CN104498485A

CN104498485A - 西葫芦zymv显性抗病基因zymv-2的连锁分子标记及其应用

Info

Publication number: CN104498485A
Application number: CN201410717961.4A
Authority: CN
Inventors: 张国裕; 李海真; 张帆; 贾长才; 姜立纲
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2014-12-01
Publication date: 2015-04-08

Abstract

本发明公开了与西葫芦小西葫芦黄化花叶病毒病（ZYMV）显性抗病基因 ZYMV-2 连锁的SSR分子标记（ZY-126），属于蔬菜分子抗病育种技术领域，涉及ZYMV显性抗病基因连锁的SSR分子标记及其应用。所述的分子标记ZY-126与抗病基因的遗传连锁距离为0.7 cM。利用分子标记ZY-126可快速准确地检测抗病性状转育后代植株是否携带 ZYMV-2 抗病基因，从而显著提高抗病育种效率，缩短育种周期，为ZYMV抗病品种的选育奠定坚实的基础。本发明获得的ZY-126分子标记具有稳定可靠、操作简单、重复性好等优点，在鉴别抗、感品种和抗病转育后代单株时具有非常高的利用价值。

Description

西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-2的连锁分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种与西葫芦（Cucurbitapepo L.）小西葫芦黄化花叶病毒病（ZYMV）显性抗病基因ZYMV-2连锁的SSR分子标记，以及该标记在检测抗病植株中的应用。

背景技术

西葫芦是全球范围内普遍栽植的重要蔬菜之一，在我国的栽培面积逐年增加，特别是近年来保护地设施栽培发展迅速，已成为继黄瓜之后的第二大栽培作物。对农民增收、农业结构调整以及丰富人民的菜篮子有着重要意义。

小西葫芦黄化花叶病毒病（zucchini yellow mosaic virus, ZYMV）是目前危害西葫芦等葫芦科作物生产的主要病害之一。世界范围内ZYMV传播蔓延迅速，近年来在我国西葫芦生产和制种中的危害日趋严重和广泛（刘卫荣等，2008）。植株感染ZYMV后会产生花叶、植株矮化畸形，果实表面瘤状凸凹不平、果肉僵硬且味苦涩等症状，使果实失去商品价值，导致产量损失达60%以上，严重者甚至绝产（Zechmann et al.，2003；刘卫荣等，2008）。

目前还没有防治该病毒病的有效试剂和措施，培育和推广抗病品种是减少ZYMV危害的最经济、安全、有效措施。但目前，由于抗病基因主要来源于野生南瓜材料，且存在通过人工接种病毒进行抗病性状检测繁琐、性状鉴定准确性差等问题，导致抗性性状转育困难，抗病育种效率低、周期长，生产中抗病品种少，不能满足生产需要。紧密连锁的分子标记可以加速抗病育种进程及提高选择的准确性，是分子标记辅助选择育种的必要条件。但目前国内外还没有与西葫芦ZYMV抗病基因紧密连锁分子标记的研究报道。因此，开发与葫芦ZYMV抗病基因紧密连锁的分子标记，对于提高西葫芦抗病育种效率，拓展抗病基因应用范围，保障西葫芦产业的健康发展具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有育种技术的上述不足，提供西葫芦ZYMV病毒病显性抗基因ZYMV-2的SSR分子标记及其应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-2的分子标记，所述分子标记ZY-126；

所述的分子标记ZY-126：

左端引物序列为SEQ ID NO. 1，

右端引物序列为SEQ ID NO. 2，

扩增产物为137 bp，此分子标记来自西葫芦自交系BS6染色体，为共显性分子标记，利用Mapmaker/EXP 3.0测得与抗病基因ZYMV-2的遗传距离为0.7 cM。

本发明的另一目的可通过如下技术方案实现：

所述的与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-2紧密连锁的SSR分子标记的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述SSR分子标记是应用SSR-BSA技术采用下述方法得到的：以西葫芦自交系BS11和BS6分别作为感病和抗病亲本配制F₂代分离群体，用584对SSR引物筛选与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-2连锁的分子标记，得到一个共显性分子标记，即ZY126，与抗病基因ZYMV-2的遗传连锁距离为0.7 cM。

本发明的另一目的可通过如下技术方案实现：

所述的分子标记ZY-126在西葫芦种质资源抗ZYMV病毒病基因的鉴定和转移中的应用。

西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-2的分子标记方法，用以下一对分子标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物：

分子标记ZY-126：

左端引物序列为SEQ ID NO. 1，

右端引物序列为SEQ ID NO. 2，

如果用引物ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志着待检西葫芦存在抗ZYMV病毒病基因ZYMV-2。

本发明的另一目的可通过如下技术方案实现：

一种筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，用权利要求1所述的引物对扩增待检西葫芦基因组DNA，如果用引物ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志该待检西葫芦为存在ZYMV-2抗病基因的抗ZYMV病毒病西葫芦。

本发明的有益效果为：

本发明在西葫芦自交系BS6中发现了一个抗ZYMV病毒病的显性抗病基因ZYMV-2，其优异的抗病表现在西葫芦抗病育种中具有重要的利用价值。获得了与该抗病基因紧密连锁的分子标记ZY-126。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将抗病基因通过杂交、回交转育的方法导入西葫芦优良自交系BS11中，使其获得ZYMV病毒病抗性。

1、在西葫芦自交系BS6中鉴定了一个ZYMV显性抗病基因ZYMV-2；

2、获得与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-2紧密连锁的共显性分子标记ZY-126。ZY-126与抗病基因的遗传距离为0.7 cM。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因成功导入其它西葫芦感病优良自交系，使之获得抗病性状；

3、鉴定方便。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记ZY-126检测西葫芦显性抗病基因ZYMV-2，可以确定抗病基因是否存在以及存在状态，并预测植株对ZYMV病毒病的抗性，加快该抗病基因的利用；

4、本发明提出了利用西葫芦ZYMV病毒病抗病种质资源BS6中抗病基因的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良的感病自交系中，利用该方法成功将抗病基因ZYMV-2导入西葫芦优良自交系BS11，使其获得了抗病性。

附图说明

图1为分子标记ZY-126与西葫芦抗病基因ZYMV-2的遗传连锁图，左边为标记间的图距；

图2为分子标记扩增带型；

ZY-126扩增带型，其中P₁为感病亲本BS11，P₂为抗病亲本BS6，F₁为杂交一代；1-14为以BS11为轮回亲本的回交单株；M：Trans DNA markerII, 箭头所指为137 bp特异扩增条带。

具体实施方式

实施例1

与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-2紧密连锁的SSR分子标记，所述的分子标记为ZY-126，其具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。

所述的分子标记在对西葫芦种质资源ZYMV抗病基因的鉴定和转移中的应用。

进一步的，西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-2的分子标记方法，用以下的一对分子标记引物进行PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物：

分子标记ZY-126：

左端引物序列为SEQ ID NO. 1，

右端引物序列为SEQ ID NO. 2，

如果用引物ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在抗ZYMV的基因ZYMV-2。

一种筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，用所述的分子标记对扩增待检西葫芦基因组DNA，如果用所述的分子标记ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志该待检西葫芦为存在ZYMV-2抗病基因的抗ZYMV病毒病西葫芦。

进一步的，所述的PCR反应体积为15微升，其中10×buffer 1.5微升，2.5mM dNTPs 0.3微升，Tag酶0.2微升，10 μM引物各0.3微升，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15微升。

所述PCR反应的条件为：DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

实施例2

本实施例具体描述了所述的与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-2紧密连锁的SSR分子标记的获得方法，包括以下步骤：

（一）西葫芦自交系BS11与BS6 F₂代的创建与表型鉴定：

（1）西葫芦自交系BS11（母本）与BS6（父本）进行杂交得到杂种F₁，F₁自交产生F₂代群体。

（2）F₂代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接种病毒病，接种15天后进行抗病性状调查。鉴定结果见表1。

表1 接种ZYMV病毒病后BS11×BS6 F₂代群体遗传分析

R、S分别代表抗病单株、感病单株。χ² _0.05, 1=3.84。

（3）F₂代单株进行性状调查后将感病植株移栽于温室种植，自交所得种子为F₃家系。每个F₃家系中选择10粒种子进行抗病性测验，验证F₂代感病单株是否携带纯合感病基因。

（4）通过对F₂代单株进行遗传分析，发现西葫芦自交系BS6携带有一个显性抗病基因。

（二）多态性分子标记筛选

（1）将10株抗病F₂单株的叶片等量混成抗病池，10株感病F₂单株的叶片等量混成感病池。用CTAB法（Sue Porebski L., 1997）提取抗病亲本BS6、感病亲本BS11、抗病池和感病池的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA（Bulk Segregant Analysis）结合的方法进行多态性标记筛选。

（2）首先利用584对SSR引物（Amine Zraidi, Gertraud Stift, Martin Pachner, Abdolali Shojaeiyan, Li Gong, Tamas Lelley (2007) A consensus map for Cucurbitapepo. Mol. Breeding 20(4):375-388; Gong L, Stift G, Kofler R, Pachner M, Lelley T (2008) Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita and an SSR-based genetic linkage mao of Cucurbita pepo L. Theor Appl Genet 117: 37-48; Blanca J, Ca??izares J, Roig C, Ziarsolo P, Nuez F, Picó B. (2011) Transcriptome characterization and high throughput SSRs and SNPs discovery in Cucurbitapepo (Cucurbitaceae). BMC Genomics 12: 104）对BS6、BS11、抗病池和感病池进行多态性分子标记筛选。

PCR反应体积为15微升，其中10×buffer 1.5微升，2.5mM dNTPs 0.3微升，Tag酶（5单位/微升）0.2微升，10 μM引物（F/R）各0.3微升，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15微升；

SSR反应体系为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min；

其中5个SSR标记在抗、感亲本与抗、感病池之间检测到了一致的多态。

（三）紧密连锁分子标记的获得

（3）根据连锁交换规律，利用5对候选分子标记在纯合感病家系各单株间的基因型资料与单株的抗性资料，构建分子标记与ZYMV-2基因的连锁图谱，所用软件为Mapmaker/EXP 3.0，获得了与显性抗病基因ZYMV-2紧密连锁的分子标记ZY-126，遗传连锁距离为0.7 cM（图1）；

（四）显性抗病基因ZYMV-2向感病西葫芦自交系的转移

（4）利用获得的与抗病基因ZYMV-2紧密连锁的分子标记ZY-126，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良感病自交系中（图2）。利用上述策略，成功获得了改良西葫芦优良自交系BS11，使其携带ZYMV-2抗病基因具备了ZYMV抗病性。

西葫芦种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于西葫芦育种具有重要作用。本发明通过将抗病种质BS6与感病自交系BS11杂交，经遗传分析确定抗病材料中携带有一个显性的抗病基因，通过构建抗病性状分离群体，经多态性分子标记筛选，构建了抗病基因ZYMV-2与分子标记ZY-126的遗传连锁图谱。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功将抗病基因ZYMV-2转育到西葫芦优良感病自交系BS11中，使其获得了ZYMV抗病性状。在传统育种方法中，由于缺乏与抗病基因连锁的分子标记，每代的抗病基因转移均需要抗性鉴定，费时费力、准确性差。因此，分子标记ZY-126的开发可以简便准确的筛选含有抗病基因ZYMV-2的单株，大大节省抗病材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性、提高抗病新品种的培育速度和科技含量。

Claims

1.与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-2紧密连锁的SSR分子标记，其特征在于，所述的分子标记为ZY-126，其具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。

2.一种如权利要求1所述的与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-2紧密连锁的SSR分子标记的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求1所述的分子标记在对西葫芦种质资源ZYMV抗病基因的鉴定和转移中的应用。

4.一种检测西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-2的分子标记方法，其特征在于，用以下的一对分子标记引物进行PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物：

分子标记ZY-126：

左端引物序列为SEQ ID NO. 1，

右端引物序列为SEQ ID NO. 2，

用所述的分子标记ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在抗ZYMV的基因ZYMV-2。

5.根据权利要求4所述的检测西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-2的分子标记方法，其特征在于，所述的PCR反应体积为15微升，其中10×buffer 1.5微升，2.5mM dNTPs 0.3微升，Tag酶0.2微升，10 μM引物各0.3微升，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15微升。

6.根据权利要求4所述的西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-2的分子标记方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

7.一种筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，其特征在于，用权利要求1所述的分子标记对扩增待检西葫芦基因组DNA，用所述的分子标记ZY-126能够扩增出137 bp的扩增片段，则标志该待检西葫芦为存在ZYMV-2抗病基因的抗ZYMV病毒病西葫芦。

8.根据权利要求7所述的筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，其特征在于，所述的PCR反应体积为15微升，其中10×buffer 1.5微升，2.5mM dNTPs 0.3微升，Tag酶0.2微升，10 μM引物各0.3微升，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15微升。

9.根据权利要求7所述的筛选抗ZYMV病毒病西葫芦的方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。