CN104372085B - 黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv的Indel标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明“黄瓜抗西瓜花叶病毒病基因wmv的Indel标记及其应用”,涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜西瓜花叶病毒病(WMV)抗性基因wmv紧密连锁的Indel标记,其中所述标记的引物的核苷酸序列为:wmvIndel3-F/wmvIndel3-R:AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG;所述Indel标记扩增的与黄瓜WMV感病基因WMV连锁的特征条带为173bp,核苷酸序列见Seq?ID?No.1;所述Indel标记扩增的与黄瓜WMV抗病基因wmv连锁的特征条带为169bp,核苷酸序列见Seq?ID?No.2所示;采用本发明获得的Indel标记,可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断其是否对WMV具有抗性,该标记具有高效、限制少的优点,对选育抗WMV的黄瓜育种材料提高了效率,缩短了育种周期。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术辅助育种技术领域,特别涉及一种黄瓜中抗西瓜花叶病毒基因wmv的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
背景技术
病毒病是影响黄瓜生产的主要病害之一,病原种类繁多,难以防治。其中西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)就是引起该病的一种主要病原。WMV属于马铃薯Y病毒属病毒,该病毒属世界各地均有分布。在自然界,主要以非持久性方式经蚜虫传播,也可以经汁液的机械接种传染,可侵染葫芦科、豆科、藜科等多种植物种类。感病植株叶片表现花叶、畸形、新生叶片扭曲,植株生长受阻,果实畸形。
目前,在黄瓜上已经挖掘了一些抗WMV的种质资源,而且前人也利用了其中一些抗病材料对黄瓜WMV抗性遗传规律及分子标记进行了初步研究,Cohen等(1971)研究发现黄瓜栽培种Kyoto 3Feet中存在抗WMV的显性基因;Wai(1995a)和Grumet(1995b)在TMG-1中发现WMV的抗性分两种基因控制:一种是在子叶和全株均表现抗性的wmv-2,另一种是只在真叶表现抗性的2个相互作用的上位基因wmv-3和wmv-4。张海英等(2005)以感病亲本自交系欧洲八号和抗病亲本自交系秋棚构建的RILs群体为材料,对WMV进行了抗病性鉴定,研究表明抗病性状是受隐性单基因控制的,但同时也存在微效基因的修饰。目前报道的与WMV抗性相关的遗传连锁标记有AFLP、RAPD、SSR标记,但是这些标记与抗病基因连锁距离较远,并不能有效地应用于实际育种工作中。
发明内容
基于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供了一种与黄瓜中抗WMV基因wmv紧密连锁的Indel标记,并提供了该标记在筛选对WMV抗病或感病的黄瓜种质资源上的应用。
本发明的技术方案如下:
一种与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记,其特征在于:所述标记的引物的核苷酸序列如下:
wmvIndel3-F/wmvIndel3-R:
AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG
所述引物扩增的与黄瓜感西瓜花叶病毒基因WMV连锁的特征条带为173bp,其核苷酸序列如Seq ID No.1所示;
所述引物扩增的与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的特征条带为169bp,其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
所述Indel标记在筛选具有抗西瓜花叶病毒基因wmv的黄瓜种质资源中的应用,其特征在于,包括如下步骤:
(1)采用所述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增;所述标记的引物的核苷酸序列如下:wmvIndel3-F/wmvIndel3-R:
AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG;
(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测;
(3)从检测结果中筛选出现与抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记特征条带一致的材料,所述抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记特征条带为169bp,其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/μl DNA模板,所述引物正向和反向各5ng/μl,0.5μl/μlGoGreen Master Mix,其余为双蒸水。
所述PCR扩增的反应程序为:94℃预变性4分钟;94℃变性15秒,55℃退火15秒,72℃延伸30秒,35个循环;72℃保温5分钟,16℃保存。
所述凝胶电泳检测,指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶,于150V恒功率电泳分离,最后银染显色。
本发明以感WMV高代自交系65G与抗WMV高代自交系02245为亲本构建F1、F2群体及F2:3家系,通过苗期人工接种鉴定和ELISA检测,对黄瓜WMV抗性基因wmv进行了遗传规律分析。以F2群体为作图材料,利用BSA法和SSR及Indel标记技术,实现wmv基因在染色体上的遗传定位,并获得紧密连锁的Indel标记wmv-Indel3,与wmv的遗传距离为1.3cM。所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜WMV感病基因WMV连锁的特征条带为173bp,核苷酸序列如SeqID No.1;所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜WMV抗病基因wmv连锁的特征条带为169bp,核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
本发明通过利用54份不同遗传背景的黄瓜资源进行验证,结果表明wmv-Indel3验证的正确率为83.3%.
本试验不仅为黄瓜抗WMV基因wmv的精细定位和分子克隆奠定了基础,同时也为利用分子标记辅助选育具有抗WMV基因的黄瓜新品种提供了高效途径。本发明基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有特定WMV抗性的黄瓜新品种的方法,该方法中,采用所述Indel标记的特异性引物扩增待测材料的DNA,然后对扩增产物进行电泳检测,扩增产物可能出现三种情况:第一种是仅仅出现一条169bp条带,这种为隐型纯合材料(抗WMV);另一种是169bp条带和173bp条带都出现,这种是显性杂合材料(感WMV);第三种是仅仅出现173bp条带,这种为显性纯合材料(感WMV)。通过本发明提供的方法,可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行WMV抗性鉴定和筛选,具有高效、限制少、准确的优点。
附图说明
图1.采用本发明所述的wmvIndel3标记的特异性引物验证54份不同遗传背景的黄瓜材料的电泳检测结果;
黑体加粗字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明,但并不限制本发明的范围。如无特殊说明,下述实施例中使用的操作均为常规方法,所采用的试剂均可以商购获得。
生物材料的来源和记载出处
本研究所用的试验材料为黄瓜高代自交系65G和02245。以65G为母本,02245为父本杂交,获得F1,自交获得F2群体及F2:3家系。
黄瓜高代自交系65G(P1):由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的欧洲温室型黄瓜雌性系,生长势强,连续座果多,瓜长20多厘米,表面光滑无刺瘤,无苦味,抗黑星病,感西瓜花叶病毒病(WMV)。为现有已知品种,在顾兴芳等人于2006年在《园艺学报》第3期第690页上发表的文章《黄瓜新品种‘中农19号’》中也有记载。本实验室有保存,保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
黄瓜高代自交系02245(P2):由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的露地耐热抗病自交系,华北型黄瓜,耐热性突出,分枝性强,腰瓜长约35厘米,刺瘤密,抗西瓜花叶病毒病(WMV),抗霜霉病,白粉病,枯萎病。为现有已知品种,在顾兴芳等人于2008年在《中国蔬菜》第6期第31-33页发表的文章《耐热黄瓜新品种中农106号的选育》中也有记载。本实验室有保存,保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
54份不同遗传背景的黄瓜材料的具体来源和出处详见Zhang等于2010年在《Journal of the American Society for Horticultural Science》第135期第53-58页发表的文章《Genetic Mapping of the Scab Resistance Gene in Cucumber》。其中29份为抗性材料,25份为感病材料。
重测序的基因组信息详见Qi等在《Nature Genetics》杂志2013年发表的论文《Agenomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumberdomestication and diversity》
Indel标记引物是本实验室基于两亲本重测序的基因组信息、利用primer 3.0软件设计得到。
主要试剂
SSR引物来自国际黄瓜基因组计划(ICUGI);PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix;
凝胶电泳使用康润公司的40%非变性聚丙烯酰胺,将其稀释至6%后使用。
实施例1.与黄瓜抗WMV基因wmv连锁的wmvIndel3标记的获得
步骤1.黄瓜WMV苗期抗性鉴定
本试验以黄瓜高代自交系65G(感病)和02245(抗病)为母本和父本,自交获得F1、F2群体及F2:3家系。2013年秋,在中国农业科学院蔬菜花卉研究所病理课题组人工气候室对F1及137个F2:3家系进行WMV苗期人工摩擦接种,其中每个家系种植15株,待第一片真叶展平时,进行接种鉴定。
待第一次接种20天后,进行调查,将病情划分为6个等级,分别为:0级,无症状;1级,心叶明脉或轻花叶;3级,心叶及中部叶片花叶;5级,心叶及中部叶片花叶,少数叶片畸形、皱缩;7级,重花叶,多数叶片畸形、皱缩;9级,重花叶,叶片明显畸形,植株矮化,甚至死亡。同时为了检测接种植株中病毒的含量,在调查后,采用了酶联免疫吸附(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)方法对黄瓜植株的心叶中的病毒含量进行检测。根据调查及ELISA检测结果判断植株对WMV是否有抗性,然后使用Microsoft Excel2007及SAS9.2软件进行数据统计分析,判断分离比。
结果显示:后代F1均表现感病;由F2:3家系鉴定结果,可推断在F2群体中,感病植株有110株,抗病植株有27株。经卡方检测,符合3:1比例,表明在该群体中WMV抗性是受一对隐性基因控制。
步骤2.DNA提取和分子标记分析
取黄瓜植株的嫩叶,用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。
PCR反应体系为:总反应体系10μL,3μL DNA(5.0ng·μL-1),正向和反向引物(50ng·μL-1)各1μL,5μL GoGreen Master Mix(Promega公司产品)。
引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物(Ren et al.,2009;Cavagnaro et al.,2010)。
PCR扩增程序为:94℃预变性4min;94℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸30s,35个循环;72℃保温5min,16℃forever。
扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离,电泳缓冲液为0.5×TBE,150V恒功率电泳分离1.5h,电泳后银染显色,统计带型。
步骤3.初步定位的SSR分子标记筛选、数据统计及连锁图构建
共显性标记的统计方法:与母本(65G)一致的带型记为a,与父本(02245)一致的带型记为b,杂合的带型记为h。显性标记的统计方法:若母本为显性标记,则分离群体中和母本带型一致的单株记为d,和父本带型一致的记为b;若父本为显性标记,则分离群体中和母本带型一致的单株记为a,和父本带型一致的记为c,未扩增出的或模糊不清的记为u。
结果显示:
用1288对SSR引物对P1(65G)和P2(02245)进行筛选,其中在两个亲本间表现多态的引物有296对,多态率23.0%。结合BSA法建池,进一步筛选得到了8个SSR多态性标记。
利用筛选出的多态性标记对65G×02245组合的F2群体进行分析,结合调查性状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。结果8个标记和目标性状(抗WMV)基因wmv被定位在同一连锁群上(LOD=10)。
将本试验得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱(Zhang et al.,2012)比较,发现本连锁群的8对标记均分布在第6染色体,据此将wmv基因定位在第6染色体上。
步骤4.Indel标记开发及wmv连锁群分子标记加密
针对初定位的染色体区段,结合黄瓜基因组序列和两亲本重测序的数据,利用primer3.0软件在目标区段(约2.01M)共设计了130对SSR标记引物和20对Indel标记引物,对连锁群进行分析标记加密。用双亲筛选出有多态性的有8对标记。上群体后得到一个总长度为19.0cM包含12个标记(初定位的其中4对+新设计的8对)的连锁群,获得与黄瓜抗WMV基因wmv连锁距离为1.3cM的Indel标记wmvIndel3。
步骤5.PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序
(1)目的片段的回收
采用煮沸法。具体操作为:先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内,向管内加入100μL超纯水,加水量视胶带颜色深浅而定;常温下浸泡24h,转入95℃水浴锅(或PCR仪)中煮30min后,5000rpm离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行PCR扩增,剩余产物置-20℃保存备用。
(2)目的片段的纯化
用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇,-20℃过夜放置,1,2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。
(3)目的片段与载体的连接
反应体系为10μL:PMD18-T Vector1.0μL;Ligation bufferⅠ5.0μL;目的片段4.0μL。
在超净工作台上加样,混匀反应物,短暂离心,16℃连接约1h,过夜也不影响连接效率。
(4)连接产物的转化
1)取出感受态细胞,SolutionA,SolutionB,置于冰上融化;
2)感受态(50μL)+5μLSolutionA+4μLSolutionB+46μL预冷去离子水;
3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管,每管加入105μL,再加入5μL的目的DNA,轻旋混匀;
4)42℃水浴热激90s,注意不要晃动离心管;
5)快速将管转移到冰浴器中,使细胞冷却3~5min;
6)加入500μL LB液体培养基。在37℃,150rpm摇床上预培养1h;
7)将菌液涂布到含有100μg·mL-1Amp、25μg·mL-1IPTG和40μg·mL-1X-GAL的LB固体培养基上,用无菌的弯头玻璃棒轻轻的将菌液均匀涂开,置于室温直至液体被吸收;
8)倒置平板,37℃培养12~16h。
(5)重组质粒的蓝白斑筛选
经37℃培养后,在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落,其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中,37℃,150rpm过夜培养。
(6)菌落PCR的检测
吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μL PCR产物,经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小,与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。
(7)克隆后载体的测序与分析
取3个阳性克隆菌液在甘油(330μL甘油中加入1000μL菌液)中各保存两份,一份-20℃保藏,一份送去测序。
其中wmvIndel3标记引物wmvIndel3-F/wmvIndel3-R扩增出的与黄瓜感WMV基因WMV连锁的特征片段的核苷酸序列如Seq ID No.1所示;与黄瓜抗WMV基因wmv连锁的特征片段的核苷酸序Seq ID No.2所示。
实施例2.与黄瓜wmv基因连锁的wmvIndel3标记的验证
用对实施例1获得的与wmv基因连锁的Indel标记wmvIndel3对54份不同遗传背景的黄瓜材料进行验证,以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1中步骤2中的PCR扩增和检测方法。
结果发现,在这54份材料中共有45个株系的带型反映的表型数据与田间调查结果一致,经计算准确率为83.3%,见图1。
Claims (6)
1.一种与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记,其特征在于:所述标记的引物的核苷酸序列如下:
wmvIndel3-F/wmvIndel3-R:
AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/ TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG
所述引物扩增的与黄瓜感西瓜花叶病毒基因WMV连锁的特征条带为173bp,其核苷酸序列如Seq ID No.1所示;
所述引物扩增的与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的特征条带为169bp,其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
2.权利要求1所述Indel标记在筛选具有抗西瓜花叶病毒基因wmv的黄瓜种质资源中的应用,其特征在于,包括如下步骤:
(1)采用所述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增;所述标记的引物的核苷酸序列如下:wmvIndel3-F/wmvIndel3-R:AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG;
(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测;
(3)从检测结果中筛选出现与抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记特征条带一致的材料,所述抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记特征条带为169bp,其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述的应用,其中,所述PCR扩增的反应体系为: 1.5ng/μl DNA模板,所述引物正向和反向各5ng/μl,0.5μl/μl Go Taq® Green Master Mix,其余为双蒸水。
4.根据权利要求2所述的应用,其中,所述PCR扩增的反应程序为:94℃预变性4分钟;94℃变性15秒,55℃退火15秒,72℃延伸30秒,35个循环;72℃保温5分钟,16℃保存。
5.根据权利要求3所述的应用,其中,所述PCR扩增的反应程序为:94℃预变性4分钟;94℃变性15秒,55℃退火15秒,72℃延伸30秒,35个循环;72℃保温5分钟,16℃保存。
6.根据权利要求2-5任一所述的应用,其中所述凝胶电泳检测,指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶,于150 V恒功率电泳分离,最后银染显色。
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