CN102154471B

CN102154471B - 水稻籽粒长度主效qtl位点的分子标记方法

Info

Publication number: CN102154471B
Application number: CN 201110008363
Authority: CN
Inventors: 王建飞; 张晓军; 张红生; 王才林; 王州飞; 黄骥; 鲍永美; 蓝虹霞
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-01-17
Filing date: 2011-01-17
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2031-01-17
Also published as: CN102154471A

Abstract

本发明属于分子遗传育种学领域，公开了水稻籽粒长度主效QTL位点的分子标记方法。利用本发明Indel标记XJ24、XJ26的引物和SSR标记RM15575的引物中的一对或多对对水稻基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着qGL3.2增效等位变异基因的存在。通过本发明的谷粒长度QTL qGL3.2共分离和紧密连锁的分子标记方法，检测水稻大粒种质与各亲本构建的育种群体，可以快速导入控制谷粒长度和籽粒重量的主效基因qGL3.2，提高对主效基因qGL3.2的选择效率，为水稻外观品质改良和高产育种服务。

Description

水稻籽粒长度主效QTL位点的分子标记方法

技术领域

本发明属于分子遗传育种学领域，涉及水稻籽粒长度主效QTL位点的分子标记方法，专用于水稻品种籽粒长度的分子标记辅助改良、分子标记辅助的产量育种和种质资源的利用。

背景技术

随着世界人口的增长，水稻作为主要粮食作物面临着提高产量的迫切需要。为了满足人类的需要，水稻遗传育种学家对水稻的产量和粒型进行了越来越深入的研究。

产量性状是由多基因控制的数量性状，表现为连续变异，受环境的影响较大。在错综复杂的产量因子中，直接构成因子包括粒重、每穗颖花数、有效穗数和结实率。此外，植株高度、分蘖数、穗型、叶型等性状能间接影响水稻群体的产量。产量的形成是这些众多性状在特定环境条件下互作的结果。

尽管粒重是受多基因控制的数量性状，其较高遗传力说明该性状可以分离出某些主效基因。粒重可以分解为粒长、粒宽和粒厚三个组分。早在1980年，Takeda and saito就报道了水稻籽粒长度受单基因LK-f控制；Mckenziedeng(1983)报道认为粒长由2-3个或者更多的基因控制。随着数量遗传发展和分子标记的大量开发，人们越来越多的借助于QTLs分析方法，研究粒重和粒形。众多研究者采用不同的遗传群体定位到了有关粒重、粒形的QTL位点约250个(http://www.gramene.org/)，几乎分布于所有染色体，而对粒重贡献大的QTL集中分布在第2、3、5、6、8等染色体。有的位点很可能有大量的重复，如关于粒长的QTL LK-4(t)、gl-3、gw3.1、GW3与克隆的GS3处于相同的染色体区间。

近十多年来，由于水稻基因组计划的完成，一些水稻粒重、穗粒数、分蘖、株高、株型等水稻产量相关基因得到分离。有三个粒重相关基因被克隆，包括第3染色体上的控制粒长的基因GS3、第2染色体上控制粒宽的GW2和第5染色体上的宽粒基因qSW5。

申请者于2005年从江苏省农科院购得大粒粳稻资源材料N411，其千粒重达71.1克。随后分别与中粒型品种93-11正反杂交、回交，对N411粒重相关性状展开研究。初步的研究表明，粒重相关性状没有细胞质效应。N411/93-11 F₂ QTL分析，在RM6266-RM3350区间检测到1个贡献率达52.5％的主效QTL qGL3.2，该位点同时对粒重贡献率达31％。序列分析表明N411、93-11与明恢63具有相同的GS3突变位点。从F₂选择携有RM6266-RM3350大粒亲本标记型的个体与93-11分别回交，将qGL3.2定位于RM15561-RM15630区间，对照Nipponbare，物理跨距约76kb。进一步利用籽粒长度出现单因子分离的回交分离群体，将qGL3.2定位在34kb的区间内，并找到了共分离和紧密连锁的Indel标记。

发明内容

本发明的目的是提供水稻籽粒长度主效QTL位点的分子标记方法。通过检测与谷粒长度主效基因位点连锁的分子标记，可以确定有无控制谷粒长度的主效基因位点导入到育种品系中，提高水稻产量和外观品质改良的目的性与有效性；提供产量育种分子标记辅助选择的室内检测和表型前鉴定筛选的可操作性；提高该性状的选择效率、加快育种进度。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

水稻籽粒长度主效QTL位点qGL3.2的分子标记方法，其特征在于步骤如下：

(1)取水稻叶片，提取基因组DNA。

(2)利用表1中的任意1对或1对以上分子标记引物对所述的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着qGL3.2增效等位变异基因的存在。

表1

其中，所述的PCR反应：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，引物对(4pmol/微升)2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5单位/微升)0.2微升，模板DNA20纳克，加水至25微升。SSR反应程序为DNA 95℃预变性5min后，[(95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s)循环35次]，最后72℃延伸10min。

用InDel分子标记XJ24的上下游引物扩增水稻品种N411或N411与籼稻的杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出295bp的扩增片段，则标志着N411的增效等位变异qGL3.2的存在，否则扩增出312bp，则表明增效基因位点没有导入。在2968个BC₃F₂分离群体中，用交换配子数计算，此标记与谷粒长度的主效基因是共分离的，单标记选择效率达100％。

用InDel分子标记XJ26的上下游引物，扩增水稻品种N411或N411与籼稻的杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出234bp的扩增片段，则标志着N411的增效等位变异qGL3.2的存在，否则扩增出207bp，则表明增效基因位点没有导入。在2968个BC₃F₂分离群体中，用交换配子数计算，此标记与谷粒长度的主效基因的交换率是0.3％，单标记选择效率达99.7％。

用SSR分子标记RM15575的上下游引物，扩增水稻品种N411或N411与籼稻的杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出219bp的扩增片段，则标志着N411的增效等位变异qGL3.2的存在，否则扩增出205bp，则表明增效基因位点没有导入。在2968个BC₃F₂分离群体中，用交换配子数计算，此标记与谷粒长度的主效基因的交换率是0.4％，单标记选择效率达99.7％。

上述3个标记对qGL3.2的选择效率在99.7％以上，其中InDel标记XJ24与qGL3.2共分离，选择准确率高，达100％。上述3个标记可以择一使用，也可以任意选择2个或2个以上标记联合使用。3个标记中任意2个标记组合选择，选择效率也达到100％。

有益效果：

本发明所提供的水稻籽粒长度主效QTL位点qGL3.2的分子标记方法，具有以下优点：

(1)通过本发明开发的分子标记在国际上首次定位了位于第3染色体长臂上的来自巨粒种质N411的控制谷粒长度的主效QTL新位点qGL3.2，并获得了共分离或高度紧密连锁的Indel标记XJ24和XJ26以及SSR标记RM15575。

(2)通过本发明分子标记定位的水稻谷粒长度主效QTL位点qGL3.2的位置明确、精细，鉴定方法快速简便，选择效率高。只需检测这些标记的扩增条带特征，可以判断谷粒长度主效QTL位点qGL3.2的增效变异存在与否，以此预测水稻籽粒长度的表型，可以快速有目的性的筛选籽粒较长的品种或品系，用于水稻改良籽粒外观和提高籽粒重量的育种工作。这些标记与主效QTL位点qGL3.2共分离或高度紧密连锁，单标记选择效率达99.7％-100％，任意双标记选择效率达100％。

(3)辅助育种选择目标明确，节约成本，不受环境影响。在传统育种方法中，首先要收集具有较长籽粒或较大千粒重的亲本与骨干亲本进行一系列杂交，回交，而且要对籽粒长度或千粒重进行单株选择。对水稻籽粒长度进行表型鉴定要等到抽穗期，百粒重要等到材料成熟，影响育种进程，而且其表型受到环境影响大，可靠性较低。通过标记检测籽粒长度主效基因位点，可以在苗期就鉴定出籽粒较长的单株，淘汰其它植株，可以有效控制育种规模、提高籽粒长度育种的进程和选择效率。

附图说明

图1：N411第3染色体控制粒长QTLs位点检测。

图2：水稻籽粒长度主效QTL位点qGL3.2定位分析：A.QTL qGL3.2在第3染色体位置；B.C.水稻粒长QTL qGL3.2精细定位过程。

图3：新开发的与qGL3.2紧密连锁的InDel标记和SSR标记多态性电泳条带。

每个标记的第一泳道为水稻巨粒种质N411；第二泳道为籼稻93-11；第三泳道为其它籼稻品种。

具体实施方式

实施例1

(一)材料与方法：

1.材料：巨粒种质N411与93-11杂交，种植杂交种，自交获得F₂分离群体，用于主效粒长QTL检测与定位。

2.用SDS法提取个体DNA。

3.多态标记筛选：用976对SSR引物对，以N411与93-11的DNA为模板，进行PCR扩增，筛选多态性标记。

4.PCR反应：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，引物对(4pmol/微升)2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5单位/微升)0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。SSR反应程序为DNA 95℃预变性5min后，【(95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s)循环35次】，最后72℃延伸10min。在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离。在976对SSR引物中有107对引物扩增产物在亲本间存在多态，用于连锁图构建和QTL检测。

5.利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为Mapmaker3.0，最小LOD值设为3，获得连锁图谱；利用WinQTLcart2.5软件对粒重及其组分进行了QTLs定位(图1，图2A)。

6.标记开发：在初定位目标区域设计新InDel标记。下载目标基因所在的水稻基因组序列，根据日本晴和93-11的基因组序列比对差异，设计InDel标记引物，在双亲间进行多态性分析，PCR反应体系和反应程序同步骤4的SSR PCR扩增体系，获得XJ24、XJ26多态性标记(表1，图3)。

7.F₂群体中选择单株，逐步回交、自交获得分离群体并逐步缩小定位区间，用新开发的标记精细定位主效粒长QTL qGL3.2，并获得共分离或紧密连锁标记。

(二)结果与分析：

N411(千粒重71.1克)与93-11(千粒重28.3克)杂交、自交获得F₁和F₂分离群体。利用分布于12条染色体的107个SSR多态标记，在F₂代的182个个体，建立分子标记图谱。利用WinQTLcart2.5软件对粒重及其组分进行QTLs定位，采用符合区间作图法，抽样1000次迭代来确定LOD值。QTLs分析表明，控制粒长的QTLs分布于第3染色体，其中贡献率最大的粒长QTL位于RM6266-RM3350之间(图1、图2A)，定名为qGL3.2。

采用逐步回交逐步定位的方法，缩小定位区间。利用N411/93-11的BC₁F₂群体，将目的QTL定位在RM15561-RM15630之间(图2B)。

从N411/93-11的BC₂F₂群体中，通过分子标记选择，挑选目标区域较小，背景单一，整株表型接近93-11的个体回交给93-11，在BC₃F₁群体中，通过分子标记选择，挑选含有目的区域、背景接近93-11的个体，收取单株种子，种植形成BC₃F₂群体2968株。

对2968株分离个体的表型鉴定与标记分析，在分子标记RM15561和RM15630间获得了91个单交换株。加密分子标记，并对分子标记稀疏的区域对照日本晴和93-11的序列开发新的InDel标记。利用加密的分子标记分析91个重组个体，结果：标记XJ24与qGL3.2表现共分离，没有交换株，说明单标记对qGL3.2的选择效率达100％；XJ26、RM15575、RM15565与qGL3.2之间分别出现9个、9个、12个单交换株，交换率均在0.5％以下，单标记对qGL3.2的选择效率均达到99.5％以上。上述4个分子标记在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图3，扩增结果见表2。由于RM15565标记在双亲间扩增条带差异小，分辨率较低，且选择效率不及其它3个标记。

通过检测与谷粒长度主效基因位点连锁的分子标记，可以确定有无控制谷粒长度的主效基因位点导入到育种品系中，提高水稻产量和外观品质改良的目的性与有效性，提高该性状的选择效率、加快育种进度。利用qGL3.2共分离或紧密连锁的XJ24、XJ26、RM15575进行单标记选择，选择效率可达到99.7％-100％，任何双标记组合选择效率均达到100％，可用于分子标记辅助选择育种。

表2.

标记	上游引物序列	下游引物序列	N411(bp)	93-11(bp)	选择效(％)
						XJ24	SEQ ID NO.1	SEQ ID NO.2	295	312	100
XJ26	SEQ ID NO.3	SEQ ID NO.4	234	207	99.7
						RM15575	SEQ ID NO.5	SEQ ID NO.6	219	205	99.7
RM15565	SEQ ID NO.7	SEQ ID NO.8	238	232	99.5

Claims

1.水稻籽粒长度主效QTL位点qGL3.2的分子标记方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）取水稻品种N411或N411与籼稻品种93-11的杂交后代的叶片，提取基因组DNA；

（2）利用XJ24、XJ26或RM15575中的任意1对或1对以上分子标记引物对所述的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着qGL3.2增效等位变异基因的存在，其中，所述的XJ24分子标记的上游引物XJ24L序列为SEQ ID NO.1，下游引物XJ24R序列为SEQ ID NO.2，扩增产物大小为295bp；XJ26分子标记的上游引物XJ26 L序列为SEQ ID NO.3，下游引物XJ26 R序列为SEQ ID NO.4，扩增产物大小为234bp；RM15575分子标记的上游引物RM15575 L序列为SEQ ID NO.5，下游引物RM15575 R序列为SEQ ID NO.6，扩增产物大小为219bp。

2.根据权利要求1所述的水稻籽粒长度主效QTL位点qGL3.2的分子标记方法，其特征在于所述的PCR反应：体积为25μl，其中10×buffer 2.5μl，25mM MgCl₂ 1.5μl，4pmol/μl引物对2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，5U/μl Taq酶0.2μl，基因组DNA 20ng，加水至25μl，反应程序为DNA 95℃预变性 5min； 95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min。