的依靠显微镜观察细胞结构的辨别步骤，大大地节省了获得含有基因Pe的目标材料的筛选时间，提高了育种效率。
基于上述Indel标记Indelpe02的引物，本发明的一些实施例还提供了用于筛选包含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求所述的Indel标记Indelpe02的引物。进一步地，所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。采用试剂盒的形式能进一步完善本发明产品维度，提高本发明产品的便携度，有利于所述Indel标记Indelpe02的引物的推广应用。
在本发明的一些实施例中，本发明还提供了用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的方法，所述方法指，采用所述的Indel标记Indelpe02的引物和/或所述的试剂盒进行如下步骤：(1)采用所述Indel标记Indelpe02的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；(3)从检测结果中筛选出现与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带一致的材料，所述与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带为125bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。采用本发明所述的Indel标记Indelpe02的引物和/或所述的试剂盒，通过上述的步骤，能够较为快速、便捷、准确地获知待测黄瓜材料中是否含有果实栅栏状表皮细胞基因Pe，而无需再对黄瓜材料的细胞结构进行观察，为育种工作节省了时间，提高了效率。
具体地，所述PCR扩增的反应体系为：1.5ng/μl DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。所述凝胶电泳检测指，采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。上述试验参数是本发明根据引物的实际情况摸索调试得出，在上述反应条件下能够使检测结果以最优的形式呈现，从而进一步地提高本发明选择含有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的准确性。
在本发明进一步地实施例中，本发明还请求保护所述的试剂盒的制备方法，任何基于商业目的的生产、制造和/或销售所述试剂盒的行为均属于本发明请求保护的范围。所述行为指，组装试剂盒的试剂中包括所述的Indel标记Indelpe02的引物，或在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有所述的Indel标记Indelpe02的引物。进一步地，组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂，或在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有PCR反应和/或电泳所需的试剂。
本发明以果实具有扁平状结构表皮细胞的黄瓜高代自交系WI2757与果实具有栅栏状结构表皮细胞的黄瓜高代自交系Wis.SMR18为亲本构建F1、F2、BC1P1、BC1P2群体，在盛瓜期采摘商品瓜，制作果实横切面切片，在显微镜下观察商品瓜表皮细胞结构，进行遗传分析。以F2群体为作图材料，利用BSA法和SSR及Indel标记技术，实现Pe基因在染色体上的遗传定位，并获得紧密连锁的Indel标记Indelpe02，与Pe的遗传距离为3.9cM。所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带为125bp，核苷酸序列如Seq ID No.1；所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带为130bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
本发明通过利用WI2757,Wis.SMR18以及其F1(WI2757果实表皮细胞结构为扁平状，Wis.SMR18和F1的果实表皮细胞结构为栅栏状)构建的两个分别包含79和69株的回交群体进行验证，结果表明Indelpe02验证的正确率分别为91.14％和100％。
本试验不仅为黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育果实具有栅栏状表皮细胞结构的加工黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有特定结构表皮细胞的加工黄瓜新品种的方法，该方法中，采用所述Indel标记的特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条125bp条带，这种为显型纯合材料(栅栏状表皮细胞结构)；另一种是130bp条带和125bp条带都出现，这种是显性杂合材料(栅栏状表皮细胞结构)；第三种是仅仅出现130bp条带，这种为隐性纯合材料(扁平状表皮细胞结构)。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行表皮细胞结构鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
附图说明
图1.采用本发明所述的Indelpe02标记的特异性引物验证回交群体的黄瓜材料的电泳检测结果，其中，a、b为Indelpe02在回交群体BC1P1中的验证结果；c、d Indelpe02在回交群体BC1P2中的验证结果；1代表栅栏状结构，2代表扁平状结构；红色字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
生物材料的来源和记载出处
本研究所用的试验材料为黄瓜纯合自交系WI2757和Wis.SMR18。以WI2757为母本，Wis.SMR18为父本杂交，获得F1，自交获得F2群体。本研究所用的验证群体是利用两亲本杂交获得的F1与两亲本回交构建的分别包含79和87株的回交群体BC1P1、BC1P2。
WI2757(P1)：欧洲温室型黄瓜雌性系，生长偏弱，侧枝发达。连续座果多，瓜长10厘米左右，表面多刺，无苦味，果实表皮细胞为扁平状，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《Hortscience》第33卷第6期第1050-1052页上发表的文章《Independenceof the mj nematode resistance gene from 17gene loci in cucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
Wis.SMR18(P2)：美加工型黄瓜自交系，生长势强，侧枝较发达。瓜长15厘米左右，表面稀刺，果肉致密、硬度大，果实表皮细胞结构为栅栏状，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《Hortscience》第33卷第6期第1050-1052页上发表的文章《Independence of the mj nematode resistance gene from 17gene loci incucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
Indel标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用primer 3.0软件设计，并在上海生工公司合成。
主要试剂
SSR引物来自国际黄瓜基因组计划(CUGI)，在Ren et al.，2009；Cavagnaro etal.，2010等文献中有记载；
PCR实验使用的反应混合液GoTaq Green Master Mix购自Shanghai PromeGa公司；
凝胶电泳使用康润公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用
实施例1.黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的Indel标记Indelpe02的获得
步骤1.黄瓜果实表皮细胞结构鉴定
本试验以黄瓜高代自交系WI2757(表皮细胞扁平状排列)和Wis.SMR18(表皮细胞栅栏状排列)为母本和父本，自交获得F1、F2群体，F1与亲本回交获得BC1P1、BC1P2群体。2015年春季，在中国农业科学院蔬菜花卉研究所顺义基地大棚种植六世代群体，于盛瓜期摘商品瓜，制作果实横切面切片，进行表皮细胞结构鉴定。分两种结构，分别为栅栏状结构和扁平状结构。
根据田间调查结果，用SAS9.2软件进行数据统计分析，判断分离比例。
结果显示：后代F1果实表皮细胞均表现栅栏状排列；在226个F2单株中，果实栅栏状表皮细胞结构的植株有168株，果实扁平状表皮细胞结构的植株有58株，经卡方检测，符合3:1比例；BC1P1有79株，果实栅栏状表皮细胞结构植株有37株，果实扁平状表皮细胞结构植株有42株，经卡方检测，符合1:1比例；BC1P2有69株，果实表皮细胞全部为栅栏状结构。表明在该群体中果实表皮细胞结构受一对基因控制，栅栏状结构对扁平状结构为显性。
步骤2.DNA提取和分子标记分析
取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及F1、F2、BC1P1、BC1P2群体各单株的基因组DNA。
PCR反应体系为：总反应体系10μL,3μL DNA(5.0ng·μL-1)，正向和反向引物(50ng·μL-1)各1μL，5μL GoGreen Master Mix。
引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物(Ren et al.，2009；Cavagnaro et al.，2010)。
PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃forever。
扩增产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h5min，电泳后银染显色，统计带型。
步骤3.初步定位的SSR分子标记筛选、数据统计及连锁图构建
共显性标记的统计方法：与母本(WI2757)一致的带型记为a，与父本(Wis.SMR18)一致的带型记为b，杂合的带型记为h。显性标记的统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b；若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为c，未扩增出的或模糊不清的记为u。
结果显示：
根据前人的研究用5号染色体上的194对SSR引物对P1(WI2757)和P2(Wis.SMR18)进行筛选，其中在两个亲本间表现多态的引物有33对，多态率17.01％。结合BSA法建池，进一步筛选得到了7个SSR多态性标记。
利用筛选出的多态性标记对WI2757×Wis.SMR18组合的F2群体进行分析，结合调查性状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。结果7个标记和目标性状(表皮细胞栅栏状结构)基因Pe被定位在同一连锁群上(LOD＝10)。
将本试验得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱(Zhang et al.，2012)比较，发现本连锁群的7个标记均分布在第5染色体，据此证实Pe基因在第5染色体上。
步骤4.Indel标记开发及Pe连锁群分子标记加密
针对初定位的染色体区段，结合黄瓜基因组序列的数据和两亲本重测序，利用primer 3.0软件在目标区段共设计了13对Indel标记引物，对连锁群进行分析标记加密。用双亲结合BSA法建池筛选出有多态性的有6对标记。通过分析所有多态性标记的物理位置，最终得到一个总长度为63.4cM包含12个标记(初定位的其中7对+新设计的5对)的连锁群，获得与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁距离为3.9cM的Indel标记Indelpe02，其中扩增所述Indel标记Indelpe02的上下游引物序列如下：
Indelpe02-F：TCTCCTCCTATACATTCTCA(Seq ID No.3)
Indelpe02-R：GAAGATTATGAGGATGAGAG(Seq ID No.4)。
步骤5.PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序
(1)目的片段的回收
采用煮沸法。具体操作为：先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100μL超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95℃水浴锅(或PCR仪)中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行PCR扩增，剩余产物置-20℃保存备用。
(2)目的片段的纯化
用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜放置，1,2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。
(3)目的片段与载体的连接
反应体系为10μL：PMD18-T Vector1.0μL；Ligation bufferⅠ5.0μL；目的片段4.0μL。
在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16℃连接约1h，过夜也不影响连接效率。
(4)连接产物的转化
1)取出感受态细胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；
2)感受态(50μL)+5μLSolutionA+4μLSolutionB+46μL预冷去离子水；
3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105μL，再加入5μL的目的DNA，轻旋混匀；
4)42℃水浴热激90s，注意不要晃动离心管；
5)快速将管转移到冰浴器中，使细胞冷却3～5min；
6)加入500μL LB液体培养基。在37℃，150rpm摇床上预培养1h；
7)将菌液涂布到含有100μg·mL-1Amp、25μg·mL-1IPTG和40μg·mL-1X-GAL的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；
8)倒置平板，37℃培养12～16h。
(5)重组质粒的蓝白斑筛选
经37℃培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养。
(6)菌落PCR的检测
吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μL PCR产物，经1.5％琼脂糖
凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。
(7)克隆后载体的测序与分析
取3个阳性克隆菌液在甘油(330μL甘油中加入1000μL菌液)中各保存两份，一份-20℃保藏，一份送去测序。
其中Indelpe02标记引物Indelpe02-F/Indelpe02-R扩增出的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征片段的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征片段的核苷酸序Seq ID No.2所示。
实施例2.本发明所述试剂盒及其制备方法
将实施例1获得的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的所述Indel标记Indelpe02的引物组装成试剂盒，所述试剂盒可用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料。所述Indel标记Indelpe02的上下游引物的核苷酸序列分别如Seq ID No.3和Seq ID No.4所示。进一步地，还可将进行PCR反应和/或电泳所需的试剂与所述引物一起组装成所述试剂盒。
进一步地，所述试剂盒的制备方法包括：将所述Indel标记Indelpe02的引物和/或进行PCR反应和/或电泳所需的试剂组装成试剂盒；或
将所述Indel标记Indelpe02的引物和/或进行PCR反应和/或电泳所需的试剂装入标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内；
所述所述Indel标记Indelpe02的上下游引物的核苷酸序列分别如Seq ID No.3和Seq ID No.4所示。
实施例3.与黄瓜Pe基因连锁的Indelpe02标记的验证
采用实施例1获得的与Pe基因连锁的所述Indel标记Indelpe02的引物，或者采用实施例2所述的试剂盒对回交群体BC1P1、BC1P2分别为79和69个单株的群体进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1中步骤2中的PCR扩增和检测方法。
结果发现，在这BC1P1群体中有72个株系的带型的表型与田间调查结构一致；在BC1P2群体中，有69个株系的带型的表型与田间调查结构一致，计算准确率分别为91.14％和100％，见图1。
Claims (9)
1.一种与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的Indel标记Indelpe02的引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列如下所示：
Indelpe02-F/Indelpe02-R：
TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG
所述引物扩增的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带为125bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；
所述引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带为130bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
2.用于筛选包含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的Indel标记Indelpe02的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。
4.用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的Indel标记Indelpe02的引物和/或权利要求2或3所述的试剂盒进行如下步骤：
(1)采用所述Indel标记Indelpe02的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；
(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
(3)从检测结果中筛选出现与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带一致的材料，所述与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的Indel标记特征条带为125bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/μl DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述凝胶电泳检测指，采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
8.权利要求2或3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括权利要求1所述的Indel标记Indelpe02的引物，或
在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有权利要求1所述的Indel标记Indelpe02的引物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂，或
在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有PCR反应和/或电泳所需的试剂。
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| Inheritance and linkage studies of the fruit epidermal structure in cucumber;N. E. Fanourakis等;《Journal of Heredity》;19871101;第78卷(第6期);第369-371页 * |
| 黄瓜无毛基因gl-2的遗传分析和定位;杨双娟等;《园艺学报》;20110925;第38卷(第9期);第1685-1692页 * |
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