KR101483601B1

KR101483601B1 - 바지락의 원산지를 판별하는 단일염기다형성 마커들 및 이들을 사용하는 바지락의 판별 방법

Info

Publication number: KR101483601B1
Application number: KR20120136352A
Authority: KR
Inventors: 박중연; 안철민; 강정하; 변순규; 김은미
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2015-01-16
Also published as: KR20140068635A

Abstract

본 발명은 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 특이적 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커들, 이들 마커에 대한 프라이머들 및 이들을 사용하는 바지락의 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 바지락의 원산지를 미량의 시료로부터 정확하고 특이적으로 판별하여 중국산 바지락을 한국산 바지락으로 속여서 수입, 유통 및 판매되는 문제점을 신속하고 정확하게 차단하는 대책을 마련하게 함으로써 시장에서 불법 행위를 막고 국내 소비자 이익과 건강을 보호하고 생태계 교란을 예방할 수 있는 장점이 있다.

Description

바지락의 원산지를 판별하는 단일염기다형성 마커들 및 이들을 사용하는 바지락의 판별 방법 {Single nucleotide polymorphism markers for identifying origin place of short-necked clams and method for identifying short-necked clams by using the same}

본 발명은 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 특이적 단일염기다형성 (SNP) 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커들, 이들 마커에 대한 프라이머들 및 이들을 사용하는 바지락의 원산지를 판별하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게, 본 발명은 바지락의 원산지를 판별하는 데 유용한 특이적 SNP 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커들 및 이들 마커에 대한 프라이머들 그리고 (a) 단일염기다형성 마커를 증폭시키고 (b) 상기 마커의 SNP 부위의 유전자형을 분석하는 단계로 구성되는 바지락의 원산지를 결정하는 판별 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 판별 방법은 한국산 바지락을 중국산 바지락 등에 대해 효과적으로 판별할 수 있어 각종 경제적 및 생태학적 문제점 등을 극복하는데 널리 사용될 수 있다.

바지락은 백합과(Veneridae)에 속하고 학명은 루디타페스 필리피나룸 (Ruditapes philippinarum)이며, 남시베리아에서부터 중국에 이르는 태평양 연안 지역에 서식하는 소형 어패류이다. 바지락은 한국, 중국 및 일본을 비롯한 동아시아 국가들에서 양식되거나 채집되어 식용으로 널리 사용되고 있다. 우리나라에서는 서해안과 남해안의 갯벌에 주로 서식하고, 특히 서해안 갯벌에서 가장 중요한 양식 품종으로 경제적 가치가 높다. 그러나, 연안 간척 매립으로 인한 서식처의 감소와 대량 폐사 등으로 인해 현재 양식 바지락의 생산량은 감소 추세를 보이고 있다.

이에 따라 저렴한 중국산의 바지락 종패를 수입하여 국내 연안 지역에 살포하거나 중국산 바지락을 국내산으로 속여 시중에 유통시키는 등의 다양한 불법 행위들이 나타나고 있다. 따라서, 이와 같은 불법 행위들을 통하여 일부 수입업자나 유통업자 그리고 식당 등에서는 국내산과 중국산의 가격 차이를 이용하여 소비자로부터 부당이익을 취하는 경우도 비일비재한 실정이다.

이와 같은 관점에서 본 발명이 속하는 기술분야에서는 전술한 바와 같은 불법 행위에 대한 소비자의 피해를 줄이고 불법 살포를 통한 유전자-이동(gene-flow)으로 인해 나타날 수 있는 바지락 집단의 생태학적 교란 등을 최소화하기 위하여 한국산 바지락과 중국산 바지락의 원산지를 구별하는 기술의 제공이 절실히 필요하다.

이에 본 발명자들은 바지락의 원산지를 판별하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, EST(Expressed Sequence Tag) 라이브러리로부터 바지락의 원산지를 판별하는 데 유용한 연속염기서열(contig) 및 단일염기다형성(SNP) 부위를 선별하고 연속염기서열(contig)의 전부 또는 일부를 포함하는 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 제작한 다음, (a) 상기 프라이머 쌍을 사용하여 SNP 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커를 증폭시키고 (b) 해당 마커의 SNP 부위의 유전자형을 분석하는 단계로 이루어진 바지락의 원산지를 효과적으로 판별하는 방법을 제공함으로써, 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-2004-0044740호 (2004.05.31) 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0106172호 (2011.09.28) 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0042734호 (2011.04.27) 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0077174호 (2011.07.07)

본 발명의 목적은 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 특이적 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커들, 이들 마커에 대한 프라이머들 및 이들을 사용하는 바지락의 원산지를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 서열번호 1 내지 서열번호 11의 각 염기서열의 전부 또는 일부를 포함하는, 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 단일염기다형성 마커들을 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 (a) 상기 단일염기다형성 마커를 증폭시키고 (b) 상기 마커의 SNP 부위의 유전자형을 분석하는 단계로 구성되는, 바지락의 원산지의 판별 방법을 제공하는데 있다.

추가로, 본 발명의 목적은 상기 SNP 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커들을 각각 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍들을 제공하는데 있다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 특이적 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커들을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 11의 각 염기서열을 가지는 연속염기서열(contigs)의 전부 또는 일부를 포함하는, 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 단일염기다형성 마커들을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 제공한다. 참고로, 본 발명의 명세서에서 기재되는 SNP 부위는 상기 SNP 마커에 대한 정방향 프라이머 서열의 5'위치를 기준으로 번호 매김(numbering)되어 표시된다. 이는 서열번호 1 내지 서열번호 11의 각 염기서열을 가지는 연속염기서열(contigs)의 길이가 너무 길어서 연속염기서열(contigs) 전체를 기준으로 SNP 부위를 번호 매김하면 SNP 부위를 찾기가 어렵고 불편한 문제를 감안하여, 편의상 SNP 부위를 각각의 연속염기서열 내의 정방향 프라이머의 5' 위치를 기준으로 번호 매김한 것임을 밝혀둔다.

구체적으로, 본 발명은 단일염기다형성 마커로서, 서열번호 1의 단일염기다형성 마커 KRph 18421, 서열번호 2의 단일염기다형성 마커 KRph 20768, 서열번호 3의 단일염기다형성 마커 KRph 27135, 서열번호 4의 단일염기다형성 마커 KRph 29263, 서열번호 5의 단일염기다형성 마커 KRph 29658, 서열번호 6의 단일염기다형성 마커 KRph 31762, 서열번호 7의 단일염기다형성 마커 KRph 32035, 서열번호 8의 단일염기다형성 마커 KRph 32296, 서열번호 9의 단일염기다형성 마커 KRph 37987, 서열번호 10의 단일염기다형성 마커 KRph 41628 및 서열번호 11의 단일염기다형성 마커 KRph 5948로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 제공한다(도 2a 내지 도 2k 참조).

도 2a 내지 도 2k에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 각각의 단일염기다형성 마커에 대한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 쌍이 대괄호 안에 밑줄로서 표시되어 있고 단일염기다형성(SNP) 부위는 적색의 "N"으로서 표시되어 있다.

또한, 본 발명의 단일염기다형성 마커는 서열번호 1의 139번, 140번, 152번, 180번, 182번, 186번, 194번, 196번 및 199번 염기, 서열번호 2의 147번 염기, 서열번호 3의 144번 염기, 서열번호 4의 143번, 190번 및 205번 염기, 서열번호 5의 245번 염기, 서열번호 6의 184번 염기, 서열번호 7의 227번 염기, 서열번호 8의 207번 염기, 서열번호 9의 159번 염기, 서열번호 10의 148번 염기, 그리고 서열번호 11의 164번 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함한다.

구체적으로, 본 발명에서 서열번호 1의 단일염기다형성 마커 KRph 18421은 139번, 140번, 152번, 180번, 182번, 186번, 194번, 196번 또는 199번 위치의 하나 이상에서 SNP 부위를 포함하고, 서열번호 2의 단일염기다형성 마커 KRph 20768은 147번 위치에서 SNP부위를 포함하며, 서열번호 3의 단일염기다형성 마커 KRph 27135는 144번 위치에서 SNP 부위를 포함하고, 서열번호 4의 단일염기다형성 마커 KRph 29263은 143번, 190번 또는 205번 위치의 하나 이상에서 SNP 부위를 포함하며, 서열번호 5의 단일염기다형성 마커 KRph 29658은 245번 위치에서 SNP 부위를 포함하고, 서열번호 6의 단일염기다형성 마커 KRph 31762는 184번 위치에서 SNP 부위를 포함하며, 서열번호 7의 단일염기다형성 마커 KRph 32035는 227번 위치에서 SNP 부위를 포함하고, 서열번호 8의 단일염기다형성 마커 KRph 32296은 207번 위치에서 SNP 부위를 포함하며, 서열번호 9의 단일염기다형성 마커 KRph 37987은 159번 위치에서 SNP 부위를 포함하고, 서열번호 10의 단일염기다형성 마커 KRph 41628은 148번 위치에서 SNP 부위를 포함하며, 서열번호 11의 단일염기다형성 마커 KRph 5948은 164번 위치에서 SNP 부위를 포함한다.

본 발명에서는 가장 일반적으로 사용되는 SNP 발굴 방법 중 하나인 mRNA로부터 만들어진 EST 라이브러리의 염기서열을 조사하여, 한국산과 중국산 바지락의 염기서열 차이를 보이는 SNP 부위를 조사하고 선별하여 CLC 메인 워크벤치 버전 5. 6. 1 소프트웨어를 사용하여 원산지 판별 프라이머를 제작하였다.

다음으로, 한국산과 중국산 바지락에서 추출한 DNA 시료를 주형으로 사용하고, 적정 Tm 값을 구하기 위해 구배 중합효소 연쇄반응(gradient PCR)을 수행하였다. 적정 Tm 값에서 PCR을 통해 증폭된 DNA는 직접 서열결정(direct sequencing) 방법으로 염기서열을 확인한 다음 한국산과 중국산 바지락의 염기서열 차이를 재확인하고 분석하여 최종적으로 11개의 프라이머쌍들로부터 21개 SNP 부위를 가지는 단일염기다형성 마커들을 분리하였다.

또한, 본 발명은 (a) 바지락 시료로부터 전술한 바와 같은 본 발명의 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계와, (b) 상기 마커의 단일염기다형성 부위의 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 바지락의 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.

상기 바지락은 루디타페스 필리피나룸 (Ruditapes philippinarum), 그의 아종 및 변종들을 포함할 수 있고, 또한 한국산 바지락 및 중국산 바지락을 포함하여 다양한 원산지들로부터 나온 바지락들을 포함할 수 있다.

상기 마커의 증폭을 위해 필요한 바지락 시료 DNA는 각 조직 또는 다양한 가공물 등으로부터 다양한 방법들에 의해 획득할 수 있고, 이들을 분석하여 원산지를 결정하는 것이기 때문에 당업자가 숙지하고 있는 방법이라면 모두를 사용할 수 있다. 바람직하게, 바지락 시료로는 내장, 비장, 근육, 간, 아가미를 들 수 있다.

또한, 상기 획득한 DNA 시료를 PCR로 증폭하는 것은 검사 표본을 늘리기 위한 것이기 때문에 증폭 산물을 얻는 방법도 특별히 제한되지 않고 당업자가 숙지하고 있는 방법이라면 모두가 적용될 수 있다.

본 발명의 바지락의 원산지를 판별하는 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 단일염기다형성 마커는 서열번호 12 내지 서열번호 33의 각 염기서열을 포함하는 프라이머들을 사용하는 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증폭시킨다.

구체적으로, 서열번호 1의 단일염기다형성 마커 KRph 18421은 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 2의 단일염기다형성 마커 KRph 20768은 서열번호 14의 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 3의 단일염기다형성 마커 KRph 27135는 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 4의 단일염기다형성 마커 KRph 29263은 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 5의 단일염기다형성 마커 KRph 29658은 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 21의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 6의 단일염기다형성 마커 KRph 31762는 서열번호 22의 정방향 프라이머 및 서열번호 23의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 7의 단일염기다형성 마커 KRph 32035는 서열번호 24의 정방향 프라이머 및 서열번호 25의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 8의 단일염기다형성 마커 KRph 32296은 서열번호 26의 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 9의 단일염기다형성 마커 KRph 37987은 서열번호 28의 정방향 프라이머 및 서열번호 29의 역방향 프라이머의 쌍, 서열번호 10의 단일염기다형성 마커 KRph 41628은 서열번호 30의 정방향 프라이머 및 서열번호 31의 역방향 프라이머의 쌍, 그리고 서열번호 11의 단일염기다형성 마커 KRph 5948은 서열번호 32의 정방향 프라이머 및 서열번호 33의 역방향 프라이머의 쌍을 사용하여 증폭시킨다.

또한, 본 발명의 바지락의 원산지를 판별하는 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서는 서열번호 1의 139번, 140번, 152번, 180번, 182번, 186번, 194번, 196번 및 199번 염기, 서열번호 2의 147번 염기, 서열번호 3의 144번 염기, 서열번호 4의 143번, 190번 및 205번 염기, 서열번호 5의 245번 염기, 서열번호 6의 184번 염기, 서열번호 7의 227번 염기, 서열번호 8의 207번 염기, 서열번호 9의 159번 염기, 서열번호 10의 148번 염기, 그리고 서열번호 11의 164번 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위의 유전자형을 결정하고, 추가적으로 표 2에 나열한 바와 같이 유전자형 빈도를 분석한다.

본 발명의 SNP 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커들 및 이들에 대한 프라이머들은 통상적인 방법에 따라 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 각종 DNA 칩 또는 키트 등으로 개발될 수 있다.

한편, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "다형성 (polymorphism)"이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 둘 이상의 대체적 서열 또는 대립 형질의 발생을 의미하고 다형성 마커 또는 부위는 발산(divergence)이 일어나는 좌위(locus)를 통상 의미한다. 바람직한 마커는 선택된 집단에 1% 이상, 더 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두 개 이상의 대립 형질을 가지는 것이다.

본 발명은 바지락의 원산지를 간단하고 신속하면서도 정확하게 또한 특이적으로 판별할 수 있도록 하여, 중국산 바지락이 한국산 바지락으로 둔갑되는 것을 수입, 검역 및 유통 과정에서 신속하게 차단하는 대책을 마련하고 바지락의 유통 과정의 투명성을 제고하며 더 나아가 국내 소비자의 이익과 건강을 보호할 수 있다.

또한, 본 발명은 바지락의 원산지를 미량의 시료로부터 정확하고 특이적으로 판별하여 중국산 바지락을 한국산 바지락으로 속여서 수입, 유통 및 판매되는 문제점을 신속하고 정확하게 차단하는 대책을 마련하게 함으로써 시장에서 불법 행위를 막고 국내 소비자 이익과 건강을 보호하고 생태계 교란을 예방할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 단일염기다형성 마커 KRph 29263(서열번호 4)의 SNP 부위에서 한국산 및 중국산 바지락의 염기서열을 SeqMan 프로그램으로 비교, 분석하여 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2k는 본 발명의 바지락의 원산지를 판별할 수 있는 각각의 단일염기다형성 마커의 염기서열을 도시하는 도면으로서, 각각의 마커에 대한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 쌍이 대괄호 안에 밑줄로서 표시되어 있고 단일염기다형성(SNP) 부위는 적색의 "N"으로서 표시되어 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예 1: 바지락 원산지의 판별을 위한 단일염기다형성 마커들의 선별

본 실시예에서는 가장 일반적으로 사용되고 있는 SNP 발굴 방법 중 하나인 mRNA로부터 만들어진 EST 라이브러리의 염기서열을 조사하여 한국산과 중국산 바지락의 염기서열 차이를 보이는 SNP 부위들을 선별하고 이들 부위들을 포함하는 프라이머들을 제작하였다.

구체적으로, 5가지의 조직(내장, 비장, 근육, 간, 아가미)이 혼합된 바지락으로부터 전체 RNA를 분리하고 그 중에서 mRNA를 순수 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고 780,000개의 ESTs 서열정보를 얻은 다음 46,405개의 연속염기서열(contigs)(평균 400 bp, 2개 이상의 ESTs로 구성됨)을 선별하여 49,540개의 잠재적인 SNPs를 검출하였다. 또한, 이들 49,540개의 잠재적인 SNP 부위들로부터 CLC 메인 벤치워크 (CLC Main Workbench; 버전 5. 6. 1)를 사용하여 최적의 SNP 부위들을 검색(screening)하고 이들로부터 프라이머(primer)를 제작하였다. 그리고, 상기에서 제작된 프라이머들을 사용하여 각각 바지락 8개체 및 24개체를 테스트한 다음 실제로 중국산과 한국산의 판별이 가능한 최종 11개의 프라이머들 및 21개의 SNP 부위들을 안출하였다. 이들 프라이머는 한국의 제노텍(대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다 (표 1 참조).

SNP 마커 서열번호	SNP 마커 명칭 KRph	SNP 위치(bp)	프라이머 서열번호	프라이머(5'->3')	증폭산물 (bp)
1	18421	139	12	F: ACAGGCGCTTACATTGGGT	476
		140	13	R: CAACAGTAAAGCAAAATATACTGC
		152
		180
		182
		186
		194
		196
		199
2	20768	147	14	F: TGATGCAAGTATGCATCGTAG	341
			15	R: GTGATGCGCTGGTTCTTC
3	27135	144	16	F: CTAGAATCATCATCCGGTTTTAA	310
			17	R: AACTTTGACGTCAACAAAACCG
4	29263	143	18	F: GTGTTAATGATGCCATTAAAATGG	338
		190	19	R: CTGTTCTTTCAATATACTTTACTGG
		205
5	29658	245	20	F: CCTTATTGCAGCAGATGAATG	305
			21	R: ACAATAGCCTGAAAGTGTTTCTT
6	31762	184	22	F: GTTATTTGGAAGATAGACGTCC	326
			23	R: ACATGGTATTGGAATAAATGCAG
7	32035	227	24	F: TTCACATTTGACCGAAAAAGTCA	439
			25	R: TGCTACAGTATAGTATACATCGA
8	32296	207	26	F: ATTACTTTATAGTTAGCATTGACC	310
			27	R: ACACAGTATAGAGCCTGGT
9	37987	159	28	F: GGGATCCTGGATAGGGTT	310
			29	R: GTACAGCTAGCGATCGGA
10	41628	148	30	F: GTCTGTATATATTTACGCAATGC	340
			31	R: ATACCTCGAATGTTCCTCGT
11	5948	164	32	F: ATCTCAATTATGAACACACTTGTG	375
			33	R: GATCCTTCACACAAATTGTTCC

실시예 2: 바지락 시료 채집 및 게놈 DNA 분리

본 실시예에서는 바지락의 원산지 판별을 위해 한국산(전라남도 고흥 지역)과 중국산(대련 지역) 바지락 시료들을 채집하여 각각 96개체씩의 조직을 99.99% 에탄올에 고정하고, 일부 미량의 조직을 적출하여 게놈 DNA를 추출하였다. 한국산 및 중국산 바지락 조직 각각을 멸균된 1.5 mL E-튜브에 약 0.2 g씩 넣고, 용해 완충용액 (lysis buffer) 900 μL 및 단백분해효소 K (proteinase K, PK) 5 μL를 첨가하여 잘 섞은 다음, 37℃ 항온배양기 (incubator)에서 18 시간 이상 배양하였다. 이 과정에서는 게놈 DNA 정제 키트로서 맥추출기 (MagExtractor -Genome-, (주)티엔티 리써치)를 사용하였다. 배양한 조직 시료는 일본의 DNA 자동화 추출기인 MFX-6100 (토요보사 (TOYOBO))를 사용하여 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 사용하였다.

실시예 3: 중합효소 연쇄반응 ( PCR )

본 실시예에서 한국산 및 중국산 바지락에서 추출한 DNA 시료를 주형으로 사용하는 중합효소 연쇄반응은 다음의 과정으로 수행되었다.

(3-1) Tm 값 결정

먼저 적정 Tm 값을 구하기 위하여, 48 내지 62℃의 온도 범위에서 한국산과 중국산 바지락 각각 2개체씩의 DNA 시료를 사용하여 구배 중합효소 연쇄반응 (gradient PCR)을 수행하였다. 구체적으로, PCR 전체 부피는 10 μL로 맞추었고 항-히스 태그 하이-플러스(anti Hs Taq high -Plus-) ((주)티앤티 리써치, 10x PCR 완충용액, 10 mM dNTP, Taq 중합효소를 포함함)를 사용하여 EST 라이브러리로부터 제작한 상기 프라이머들로 구배 PCR을 수행하였다.

(3-2) PCR 조성

전체 부피를 10 μL로 맞추고 다음과 같은 조성으로 PCR을 수행하였다; 1 μL DNA 주형, 6.9 μL 증류수 (D.W.), 0.4 μL의 각 프라이머 (10 pmol), 0.2 μL의 10 mM dNTP (2.5 mM의 각 dNTPs), 1 μL 10x PCR 완충용액 및 0.1 μL Taq 중합효소 (2.5 유닛/mL).

한편, 염기서열 결정(sequencing)을 위하여 전체 부피를 30 μL로 조정한 (volume up) PCR 조성은 다음과 같다; 3 μL DNA 주형, 21.9 μL 증류수, 1.2 μL의 각 프라이머 (10 pmol), 0.6 μL의 10 mM dNTP (2.5 mM의 각 dNTPs), 3 μL 10x PCR 완충용액 및 0.3 μL의 Taq 중합효소 (2.5 유닛/mL).

(3-3) PCR 조건

다음과 같은 조건 하에서 PCR을 수행하였다; 95℃에서 11분, 94℃에서 1분, 48-62℃에서 1분, 72℃에서 1분 과정을 35회 반복하고, 72℃에서 5분, 4℃에서 30분, 8℃에서 유지.

(3-4) 결과 분석

다음으로 PCR 증폭 반응이 끝나면 PCR 증폭산물 3 μL에 젤 로딩 버퍼 (0.25% 자일렌 시안올 (xylene cyanol) FF, 40% 슈크로스, 증류수로 50 ml로 맞춤) 2μL를 넣고, 1 μL/mL 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)를 포함하는 아가로즈 젤에 넣고 전기영동하였다. 이후 UV 투과기(transilluminator)가 부착된 화상분석시스템 (바이오-래드사 (Bio-rad), Gel Doc 2000)에서 PCR 증폭산물의 밴드를 확인하였다.

(3-5) 정제

상기 과정에서 얻은 PCR 증폭산물은 QIAquick PCR 정제 키트의 프로토콜 (퀴아젠사 (QIAGEN))을 사용하여 정제하였다.

실시예 4: 염기서열 결정 및 결과 분석

(4-1) 염기서열 결정을 위한 PCR 조성

다음과 같은 조성으로 PCR을 수행하였다; 정제된 1 μL DNA 주형, 4.9 μL 증류수, 1 μL 빅다이(Bigdye), 1.5 μL의 5x 서열결정 완충용액(sequencing buffer), 1.6 μL 정방향 프라이머 1 pmol을 혼합하여 사용 [빅다이 터미네이터 버전 3.1 순환 시퀀싱 키트(BigDye^®Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, 어플라이드 바이오시스템사(Applied Biosystems)].

(4-2) 염기서열 결정을 위한 PCR 조건

다음과 같은 조건 하에서 PCR을 수행하였다; 95℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분의 과정을 25회 반복하고 4℃에서 유지.

(4-3) 염기서열 결정을 위한 정제

염기서열 결정(sequencing)을 위한 PCR 주형들을 정제하기 위하여, 25 μL의 99.99% 에탄올, 1 μL의 3 M 소듐 아세테이트, 및 1 μL의 125mM EDTA의 혼합물을 27 μL씩 분주하여 혼합시키고, 2,250rpm에서 45분 동안 원심분리 하였다. 세척 (washing)을 하기 위해 70% 에탄올을 35 μL씩 분주하여 1,650rpm에서 15분간 동안 원심분리한 다음 자연 건조하였다. 자연 건조된 각 시료에 Hi-Di^TM 포름아마이드 (어플라이드 바이오시스템사(Applied Biosystems), Warrington, UK)를 10 μL씩 분주하고 96-웰 플레이트에 옮긴 다음 95℃에서 2분 동안 가열하여 염기서열 결정 전까지 냉동보관하였다.

(4-4) 염기서열 결정 ( ABI 3130) 및 결과 분석

본 실시예에서 염기서열은 3130xl 유전적 분석기(Genetic Analyzer, 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 결정하고 그 결과는 SeqMan Pro(DNASTAR Lasergene^®, USA) 및 GENETYX (버전 7.0.3) 프로그램으로 분석하여 SNP 부위들을 탐색하였다. 또한 한국산 및 중국산 바지락의 집단의 유전자형(genotype) 및 일배체형(haplotype)은 GeneClass 2.0 (INRA-CBGP/CIRAD) 및 Mega 4 프로그램을 사용하여 비교, 분석하였다.

그 결과, 도 1은 본 발명의 연속염기서열 29263 (contigs 29263)에서 한국산 및 중국산 바지락의 염기서열을 SeqMan 프로그램으로 분석한 것이고, 도 1에서 노란색 부분은 SNP 부위들을 나타내고 있다. 여기에서 중국산 (CHN)은 염기 T, 한국산 (KOR)은 염기 G로 나타나는 것을 알 수 있었다. 따라서, 서열결정을 통한 데이터 분석으로 SNP 부위 염기의 명확한 차이를 확인할 수 있었고 이러한 SNP 부위들로부터 특이적으로 중국산 바지락과 한국산 바지락의 원산지 판별이 가능하였다. 하기 표 2는 본 발명에서 분석한 연속염기서열들에 존재하는 21가지의 SNP 부위들의 염기서열을 조사, 분석하여 정리한 것이다.

구체적으로, 상기 표 2는 본 발명에서 선별한 11가지의 연속염기서열들의 SNP 마커들 상에 존재하는 21가지의 SNP 부위들의 위치와 해당 위치에서 나타나는 유전자형 및 염기의 빈도를 나타낸 것이다. 상기 표 2에서 살펴본 바와 같이 중국산과 한국산 바지락은 유전자형에서 차이가 명확하고, 유전자형 빈도의 수치에서도 중국산과 한국산 바지락이 뚜렷하게 구별되는 것을 알 수 있었다. 예를 들어, 본 발명의 SNP 마커 KRph 18421의 139번 염기의 SNP 부위는 한국산 바지락에서는 T/T의 유전자형이 0.98의 빈도로 나타나고, 중국산 바지락에서는 G/G의 유전자형이 1.00의 빈도로 나타나는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 염기서열 분석을 수행하는 경우, 한국산 바지락은 염기 T, 중국산 바지락은 염기 G로 구별되게 나타나고 이를 통하여 바지락의 원산지가 명확하게 판별되는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 SNP 마커들의 11개의 프라이머 쌍들을 모두 같이 사용하여 분석하는 경우에는 식별력의 정확도를 보다 더 높일 수 있었다.

하기 표 3은 본 발명의 SNP 마커 부위들을 사용한 한국산 및 중국산 바지락의 식별력을 조사하여 나타낸 것이다.

상기 표 3은 GeneClass 2.0 (INRA-CBGP/CIRAD) 프로그램을 사용하여 분석한 식별력의 결과이다. 한국산 및 중국산 바지락의 식별력은 97.4%의 정확도를 나타내었고, 평균값도 역시 한국산 95.83%, 중국산 95.76%의 높은 수치를 나타내어 정확도가 높은 원산지 판별이 가능한 것을 알 수 있었다.

정리하면, 본 발명에서는 바지락 5개 조직의 780,000개의 EST 라이브러리 데이터로부터 만들어진 46,405개의 연속염기서열들에서 SNP 마커(marker)로서 이용가능한 49,540개의 SNP 부위들을 검색하였다. 이를 기초로 하여 해당 SNP 부위를 포함하는 108개의 프라이머들을 제작하였으며, 이들 중에서 21개의 프라이머들이 1차적으로 선별되었으며, 2차 검증을 거치면서 다시 최종적으로 11개의 연속염기서열 프라이머들 및 21개의 SNP 부위들이 선별되었다(표 1 참조). 상기 1차 선별에서는 한국산과 중국산 바지락 각각 8개체로 염기서열을 비교 분석하였고, 2차 검증에서는 24개체로 개체수를 늘여서 추가 실험을 실시하여 선별하였다.

또한, 최종 11개의 프라이머들에 대한 한국산과 중국산 바지락의 원산지 판별 능력을 검증하기 위하여, 한국산과 중국산 바지락의 각각 1개 집단을 사용하여 21개의 SNP 부위를 비교하였다. 그 결과, 연속염기서열 KRph 18421, KRph 27135, KRph 31762, KRph 32296, KRph 37987, KRph 41628, KRph 5948의 SNP 부위에서 한국산과 중국산 바지락의 차이가 비교적 명확하게 나타났다(한국산과 중국산 바지락 각각의 SNP 염기에 대한 빈도 범위가 0.60-1.00)(표 2 참조).

또한, 분석한 바지락의 유전자형 데이터를 바탕으로 한국산과 중국산 바지락 집단의 원산지 판별에 대한 식별력을 추정하기 위하여 GeneClass 2.0을 이용하였다. 21개의 후보군 SNP 마커 부위들을 사용하여 분석한 결과, 정확성 97.4%에서 한국산 바지락 집단에 대해 한국산 바지락일 확률이 95% 이상이고, 중국산 바지락 집단에 대해 중국산일 확률 역시 95% 이상으로 산정되어 본 발명의 바지락의 원산지를 판별하는 SNP 마커들은 높은 식별력을 나타내는 것을 확인하였다(표 3 참조).

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

<110> Republic of Korea <120> Single nucleotide polymorphism markers for identifying origin place of short-necked clams and method for identifying short-necked clams by using the same <130> P12-0298KR <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 600 <212> DNA <213> Contig18421 (Ruditapes philippinarum) <400> 1 aacgacaagc atgtacttcc tatttccgaa ttgctctctg ctggcgctat tcacatccgt 60 gcgcccattt ttgttacgtg agagaatact gcaagaccac aggcgcttac attgggtatt 120 attatgcgaa tgggtgctta gtaggatgtg acccaggacc ctccaatcca atatgtccat 180 taaggaacaa ataaaatcat cagcactttc gtttctaaaa tgtgtctttt cataaanntt 240 aaattacaan tatggtgatg tgcaatttca gaacaaantn ctcncccaca tngnctnctt 300 aacactattt aatatactct atgaaacaga attaaaatgg agtttattta aatattttag 360 gaattgtata atatattcaa gtatgtttca atgattatta ttatgtattt ctttcaaaga 420 aattatatat tttctgataa tacacacgtt ttcatttgta aaatcacaaa ttttgactaa 480 tgtccatttt aactgttgtt tcaattattt tgtgaaaatt taatcatata agtatatcag 540 atgtcttttt gcagtatatt ttgctttact gttgaaattc atgatctttg 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<211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 18421 forward primer <400> 12 acaggcgctt acattgggt 19 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 18421 reverse primer <400> 13 caacagtaaa gcaaaatata ctgc 24 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 20768 forward primer <400> 14 tgatgcaagt atgcatcgta g 21 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 20768 reverse primer <400> 15 gtgatgcgct ggttcttc 18 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 27135 forward primer <400> 16 ctagaatcat catccggttt taa 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 27135 reverse primer <400> 17 aactttgacg tcaacaaaac cg 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 29263 forward primer <400> 18 gtgttaatga tgccattaaa atgg 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 29263 reverse primer <400> 19 ctgttctttc aatatacttt actgg 25 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 29658 forward primer <400> 20 ccttattgca gcagatgaat g 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 29658 reverse primer <400> 21 acaatagcct gaaagtgttt ctt 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 31762 forward primer <400> 22 gttatttgga agatagacgt cc 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 31762 reverse primer <400> 23 acatggtatt ggaataaatg cag 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 32035 forward primer <400> 24 ttcacatttg accgaaaaag tca 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 32035 reverse primer <400> 25 tgctacagta tagtatacat cga 23 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 32296 forward primer <400> 26 attactttat agttagcatt gacc 24 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 32296 reverse primer <400> 27 acacagtata gagcctggt 19 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 37987 forward primer <400> 28 gggatcctgg atagggtt 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 37987 reverse primer <400> 29 gtacagctag cgatcgga 18 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 41628 forward primer <400> 30 gtctgtatat atttacgcaa tgc 23 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 41628 reverse primer <400> 31 atacctcgaa tgttcctcgt 20 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 5948 forward primer <400> 32 atctcaatta tgaacacact tgtg 24 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRph 5948 reverse primer <400> 33 gatccttcac acaaattgtt cc 22

Claims

단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 서열번호 1의 단일염기다형성 마커로서 서열번호 1의 139번, 140번, 152번, 180번, 182번, 186번, 194번, 196번 또는 199번 위치의 하나 이상에서 SNP 부위를 포함하는 단일염기다형성 마커와,
상기 SNP 부위에 상보적으로 결합 가능한 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머의 쌍을 포함하는 바지락 원산지 판별용 조성물.
삭제
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제1항에 있어서,
한국산 바지락 및 중국산 바지락의 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는 바지락 원산지 판별용 조성물.
(a) 바지락 시료로부터, 서열번호 1의 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계와,
(b) 상기 마커의 단일염기다형성 부위의 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 바지락의 원산지의 판별 방법.
제6항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 상기 서열번호 1의 단일염기다형성 마커는 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머의 쌍을 사용하는 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증폭시키는 것을 특징으로 하는 바지락의 원산지의 판별 방법.
삭제
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 (b) 단계에서는 서열번호 1의 139번, 140번, 152번, 180번, 182번, 186번, 194번, 196번 및 199번 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성 부위의 유전자형을 분석하는 것을 특징으로 하는 바지락의 원산지의 판별 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
한국산 바지락 및 중국산 바지락의 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는 바지락의 원산지의 판별 방법.