CN112725495B - 辣椒cms恢复系筛选kasp标记引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物，包括两条长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2，以及一条长21bp的反向引物KS23C。本发明的关键创新点是发掘了与辣椒CMS育性恢复相关的SNP，开发出一个可用于辣椒CMS恢复系筛选的KASP分子标记KS23。利用KS23筛选辣椒CMS恢复系，只需根据实例三中的扩增体系和扩增程序，对待测植株DNA只进行一次PCR扩增，操作简单，无需进行CAPS标记的酶切反应和InDel标记复杂耗时的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接通过荧光定量PCR仪中荧光检测到的基因分型值和分布图，直接筛选出恢复基因型G/G和恢复系，检测效率达69％以上。

Description

辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用
技术领域
本发明属于植物生物工程技术领域，具体涉及辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用。
背景技术
辣椒是重要的蔬菜作物，辣椒杂种优势明显，但辣椒杂交种子生产过程中需要人工去雄，费时费工，且纯度难以保证。利用雄性不育系，尤其是胞质雄性不育(CMS)“三系”配套法生产杂交种子，一方面不但可以省去人工去雄环节，省时省工，还能确保杂交种子纯度，另一方面还可以减少亲本流失风险，保护品种知识产权。
然而，由于CMS恢复系较少，大多数自交系不具有恢复能力，需要人工田间转育恢复系。常规的转育方法是利用转育父本与恢复源进行不断的回交，每回交一代需要与不育系测交一代进行恢复单株的鉴定，费时费工，成本高，周期长。而利用分子标记可以对恢复单株进行苗期筛选，则无需进行单株测交验证，能够高效、快速地筛选恢复株系，极大缩短转育周期。
现有技术存在的问题：目前，已有个别关于辣椒CMS育性恢复的分子标记，但这些标记存在的主要问题是通用性较差，对于不同遗传背景材料的选择效率较低。另一个主要问题是多少标记为CAPS标记，需要先进行PCR扩增，然后再进行酶切处理，最后再进行电泳检测，步骤较多，程序繁琐，且所需内切酶成本较高，导致检测成本上升。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用。为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
1、辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物KS23，包括两条长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2，以及一条长21bp的反向引物KS23C。KS23A1如序列表SEQ ID NO：1所示，KS23A2如序列表SEQ ID NO：2所示，KS23C如序列表SEQ ID NO：3所示。
2、辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物KS23获取方法，包括如下步骤：
(1)利用不育系8A与恢复系R1(8A和R1均由甘肃省农业科学院蔬菜研究所选育)杂交，获得杂种一代F1，F1代植株自交得F2。
(2)对F2群体进行育性鉴定，最后选取30株完全不育单株和30株完全可育单株，分别构建不育池SP和恢复池RP。
(3)分别提取不育池SP和恢复池RP花蕾RNA，委托百迈克生物科技公司(http://www.biomarker.com.cn/)利用Illumina HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125。
(4)利用转录组数据在线比对软件STAR分别对SP和RP测序reads与辣椒参考基因组(The Pepper Genome Database 2.0)进行比对，并通过GATK(版本：3.1-1，https://www.broadinstitute.org/gatk/index.php)，查找单SNP位点。
(5)采用SNP-index法对不育池SP和恢复池RP进行SNP关联分析。SNP-index是通过混合池间的基因型频率差异进行标记关联分析的方法，SNP-index参数是指某个位点含有SNP的reads数与测到该位点的总reads数的比值，其数值从0到1不等。若该参数为0，代表所测到的reads都来自其中的一个亲本；该参数为1，代表所有reads都来自另一个亲本；该参数接近0.5，则代表此混池中SNP来自两个亲本的频率相同。将两个池观测到的SNP都计算出SNP-index，然后将两个池的SNP-index值相减后得到Δ(SNP-index)，将Δ(SNP-index)对应该SNP所在染色体位置作图，最后将辣椒CMS恢复性定位到染色体6末端一端长16.8M的区间(Chr06:199389022-216191732)。
(6)寻找该区间在SP与RP之间存在的差异SNP，并提取包含相应SNP、以及上下游序列各100bp共201bp的基因组序列，利用在线软件BatchPrimer3 V1.0(https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)设计KASP标记引物，最终对42个差异SNP成功设计KASP标记引物。
(7)对42对KASP标记引物在亲本间进行扩增检测，共检测到6对引物在亲本间存在差异SNP。以KASP标记KS23在亲本间的扩增为例，如附图1所示：恢复系父本R1的四次重复检测结果靠近X轴，并聚集为I类，基因型为G/G；不育系母本8A的四次重复检测结果靠近Y轴，并聚集为II类，基因型为A/A。
(8)利用在亲本间有多态性的6对KASP标记在F2群体中进行多态性验证，发现KS23能将F2群体各单株聚为三类，如附图2所示：靠近X轴的样本聚集为I类，为纯合可育基因型G/G；靠近Y轴的样本聚集为II类，为纯合不育基因型A/A；靠近X、Y对称轴位置的样本聚集为III类，为杂合可育基因型A/G。KS23在F2群体中的基因型检测结果与育性表型鉴定结果一致性较高，达82％。因此，KASP标记KS23可作为鉴定辣椒CMS恢复系的候选分子标记。
3、辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物的应用，包括如下步骤：
(1)选取96个农艺性状优良的辣椒高代自交系材料，在每个自交系中选取1个单株，利用基因组DNA提取试剂盒或CTAB法提取每个单株基因组DNA备用。
(2)同时，以CMS不育系8A为母本，分别以选取的96个辣椒自交系单株为父本，在花期进行测交试验，待杂交果实老熟后分别收获96份杂交组合种子。
(3)利用实施例2中的KS23标记引物对步骤(1)中提取的96份DNA样品进行扩增与荧光检测。PCR扩增体系为10μL,包括5μL 1030ngμL-1的DNA检测模板，0.14μL primermixture，2μL的2×KASP Master Mix(LGC Genomics,Shanghai,China)。
(4)PCR反应程序为:30℃读数60秒；94℃变性15分钟；94℃变性20秒，61℃-55℃(每个循环下降0.6℃)退火60秒，10个循环；94℃变性20秒，55℃退火60秒，26个循环；94℃变性20秒，57℃退火60秒，8个循环；30℃读数60秒。
(5)荧光参数设置时，Allele 1碱基设定为G，荧光Reporter设定为FAM；Allele 2碱基设定为A，荧光Reporter设定为VIC。
(6)运行程序，反应结束后后统计每个单株检测到的碱基类型(G或A),G/G为纯合恢复型，A/A为纯合不育保持型，G/A为杂合部分恢复型。
(7)种植步骤(2)中收获的96份杂交种子，开花结果期调查并统计每个测交组合的育性情况，不育或者可育(育性恢复)。
(8)通过比较步骤(6)中统计到的基因型与步骤(7)中统计的表型，一致性达69％，达到了分子标记筛选的目的。
有益效果：本发明的关键创新点是发掘了与辣椒CMS育性恢复相关的SNP，开发出一个可用于辣椒CMS恢复系筛选的KASP分子标记KS23。KS23包含2条分别长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2、以及一条长21bp的反向引物KS23C。利用KS23筛选辣椒CMS恢复系，只需根据实例三中的扩增体系和扩增程序，对待测植株DNA只进行一次PCR扩增，操作简单，无需进行CAPS标记的酶切反应和InDel标记复杂耗时的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接通过荧光定量PCR仪中荧光检测到的基因分型值和分布图，直接筛选出恢复基因型G/G和恢复系，检测效率达69％以上。
附图说明
图1辣椒CMS育性恢复筛选KASP标记荧光检测结果示意图。
图中样本根据其基因型分为I类和II类。I类的各样本分布靠近X轴，表示该SNP的基因型为G/G，为父本恢复型；II类的各样本分布靠近Y轴，表示该SNP的基因型为A/A，为母本不育型。
图2KS23在辣椒CMS系与恢复系杂交后代F2中的荧光检测结果示意图。
图中样本根据其基因型分为I类、II类和III类。I类的各样本分布靠近X轴，表示该SNP为纯合可育基因型G/G；II类的各样本分布靠近Y轴，表示该SNP为纯合不育基因型A/A；III类的各样本大致分布于X轴和Y轴的对称轴位置，表示该SNP为杂合可育基因型G/A；×表示未检测到相应SNP。
图3KS23在96份辣椒自交系上进行恢复系筛选的荧光检测结果图。
图中样本根据其基因型分为I类、II类和III类。I类的各样本分布靠近X轴，表示该SNP的基因型为G/G，为纯合恢复型；II类的各样本分布靠近Y轴，表示该SNP的基因型为A/A，为纯合不育保持型；III类的各样本大致分布于X轴和Y轴的对称轴位置，表示该SNP为G/A，为杂合部分恢复型。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物KS23，包括两条长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2，以及一条长21bp的反向引物KS23C。
KS23A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAATGAGGAAGATGGTAGTATTCATAAG
KS23A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAATGAGGAAGATGGTAGTATTCATAAAKS23C：AACAGAGGGAGAAGTGTGTCG
实施例2
本实施例提供辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物获取方法，包括如下步骤：
(1)利用不育系8A与恢复系R1(8A和R1均由甘肃省农业科学院蔬菜研究所选育)杂交，获得杂种一代F1，F1代植株自交得F2。
(2)对F2群体进行育性鉴定，最后选取30株完全不育单株和30株完全可育单株，分别构建不育池SP和恢复池RP。
(3)分别提取不育池SP和恢复池RP花蕾RNA，委托百迈克生物科技公司(http://www.biomarker.com.cn/)利用Illumina HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125。
(4)利用转录组数据在线比对软件STAR分别对SP和RP测序reads与辣椒参考基因组(The Pepper Genome Database 2.0)进行比对，并通过GATK(版本：3.1-1，https://www.broadinstitute.org/gatk/index.php)，查找单SNP位点。
(5)采用SNP-index法对不育池SP和恢复池RP进行SNP关联分析。SNP-index是通过混合池间的基因型频率差异进行标记关联分析的方法，SNP-index参数是指某个位点含有SNP的reads数与测到该位点的总reads数的比值，其数值从0到1不等。若该参数为0，代表所测到的reads都来自其中的一个亲本；该参数为1，代表所有reads都来自另一个亲本；该参数接近0.5，则代表此混池中SNP来自两个亲本的频率相同。将两个池观测到的SNP都计算出SNP-index，然后将两个池的SNP-index值相减后得到Δ(SNP-index)，将Δ(SNP-index)对应该SNP所在染色体位置作图，最后将辣椒CMS恢复性定位到染色体6末端一端长16.8M的区间(Chr06:199389022-216191732)。
(6)寻找该区间在SP与RP之间存在的差异SNP，并提取包含相应SNP、以及上下游序列各100bp共201bp的基因组序列，利用在线软件BatchPrimer3 V1.0(https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)设计KASP标记引物，最终对42个差异SNP成功设计KASP标记引物。
(7)对42对KASP标记引物在亲本间进行扩增检测，共检测到6对引物在亲本间存在差异SNP。以KASP标记KS23在亲本间的扩增为例，如附图1所示：恢复系父本R1的四次重复检测结果靠近X轴，并聚集为I类，基因型为G/G；不育系母本8A的四次重复检测结果靠近Y轴，并聚集为II类，基因型为A/A。
(8)利用在亲本间有多态性的6对KASP标记在F2群体中进行多态性验证，发现KS23能将F2群体各单株聚为三类，如附图2所示：靠近X轴的样本聚集为I类，为纯合可育基因型G/G；靠近Y轴的样本聚集为II类，为纯合不育基因型A/A；靠近X、Y对称轴位置的样本聚集为III类，为杂合可育基因型A/G。KS23在F2群体中的基因型检测结果与育性表型鉴定结果一致性较高，达82％。因此，KASP标记KS23可作为鉴定辣椒CMS恢复系的候选分子标记。
实施例3
本实施例提供辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物的应用，包括如下步骤：
(1)选取96个农艺性状优良的辣椒高代自交系材料，在每个自交系中选取1个单株，利用基因组DNA提取试剂盒或CTAB法提取每个单株基因组DNA备用。
(2)同时，以CMS不育系8A为母本，分别以选取的96个辣椒自交系单株为父本，在花期进行测交试验，待杂交果实老熟后分别收获96份杂交组合种子。
(3)利用实施例2中的KS23标记引物对步骤(1)中提取的96份DNA样品进行扩增与荧光检测。PCR扩增体系为10μL,包括5μL 1030ngμL-1的DNA检测模板，0.14μL primermixture，2μL的2×KASP Master Mix(LGC Genomics,Shanghai,China)。
(4)PCR反应程序为:30℃读数60秒；94℃变性15分钟；94℃变性20秒，61℃-55℃(每个循环下降0.6℃)退火60秒，10个循环；94℃变性20秒，55℃退火60秒，26个循环；94℃变性20秒，57℃退火60秒，8个循环；30℃读数60秒。
(5)荧光参数设置时，Allele 1碱基设定为G，荧光Reporter设定为FAM；Allele 2碱基设定为A，荧光Reporter设定为VIC。
(6)运行程序，反应结束后后统计每个单株检测到的碱基类型(G或A),G/G为纯合恢复型，A/A为纯合不育保持型,G/A为杂合部分恢复型。
(7)种植步骤(2)中收获的96份杂交种子，开花结果期调查并统计每个测交组合的育性情况，不育或者可育(育性恢复)。
(8)通过比较步骤(6)中统计到的基因型与步骤(7)中统计的表型，一致性达69％，达到了分子标记筛选的目的。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
<110> 甘肃农业大学
<120> 辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用
<160>3
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<212> DNA
<213> 辣椒
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<213> 辣椒
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<213> 辣椒
<400> 3
AACAGAGGGAGAAGTGTGTCG

Claims (1)

1.辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物KS23，其特征在于，所述标记引物KS23包括两条长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2，以及一条长21bp的反向引物KS23C，KS23A1如序列表SEQID NO：1所示，KS23A2如序列表SEQ ID NO：2所示，KS23C如序列表SEQ ID NO：3所示。
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De novo assembly of the pepper transcriptome (Capsicum annuum): a benchmark for in silico discovery of SNPs, SSRs and candidate genes;Ashrafi H等;《BMC Genomics》;20121030;第13卷;文献号571 *
Fine mapping of the male fertility restoration gene CaRf032 in Capsicum annuum L;Zhenghai Zhang等;《Theor Appl Genet》;20200430;第133卷(第4期);第1177-1187页 *
Genome-wide Identification of Chile Pepper Pentatricopeptide Repeat Domains Provides Insight into Fertility Restoration;Derek W Barchenger等;《Journal of the American Society for Horticultural Science》;20181130;第143卷(第6期);第418-429页 *
一个辣椒胞质雄性不育SCAR标记的KASP转化及其应用;张强等;《华北农学报》;20191031;第34卷(第5期);第93-98页 *
辣椒胞质雄性不育育性恢复的遗传与候选基因鉴定;魏兵强;《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》;20171115(第11期);D048-7 *

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