CN112852998B - 一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用 - Google Patents

一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用。属于作物耐逆性鉴定技术领域。包括SNP1、SNP2或SNP3。本发明能够在苗期对葫芦耐热特性进行分子标记鉴定，在选育耐热葫芦品种的过程中，对供试葫芦材料进行选择，区分耐热和热敏葫芦材料。通过重测序结合生物信息学的方法获得的与葫芦耐热特性相关的分子标记，与葫芦耐热特性相关性高。

Description

一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及作物耐逆性鉴定技术领域，更具体的说是涉及一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用。
背景技术
目前，全球气候变暖，作物生长面临严峻的高温挑战。鉴定葫芦耐热特性是选育耐热葫芦品种的关键环节。鉴定葫芦耐热特性常用的方法是通过对葫芦植株进行高温处理，根据植株的表型、生化指标等变化，判断葫芦的耐热特性。
但是，通过现有方法判断葫芦耐热特性，需要对植株进行热处理，这个环节可能受到处理条件和植株生长不均一等影响，结果准确性有待提高。
因此，提供一种葫芦耐热特性的分子标记是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种葫芦耐热特性的分子标记，包括SNP1、SNP2或SNP3中至少一种；SNP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；SNP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；SNP3的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
本发明还提供了一种用于检测上述的葫芦耐热特性的分子标记的引物组，包括：SNP1的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-GTGAACTCCTTGAGCCCACA-3’,如SEQ ID NO:4所示；
SNP1的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-CACTGCCTTGTTCCTTTGCC-3’,如SEQID NO:5所示；
SNP2的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-ACTGCCACATCATCGGTTGT-3’,如SEQID NO:6所示；
SNP2的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-GAGCTCGAGATTGCATCGGA-3’,如SEQID NO:7所示；
SNP3的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-GCCACCAAAGCTAGCAACAC-3’,如SEQID NO:8所示；
SNP3的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-TTGCAGTCGAGGAAGCACAT-3’,如SEQID NO:9所示。
本发明还提供了一种用于检测葫芦耐热特性的试剂盒，包括上述的引物组。
本发明还提供了上述的引物组或上述的试剂盒在耐热葫芦植株筛选中的应用。
本发明还提供了一种葫芦耐热特性检测方法，通过对待测植株进行上述的分子标记的检测，当SNP1分子标记的第433位碱基是A时为耐热性状的植株；当SNP2分子标记的第199位碱基是G时为耐热性状的植株；当SNP3分子标记的第672位碱基是A时为耐热性状的植株。
优选的：包括以下步骤：
(1)提取待测样本基因组DNA；
(2)以提取的待测样本基因组DNA为模板，利用上述的引物组，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)对PCR扩增产物进行纯化、测序和鉴定。
优选的：步骤(2)PCR的反应体系为5×FastPfu Buffer 4μl、2.5mM dN TPs 2μl、5μM上游引物0.8μl、5μM下游引物0.8μl、FastPfu Polymerase 0.4μl、模板DNA 10ng，补ddH2O至20μl。
优选的：步骤(2)PCR的反应程序为95℃5min；95℃30s、60℃30、72℃45s，30个循环；72℃10min。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用，取得的技术效果为能够在苗期对葫芦耐热特性进行分子标记鉴定，在选育耐热葫芦品种的过程中，对供试葫芦材料进行选择，区分耐热和耐热葫芦材料。通过重测序结合生物信息学的方法获得的与葫芦耐热特性相关的分子标记，与葫芦耐热特性相关性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的SNP 1在18个待测葫芦中的Sanger测序结果图，其中，黑色条柱表示差异碱基位点；A：单株1～6；B：单株7～12；C：单株13～18。
图2附图为本发明提供的SNP 1在18个待测葫芦中的Sanger测序结果图，其中，黑色条柱表示差异碱基位点；A：单株1～6；B：单株7～12；C：单株13～18。
图3附图为本发明提供的SNP 1在18个待测葫芦中的Sanger测序结果图，其中，黑色条柱表示差异碱基位点；A：单株1～6；B：单株7～12；C：单株13～18。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用。
实施例1
表型数据统计，通过耐热葫芦L1和不耐热葫芦L6构建F2群体。亲本和群体播种后，植株长至两叶一心时，开始热处理。热处理条件为：40℃，80％相对湿度，光照强度30000lux，6h。
测定热处理前和热处理后的葫芦叶片电导率(EC)。叶片首先用去离子水清洗，切段，在去离子水中浸泡30min，利用电导率仪(PHSJ-3F，上海精密仪器)测定电导率，记为S1。之后加热叶片样本15min，测定电导率，记为S2。通过公式(S1/S2)×100％计算相对电导率(REC)。通过公式(Lt-Lck)/(100-Lck)×100％计算叶片伤害率(LRI)，其中Lt和Lck表示热处理前后REC。LRI越大，表明植株耐热性越差。
测序数据分析和QTL区域检测
利用SPSS软件的ANOVA和t-测验功能，分析亲本和F1的耐热性差异。对于F2群体，使用ORIGIN9.1软件的正态分布拟合功能分析LRI数据的频次分布。
利用CTAB法提取亲本和F2群体的基因组DNA。根据F2群体的LRI值，取9株耐热单株(LRI＝1～5％)和不耐热单株(LRI＝55～75％)，分别混和基因池，记为T-池和S-池。利用Illumina Hi-Seq4000，对亲本和2个基因池，分别进行深度为15×和20×的重测序。原始测序数据经过Trimmomatic(http://www.usadellab.org/cms/index.php？page＝trimmomatic)过滤，去除带接头、N比例＞5％或者质量值≤5的碱基超过50％的低质量测序序列。利用BWA软件，将得到的高质量测序数据与葫芦参考基因组(http://cucurbitgenomics.org/organism/13)进行比对。利用基因组分析工具包GATK的“UnifiedGenotyper”功能检测SNP变异位点。通过公式：碱基改变数目/比对读长的数目计算每一个SNP的SNP-系数，并通过公式(SNP-系数-T)-(SNP-系数-S)计算每个SNP的Δ(SNP-系数)。选择置信区间在95-99％的P<0.01的高值Δ(SNP-系数)区域作为葫芦耐热QTL。对位于QTL区域的SNP，利用葫芦参考基因数据库和Uniprot数据库进行功能注释和预测。
SNP标记开发和筛选
在葫芦2号染色体检测到QTL区域qHT2.2，Δ(SNP-系数)为0.19(P<0.01)。
实施例2
与耐热性相关的SNP标记的开发
1、取样：播种待评价葫芦材料18份，植株第一片新叶展开时，采集新叶1g，-80℃保存。
2、DNA提取：利用CTAB法(见：Murray HG,ThompsonWF.Rapid isolation ofhigher weight DNA.Nucleic Acids Res,1980,8:4321)提新鲜叶片基因组DNA。
提取后，DNA用紫外分光光度计测量质量及浓度。OD260/280值需在1.8～2.0，按照使用浓度为10ng/μl稀释DNA提取液。
3、PCR扩增：利用三对分子标记(表1)对供试材料的DNA进行PCR扩增。
表1
Figure GDA0003647608000000041
Figure GDA0003647608000000051
其中，SNP1的核苷酸序列(GTGAACTCCTTGAGCCCACAGTGTAAGGAGTTGATAAGATATAAAATTGATGTGTTCTAACCGTGGGACCCACCAACTCTTTGGACTAAACAAGGAGTGGAGTTCATAAAGTTACTTTCCTACCCCTACTTTTACTTTCTTACCCCTACTTCCCAACTCCTTGAGTTTTCAAATTTGACATGTTTGGTCACTATTTAAATTTGATATACTCAAACTTTATAGGTGTGGAGTAACGGCAAACTCAAGAAAGTGAGAGGGAGACCGGTGCCAACGATAGCGAGCATAGGAAATACCAACAACACCAACTCATGCATAATCTCATTATCGCTACTCATTACTCTTCCTGTTGACAGTCAAGTGTCTCCCCTTCTTCAACCAACTAATGAAAATGCAAATGTGGAACAATTCAGAAGTGTCGGCGATAGAAAGGAAAAAGAAGAAGACGAGGACAACAACAGTGAGGCAAAGGAACAAGGCAGTG)如SEQ ID NO:1所示；SNP2的核苷酸序列(TCCGATGCAATCTCGAGCTCGGCCCACCAAAGAGGAGAAAGCCTTGGGATCGCTTCATCCAGGGTTATCCCAGTTATTAATCTCAACCTTGAGGTAATGAGCTTCATTGTTGGTCTCTGCTCTGGATTGGAATGTAAGCAAGATCTTAGTAATTGACCGATTTGCTCCAACTGCTCCTCTTGAAACGATTGGAGAGTCGGGTCGACGAACTCCTTGAGCGGTTTGTCCAATCTTAAGTACTGTACTGCCCACTCTTCAAGTAAACCATTTTCTGCTGAATGGGGGATTCTACCTGTCATTAGTTCTAACAACACTAACCCAAAGCTGTAGATTTGGCTTTCTGAACCTCCTGATGAAGTGTTTAAGAGATGTCCACTGGTGCAGATCCGCTCGTCTGCAACGATTTCATTTTGTAAACTACACTCTGAAATCTTTGCTGCATAATCCTCAGTCAGATTGACGGCCGATGAGGTAAGGTTGAGTTGGATTAGCGGTGCGTTCT)如SEQ ID NO:2所示；SNP3的核苷酸序列(GCCACCAAAGCTAGCAACACCACAACCAACATCTAGAATAACTCTGATGTTATCCCCCCATTTGATATCCGATAATGTCTGTTCCAAATTCAGTCAAGTGATATAAAATCAAACCGACATTCATACAAAATTATACTGGCAGAGGAAGATGTACAGACTAGATAGATTACTAAACTGGAATATCCTAAACTACCATATAAATACTATCTTGCTATCAGCTAGTTAAGCTACAAGACACATAAATAGATGAACTCAATGAAGAAATAAGTGAAAATGGACCTTCTGAATGAAGTAAATGTAGTGATCAACTCCATCCTTGAACTGTGTACCACCTCCAGGAAAGTTAAGATACTCGCCCAACTTAACTACCCAATGTTGATCTTTCTTGTATTCAACTAGCTTCGGATGAGGAACATTATCGTACCAAATCTACAACAAAAGGGCGTTCAATAAAATCAATGATCATCACAAGTTCCCATCAAGACAAAACAAAACTCGCCAAGAAAATCCCAATTTGAATTTGGACAGAACAAAAAATCCCCAGGGCACAACCCAGAAAATCCTCCAAAAAAAATACAAGATCATCAACAAACCTTGGCAAAGAATGAAGCTGCTCACCATGTCCCTACTCTTGGGCCAGGGAACGGGGACCTTATAACCAACGGGAAGAGGGATCAAACAGCGCGGACTGGGATTAGGGCAATGGCGTTCACGATGCTCCATGTGCTTCCTCGACTGCAA)如SEQ ID NO:3所示；
PCR采用TransStart Fastpfu DNAPolymerase，20μl反应体系：
5×FastPfu Buffer 4μl、2.5mM dNTPs 2μl、5μM上游引物0.8μl、5μM下游引物0.8μl、FastPfu Polymerase 0.4μl、模板DNA 10ng，补ddH2O至20μl。
PCR扩增程序为：
PCR的反应程序为95℃5min；95℃30s、60℃30、72℃45s，30个循环；72℃10min，10℃保存。
4、PCR产物纯化：使用axyprep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。
5、PCR产物测序：PCR产物0.5μl，BigDye 2μl，BigDye Buffer 3μl，测序引物1μl(表1)，无菌纯化水13.5μl，总体积20μl。
扩增程序为：96℃预变性1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，共25个循环；4℃保存。
6、测序产物纯化：各PCR反应管加入2μl 125mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)和2μl3mol/l醋酸钠(pH 5.2)，再加入50μl 100％无水乙醇，短时间震荡，室温避光放置15min；4℃12000rpm离心30min，去上清，加入150μl预冷的70％乙醇，4℃12000rpm离心10min，去上清，室温避光放置15～30min；加入10μlHi-Di Formamide，短时间震荡溶解DNA，短时离心，95℃变性5min，冰中冷却4min。
7、电泳：使用1％琼脂糖电泳，观察PCR产物存在及纯化情况。要求带型清晰，无弥散，无杂带。
8、测序：变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，选用具有IVD标志的Seq_std_BDTV3.1_ASSY_POP7进行测序(参见图1～图3)。
9、数据收集与分析：使用ABI公司Data Collection与SequencingAnalysis软件进行数据收集和初步分析，使用STANDFORD软件对数据进行深度分析。通过SNP多态性位点碱基类型(表2)判断材料的耐热特性。
表2 Sanger测序的碱基类型及其对应的耐热特性评价
Figure GDA0003647608000000061
Figure GDA0003647608000000071
注：即用SNP1～3扩增(检测)引物检测同一批植株(1～18)。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 宁波市农业科学研究院
<120> 一种葫芦耐热特性的分子标记及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 481
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgaactcct tgagcccaca gtgtaaggag ttgataagat ataaaattga tgtgttctaa 60
ccgtgggacc caccaactct ttggactaaa caaggagtgg agttcataaa gttactttcc 120
tacccctact tttactttct tacccctact tcccaactcc ttgagttttc aaatttgaca 180
tgtttggtca ctatttaaat ttgatatact caaactttat aggtgtggag taacggcaaa 240
ctcaagaaag tgagagggag accggtgcca acgatagcga gcataggaaa taccaacaac 300
accaactcat gcataatctc attatcgcta ctcattactc ttcctgttga cagtcaagtg 360
tctccccttc ttcaaccaac taatgaaaat gcaaatgtgg aacaattcag aagtgtcggc 420
gatagaaagg aaaaagaaga agacgaggac aacaacagtg aggcaaagga acaaggcagt 480
g 481
<210> 2
<211> 502
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgatgcaa tctcgagctc ggcccaccaa agaggagaaa gccttgggat cgcttcatcc 60
agggttatcc cagttattaa tctcaacctt gaggtaatga gcttcattgt tggtctctgc 120
tctggattgg aatgtaagca agatcttagt aattgaccga tttgctccaa ctgctcctct 180
tgaaacgatt ggagagtcgg gtcgacgaac tccttgagcg gtttgtccaa tcttaagtac 240
tgtactgccc actcttcaag taaaccattt tctgctgaat gggggattct acctgtcatt 300
agttctaaca acactaaccc aaagctgtag atttggcttt ctgaacctcc tgatgaagtg 360
tttaagagat gtccactggt gcagatccgc tcgtctgcaa cgatttcatt ttgtaaacta 420
cactctgaaa tctttgctgc ataatcctca gtcagattga cggccgatga ggtaaggttg 480
agttggatta gcggtgcgtt ct 502
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccaccaaag ctagcaacac cacaaccaac atctagaata actctgatgt tatcccccca 60
tttgatatcc gataatgtct gttccaaatt cagtcaagtg atataaaatc aaaccgacat 120
tcatacaaaa ttatactggc agaggaagat gtacagacta gatagattac taaactggaa 180
tatcctaaac taccatataa atactatctt gctatcagct agttaagcta caagacacat 240
aaatagatga actcaatgaa gaaataagtg aaaatggacc ttctgaatga agtaaatgta 300
gtgatcaact ccatccttga actgtgtacc acctccagga aagttaagat actcgcccaa 360
cttaactacc caatgttgat ctttcttgta ttcaactagc ttcggatgag gaacattatc 420
gtaccaaatc tacaacaaaa gggcgttcaa taaaatcaat gatcatcaca agttcccatc 480
aagacaaaac aaaactcgcc aagaaaatcc caatttgaat ttggacagaa caaaaaatcc 540
ccagggcaca acccagaaaa tcctccaaaa aaaatacaag atcatcaaca aaccttggca 600
aagaatgaag ctgctcacca tgtccctact cttgggccag ggaacgggga ccttataacc 660
aacgggaaga gggatcaaac agcgcggact gggattaggg caatggcgtt cacgatgctc 720
catgtgcttc ctcgactgca a 741
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgaactcct tgagcccaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cactgccttg ttcctttgcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actgccacat catcggttgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagctcgaga ttgcatcgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccaccaaag ctagcaacac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgcagtcga ggaagcacat 20

Claims (6)

1.一种葫芦耐热特性的分子标记组合在耐热葫芦植株筛选中的应用，其特征在于，所述分子标记组合由SNP1、SNP2和SNP3组成；所述SNP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且其中第433位碱基是A或G；所述SNP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，且其中第199位碱基是G或A；所述SNP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，且其中第672位碱基是A或G。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葫芦耐热特性的分子标记组合的检测引物组，包括：
SNP1的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-GTGAACTCCTTGAGCCCACA-3’,如SEQ IDNO:4所示；
SNP1的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-CACTGCCTTGTTCCTTTGCC-3’,如SEQ IDNO:5所示；
SNP2的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-ACTGCCACATCATCGGTTGT-3’,如SEQ IDNO:6所示；
SNP2的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-GAGCTCGAGATTGCATCGGA-3’,如SEQ IDNO:7所示；
SNP3的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-GCCACCAAAGCTAGCAACAC-3’,如SEQ IDNO:8所示；
SNP3的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-TTGCAGTCGAGGAAGCACAT-3’,如SEQ IDNO:9所示。
3.一种葫芦耐热特性检测方法，其特征在于，通过对待测植株进行分子标记组合的检测，所述分子标记组合由SNP1、SNP2和SNP3组成；所述SNP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述SNP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；当SNP1分子标记的第433位碱基是A时，SNP2分子标记的第199位碱基是G且SNP3分子标记的第672位碱基是A时为耐热性状的植株。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测样本基因组DNA；
（2）以提取的待测样本基因组DNA为模板，利用引物组，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
（3）对所述PCR扩增产物进行纯化、测序和鉴定；
所述引物组包括：
SNP1的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-GTGAACTCCTTGAGCCCACA-3’,如SEQ IDNO:4所示；
SNP1的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-CACTGCCTTGTTCCTTTGCC-3’,如SEQ IDNO:5所示；
SNP2的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-ACTGCCACATCATCGGTTGT-3’,如SEQ IDNO:6所示；
SNP2的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-GAGCTCGAGATTGCATCGGA-3’,如SEQ IDNO:7所示；
SNP3的PCR扩增用上游引物的核苷酸序列为5’-GCCACCAAAGCTAGCAACAC-3’,如SEQ IDNO:8所示；
SNP3的PCR扩增用下游引物的核苷酸序列为5’-TTGCAGTCGAGGAAGCACAT-3’,如SEQ IDNO:9所示。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR的反应体系为5×FastPfu Buffer 4 μl、2.5 mM dNTPs 2 μl、5 μM上游引物 0.8 μl、5 μM下游引物 0.8 μl、FastPfu Polymerase 0.4 μl、模板DNA 10 ng，补ddH2O至20 μl。
6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR的反应程序为95℃ 5min；95℃ 30 s、60℃ 30、72℃ 45 s，30个循环；72℃ 10 min。
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