CN102676515B - 长穗偃麦草基因组特异分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，具体为根据NCBI公布的18srRNA基因的核苷酸序列，在两个RsaⅠ位点间序列设计引物，运用抑制消减杂交技术去除两个基因组DNA之间的同源序列,富集差异序列，获得长穗偃麦草特异的DNA片段并进行测序,依据与小麦无同源性的序列重新设计引物而获得长穗偃麦草基因组特异的分子标记36个。这些标记可用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定,可用于抗赤霉病基因的连锁分析,可作为特异分子标记鉴定长穗偃麦草染色质而用于小麦抗赤霉病和抗逆性育种中。

Description

长穗偃麦草基因组特异分子标记及其应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及长穗偃麦草基因组特异分子标记及其应用。

背景技术

1、小麦育种目标和其野生近缘种

小麦是世界上种植面积最大、总产量仅次于玉米的粮食作物。近半个世纪来，世界小麦的总产量已经增加了两倍多，其中，优良的小麦品种对提高小麦产量发挥了决定性的作用。目前小麦育种研究主要集中在四个方面：提高小麦产量，降低生产成本；分子标记辅助育种；小麦抗逆性育种；小麦营养品质(何中虎等,2006)。为完成以上育种目标,小麦本身的遗传资源已经明显不够,而与小麦具有近缘关系的许多野生物种中却存在着大量小麦中所没有的有利遗传资源。因此,利用小麦近缘野生种中的优良基因资源培育小麦新品种已经成为小麦育种的目标之一。

普通小麦(AABBDD,2n=42)是异源六倍体植物，属于禾本科小麦属普通小麦种(Triticum aestivum L.)，与小麦属关系比较近的属有大麦属(Hordeum)、披碱草属(Elymus)、蝟草属(Asperella)、细坦麦属(Sitanion)、新麦草属(Psathyrostachys)、棱轴草属(Crithopsis)、带芒草属(Taeniatherum)、冰草属(Agropyron)、簇毛麦属(Haynaldia)、黑麦属(Secale)、异形花属(Heteranthelium)、无芒草属(Henrardia)、旱麦草属(Eremopyrum)、山羊草属(Aegilops)。这些野生近缘种植物中蕴含着大量优良基因，是一个巨大的具有潜在利用价值的遗传基因库。该基因库的优良基因如得到利用,对小麦遗传改良将具有重要的价值，不仅能提高其产量、改良品质，更能将丰富的抗病、抗逆基因转入小麦中，改良小麦的抗病性和抗逆性。目前已经与小麦进行杂交的种属有黑麦属(Sando et al,1953)、簇毛麦属(Sears et al,1953;Hyde et al,1953)、偃麦草属(Dvorák et al,1974)、山羊草属(Sears et al,1956;Chapmna et al,1970)、大麦属(Kruse et al,1973;Islam et al,1975)等。这些远缘杂交的成功为近缘野生种的抗旱、耐盐碱以及抗病虫害的优良基因向小麦基因组进行转移奠定了坚实的基础，使得从小麦近缘种属中寻找或开拓新的重要基因资源成为可能。随着现代分子生物学的发展，分子标记与作物育种相结合，它不仅弥补了作物育种中传统的选择准确率低的缺点，而且加快了育种进程。

2、小麦的赤霉病抗性

小麦生产中倍受关注的病害为小麦赤霉病（Fusarium head blight,FHB）,它是全球性致使小麦产量降低和品质下降的主要病害之一，也是影响中国小麦生产的主要病害(陆维忠等,2001)。赤霉病大流行年份病穗率达50％～100％，减产高达10％～40％（姚金保等，2000）。该病由多种镰刀菌引起,病原菌侵染小麦籽粒后产生多种真菌毒素，这些毒素对人畜有害(Bottalico et al,1998),特别是其中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素，在50mg/kg的浓度下，就可以抑制人类T细胞80%的活性，严重威胁着人类和家畜的健康(宋凤英等,2005)。我国长江中下游冬麦区是小麦赤霉病的多发区和重灾区,近年来黄淮麦区和关中麦区小麦赤霉病发生也日趋严重，影响着国内小麦主产区的粮食安全。随着全球性气候变暖和玉米-小麦轮作制度的增加，近10多年来小麦赤霉病在北美和欧洲也大面积发生，造成严重的产量和经济损失(Bai et al,2004)。因此，国内外很多学者都围绕小麦赤霉病开展了广泛的研究工作。我国从上世纪70年代中期开始对小麦赤霉病进行研究，研究结果认为小麦赤霉病抗性具有遗传基础,并且培育出一批抗性较强的优质高产小麦新品种，其中苏麦3号目前已成为全世界公认的赤霉病高抗品种(姚金宝等,2000)。

多年的小麦抗赤霉病育种研究表明,小麦种内抗赤霉病的资源很少,而且已经发现的抗性资源在小麦育种实际中也难以有效利用。从小麦近缘物种中开拓新的赤霉病抗源是小麦抗赤霉病育种中的重要策略，并且进行了大量的相关研究。如小麦赤霉病抗源，现已成功地进行了小麦与大赖草(Leymus racemosus)、长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)、中间偃麦草(L.intermedium)、黑麦(Secale cereale)、簇毛麦(Haynaldia villosa)等多种近缘物种的杂交，并获得了一些具有赤霉病抗性的材料（Oliver R.E,et al.，2005）。

3、长穗偃麦草赤霉病抗性及特异分子标记发展

偃麦草属(Thinopyrum)是禾本科大麦族(Horseae)，小麦亚族(Triticeae)中的多年生草本植物，与普通小麦的亲缘关系较近，世界范围内约有50种，主要分布在温带和寒带地区。该属适应性和繁殖能力较强，并且具有许多优良基因和性状，如抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱和穗大多花等，是小麦遗传改良中极具应用价值的小麦近缘物种之一。自然界中存在3种类型的长穗偃麦草，即二倍体长穗偃麦草(Th.elongatum,2n=14)、四倍体长穗偃麦草(Th.elongatum,2n=28)和十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum,2n=70)。二倍体长穗偃麦草具有E染色体组,E染色体组是偃麦草属多倍体物种的基本染色体组(Dewey et al,1984)。一整套中国春-长穗偃麦草二体异附加系、代换系的获得为深入研究长穗偃麦草奠定了很好的基础（Dvorák J,et al.，1974）。有研究表明在长穗偃麦草的1E（刘登才等,2001；Jauhar PP,et al.，2009）、7E（Somers DJ,et al.，2003；Shen X R,et al.，2004；徐国辉等,2009；Zhang X L,et al.，2011）染色体可能具有良好的赤霉病抗性基因，因此，长穗偃麦草已成为改良普通小麦遗传基础、提高赤霉病抗性的重要野生近缘物种之一（王黎明等，2005）。

目前小麦赤霉病的鉴定方法主要有自然诱发感病、室内人工离体接种鉴定、田间人工接种鉴定等，但对于赤霉病抗性的鉴定，研究者使用的方法和表示参数各不相同,而且抗性鉴定结果受环境条件的影响比较大,建立稳定可靠的赤霉病接种方法和鉴定标准是评价品种抗病性最关键的问题。为了使抗性鉴定更加准确,研究者将目标转移到分子标记。分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection,MAS)是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段(Ribaut et al,1998)。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离的分子标记对选择个体进行目标以及全基因组筛选,从而减少连锁累赘,获得期望的个体,达到提高育种效率的目的。分子标记辅助选择是分子标记技术用于作物改良的重要领域,是传统育种技术和现代生物技术相结合的产物。随着20世纪80年代中后期PCR技术的诞生和人类基因组计划及之后的水稻等多种作物基因组计划的相继推动下,分子标记辅助选择技术的研究和应用得到迅速发展。通常,目前所指的分子标记就是DNA标记,在不同植物中利用不同的方法发展分子标记用于研究已经成为重要的遗传研究内容。

赤霉病抗性比较复杂，人工鉴定结果受环境的影响较大，因此利用分子标记进行辅助选择将是有效途径。在长穗偃麦草向小麦转移优良的抗赤霉病基因的研究中,已有部分研究进行了长穗偃麦草染色体特异分子标记研究.长穗偃麦草1E和3E染色体的3个特异的RAPD标记OPE-05₁₃₀₀、OPF-03₇₀₀和OPF-15₄₀₀，可以用来快速鉴定1E和3E染色体(刘树兵等,1998)。利用SSR分子标记技术，建立了一个偃麦草E染色体组特异的微卫星分子标记，该标记也可以作为E染色体的特异SSR标记(尤明山等,2003)。Shen等(2004)通过分布在第7连锁群的52对SSR引物进行特异扩增，发现5对引物在7E上表现出特异性。陈国跃等(2007)利用已知植物抗病基因编码氨基酸保守区域设计了简并引物，应用RGAP分子标记技术构建了一套完整的长穗偃麦草1E～7E染色体的特异RGAP标记。张丽等(2008)利用AFLP引物筛选出28个长穗偃麦草E组染色体特异分子标记，并将其中5个转化为STS标记，可用于小麦背景中长穗偃麦草遗传物质的检测。然而,以上发展的长穗偃麦草染色体特异分子标记不但数量少,远远满足不了小麦抗性育种实际的需要,而且染色体特异性及稳定性还不理想,发展更多的覆盖相关染色体的分子标记,进一步研究这些分子标记与抗病,抗逆基因的连锁关系,在小麦抗逆,抗病育种实际中利用这些标记进行辅助选择是非常重要和迫切需要的。

4、分子标记技术的发展

4.1基于分子杂交技术的分子标记

限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，用作腺病毒温度敏感突变的遗传标记(Grodzicker et al,1974)，它是一种以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记。利用特定的限制性内切酶切割不同的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，通过凝胶电泳分离出不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。

4.2基于PCR技术的分子标记

4.2.1随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD)1990年由Williams等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法(Williams et al,1990)。它利用随机引物(一般为8~10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。但是RAPD受反应条件影响较大，因而其检测的重复性较差。

4.2.2序列标签位点(Sequence Tagged Sites,STS)1989年Olson等提出，是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。

4.2.3简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)也称微卫星DNA(Tautz et al,1989;Love et al,1990)，是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复序列，其中最常见是双核苷酸重复和三核苷酸重复，如(CA)_n、(AT)_n、(TG)_n、(GGC)_n、(GAT)_n等。每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目一般为10~60，它们广泛分布于绝大多数真核生物基因组中，其高度多态性主要来源于串联重复数目的不同。微卫星序列两侧一般是相对保守的单拷贝序列，根据保守序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定多态性。SSR标记一般检测到的是单一的多等位基因位点，而且呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子。但是，传统的SSR分子标记开发方法工作量大,需花费大量人力、物力,而且效率较低。

4.2.4简单重复序列间区(inter-simple sequence repeat,ISSR)Zietkeiwitcz等于1994年提出的一种以微卫星为基础的分子标记，它检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。由于SSR序列广泛分布于高等生物的基因组中，所以ISSR具有很强的多态性。目前，ISSR标记已广泛应用于多种植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究中,但在长穗偃麦草中没有进行研究.

4.2.5反转座子位点间扩增多态性(inter-retrotransposon amplified polymorphism,IRAP)其原理是根据反转录转座子中LTR的保守序列设计引物，这些引物在PCR过程中可以与LTR序列退火，从而扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段。也可以根据反转录酶基因的相对保守序列设计引物进行扩增(Kalendar et al.1999)。目前，IRAP分子标记技术已应用于大麦(Kalendar et al,1999;Kalendar et al,2000;Leighet al,2003)、柑橘(Bretóet al,2001)、网茅(Yannic et al,2004)、马铃薯等植物的遗传研究中。

4.2.7反转座子微卫星扩增多态性(retrotransposon microsatellite amplified polymorphism,REMAP)一种基于反转录转座子的标记技术(Kalendar et al,1999)。REMAP技术原理是根据反转录转座子的LTR保守序列和微卫星序列设计引物，然后进行PCR，扩增出反转录转座子与邻近的微卫星间的片段，从而检测出反转录转座子与邻近简单重复序列之间的多态性。

4.3基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记

扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DN A多态性的新方法(Zbaeau et al,1993)。AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，先利用限制性内切酶将基因组DNA切割成不同大小的DNA片段，再使双链人工接头与酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1~3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。随着技术的不断完善和发展,AFLP技术已广泛应用于植物种质鉴定(Thomas et al,1995)、遗传图谱构建(Margues et al,1998)、目的基因定位及遗传多态性检测(Pakniyat et al,1997)等方面。

4.4基于DNA芯片技术的分子标记

4.4.1单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)Lander于1996年提出的第三代DNA遗传标记，是指在基因组水平上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性,其多态性频率大于1%。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测。

4.4.2多样性微阵列技术(Diversity arrays technology,DArT)Jaccoud等(2001)开发了一种新的分子标记技术多样性微阵列技术(Diversity arrays technology,DArT),并成功应用于水稻研究中。DArT技术是依赖芯片杂交的方法来区分基因组中座位多态性的差异。将待检测的不同样本的基因组DNA等量混合后经相关限制性内切酶处理，根据电泳结果选择回收不同大小DNA片段及一系列DNA操作而达到基因组复杂性减少，该部分DNA即为基因组代表(Genomic representation)，并通过相关过程将该部分DNA固定到玻片上形成点阵列的芯片。以不同样本单独经同样内切酶处理所获的基因组代表为探针，并组成相应的探针组合对芯片进行杂交，由于不同样本的基因组DNA序列有差异，因而与芯片上同一点序列杂交的效率不一致，芯片上只有与探针DNA互补的点才具有杂交信号，通过扫描仪可识辨不同颜色杂交信号的强弱或有无来确定待检测样本的遗传差别。DArT技术已在大麦、拟南芥、小麦和高梁等植物中得到应用。

发明内容

本发明利用运用抑制消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术（Diachenko L,et al.，1996）去除实验组（二倍体长穗偃麦草）及对照组（普通小麦中国春）两个基因组DNA之间的同源序列,富集差异序列，获得长穗偃麦草特异的DNA片段，并根据特异片段发展长穗偃麦草基因组特异分子标记，这些特异标记可跟踪长穗偃麦草的染色体或染色质,可用于抗赤霉病基因的连锁分析,可用于分子标记辅助选择,从而提高小麦抗赤霉病和抗逆性育种的效率。

本发明利用SSH技术，获得长穗偃麦草基因组特异的分子标记36个；所述的长穗偃麦草基因组特异分子标记，它是下列36对引物之一：

第1对：MEG-1₃₀₃

L:5’-TGGATGGTGGCTGCTGAT-3’

R:5’-CCGTTATGCTGCCCGATT-3’

第2对：MEG-1₂₅₈

L:5’-ACCAGCGGTAGCCCAGTCT-3’

R:5’-ATCTGTGCGATTTCCCTA-3’

第3对：MEG-1₂₅₃

L:5’-CCAGCGGTAACCCAGTCT-3’

R:5’-AGTGCGATTTCCCTGACG-3’

第4对：MEG-1₂₁₁

L:5’-GCTCATCAACAGCCTACC-3’

R:5’-TGTGACTTTCCCACCATT-3’

第5对：MEG-1₂₄₂

L:5’-GAAAGGCTCCGAGAACAC-3’

R:5’-GTCAAAGGCTTAGCAATC-3’

第6对：MEG-1₁₇₇

L:5’-TTGGGCTCAAGAACATTA-3’

R:5’-GGCAGGTACGACACCTAT-3’

第7对：MEG-2₃₀₁

L:5’-TTGGGCTCAAGAACATTA-3’

R:5’-TGGAACGGATGAAGACCC-3’

第8对：MEG-2₂₄₉

L:5’-GCCGACTCAGGAGGTGTT-3’

R:5’-TTGCATCCGTTGGTATTG-3’

第9对：MEG-2₃₀₄

L:5’-TGTCCCACCATTGAGCAG-3’

R:5’-CCGGGCAGGTTAGACTATA-3’

第10对：MEG-2₂₃₇

L:5’-CAGTGGCTTGTCAGAGTT-3’

R:5’-CGTAGCAGGATGGTTAGA-3’

第11对：MEG-2₄₂₂

L:5’-GCTTGCGTCATCTCCTTC-3’

R:5’-TGATATGCCACTTCTCCTC-3’

第12对：MEG-2₄₀₇

L:5’-TTAGTTAGGCAGTAGAGCA-3’

R:5’-CGACAAAGTAAGGTGGTG-3’

第13对：MEG-2₃₇₁

L:5’-TGGGTAATGCCCGTCCTC-3’

R：5’-TCTGAATGTTTCCGCTTGT-3’

第14对：MEG-3₂₅₈

L:5’-ATAGGGTTGCCAGTGAGGAG-3’

R:5’-GATTCATCATTTCCCATAGAG-3’

第15对：MEG-3₂₇₃

L:5’-TTTACAAGGTGAAGGTCT-3’

R:5’-CATTGCGGACTATGATTT-3’

第16对：MEG-3₂₃₆

L:5’-AGTGGCTTGTCAGAGTTG-3’

R:5’-CGTAGCAGGATGGTTAGA-3’

第17对：MEG-3₂₃₉

L:5’-TGCGATTTCCCTGTCATT-3’

R:5’-TCCCAGCCAGATCAAGAG-3’

第18对：MEG-3₂₅₄

L:5’-ATCTGTGCGATTTCCCTG-3’

R:5’-GCGGTAGCCAAGTCTGGT-3’

第19对：MEG-3₂₅₃

L:5’-CCAGCGGTAACCCAGTCT-3’

R:5’-AGTGCGATTTCCCTGACG-3’

第20对：MEG-3₂₉₃

L:5’-TGTTCACTCAGCCATCTC-3’

R:5’-ATCAACTTCAGCATCTTTA-3’

第21对：MEG-3₂₆₇

L:5’-AGGGGCAACAAGGATAAG-3’

R:5’-TACACTACCGACGAGCAG-3’

第22对：MEG-3₃₆₇

L:5’-ATGAGCCCAGTTGAGTTGTTT-3’

R:5’-TACTATGGTTGACCACCTAAAGAG-3’

第23对：MEG-3₂₁₁

L:5’-GCTCATCAACAGCCTACC-3’

R:5’-TGTGACTTTCCCACCATT-3’

第24对：MEG-4₂₆₅

L:5’-TAACGCCGACACTTAGGA-3’

R:5’-GGAAACCCAGGGACATCA-3’

第25对：MEG-4₂₅₃

L:5’-CCTTGTGAGCCCAGTTAT-3’

R:5’-GCAGGTTCTTCCACCATTA-3’

第26对：MEG-4₂₆₈

L:5’-GCTTGCGTCATCTCCTTC-3’

R:5’-TTCGGTCATAGTTGCTCTTC-3’

第27对：MEG-4₂₈₀

L:5’-CCGTCTGTTACTCCATCG-3’

R:5’-CTCTGAAGCGGCGTCTGC-3’

第28对：MEG-4₃₅₃

L:5’-CCTTGTGAGCCCAGTTAT-3’

R:5’-GCAGGTTCTTCCACCATTA-3’

第29对：MEG-4₄₈₃

L:5’-ATCCCAATCTCAAATCAAG-3’

R:5’-TCAAATACTCAGCACGAAT-3’

第30对：MEG-5₃₅₀

L:5’-CCCCAGGCAGAGGAACTA-3’

R:5’-CCCGGGCAGGTACATCTC-3’

第31对：MEG-5₃₈₅

L:5’-CAATCTCGGAGCCATCAT-3’

R:5’-GGCCAGGTTCACATAAGG-3’

第32对：MEG-5₂₆₀

L:5’-CATCTTCAGCGGTCTTGC-3’

R:5’-CGAGCGTGTTGGGTAAGT-3’

第33对：MEG-5₃₇₇

L:5’-AAGTCAAGGCTGTCCCATA-3’

R:5’-ACTTTTCCCATGCTCACA-3’

第34对：MEG-5₂₅₄

L:5’-ATTGAGCCTGCCGTAGAG-3’

R:5’-GTCATTGAGCGTATCCTGTT-3’

第35对：MEG-5₄₅₆

L:5’-TCGCTGTCGTGCTTATCT-3’

R:5’-TGTATTTGGTGTTCCCTCC-3’

第36对：MEG-5₃₃₃

L:5’-TTTGTGACGAAGAGGAGCAT-3’

R:5’-GCCCGTAGACAGGAGAAGT-3’。

本发明还公开了上述长穗偃麦草基因组特异分子标记在小麦抗赤霉病基因的连锁分析中的应用。

本发明所获长穗偃麦草染色体特异标记在不同材料和不同世代间表现稳定,可用于小麦背景中长穗偃麦草染色质的鉴定,可用于抗性基因的连锁分析,也可作为特异分子标记用于小麦抗赤霉病育种中进行辅助选择。由此本发明还公开了所述长穗偃麦草基因组特异分子标记用于分子标记辅助选择,在提高小麦抗赤霉病和抗逆性育种的应用。

本发明所采用的分子标记发展技术在其他植物中已经应用,但在长穗偃麦草中没有应用,本发明所获长穗偃麦草基因组特异分子标记来自植物本身，对环境影响较小。并且这些标记可用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定,可用于抗赤霉病基因的连锁分析,可作为特异分子标记鉴定长穗偃麦草染色质而用于小麦抗赤霉病和抗逆性育种中。本发明的分子标记重复性好，扩增稳定，操作简便，成本低廉，为SSH技术在植物领域的应用提供了成功案例。

附图说明

图1：酶切片段与接头的连接效率

1、3：PCR primer 1和18s-254F；2、4：18s-254F和18s-254R。

图2两轮PCR的扩增片段

1:消减后第一轮PCR（PCRprimer 1）；2:未消减第一轮PCR（PCRprimer 1）；3:消减后第二轮PCR(Nest primer1和2)；4:未消减第二轮PCR(Nest primer 1和2)。

图3消减杂交的效率检测

1～5：消减后2轮PCR产物；6～10：未消减2轮PCR产物.1、6：18循环；2、7：23循环；3、8：28循环；4、9：33循环；5、10：38循环。

图4消减文库的克隆

1～14：不同的克隆。

图5基因组特异分子标记在不同材料中的扩增（引物MEG-2₃₀₁）

1：DA1E;2:DA2E;3:DA3E4:DA4E5:DA5E;6:DA6E;7:DA7E;8:EE;9:CS;10:Y158;11:Y16;12:N13;13:0425;14:Y14。

图6：长穗偃麦草染色体特异标记的稳定性

1～2：DS3E(3D)×安农8455的F1代；3～20：Y16×DS3E(3A)的F2代。

图7：长穗偃麦草染色体特异标记的稳定性

1～2：Y16×DS7E(7A)的F1代；3～20：Y16×DS7E(7A)的F3代。

具体实施方式

实施例1实验材料和PCR引物序列

(1)实验材料

普通小麦中国春（CS），二倍体长穗偃麦草（EE)，中国春-长穗偃麦草二体附加系：DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E、DA7E（以上材料由加拿大农业部的Dr.Fedax惠赠，材料原始文献为《Disomicand ditelosomic additions of diploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum》）；扬麦158（Y158，由江苏省里下河地区农科所利用扬麦4号/ST1472／506育成，品种登记号为GS02001-1997），扬麦16(Y16，即扬0-126是江苏里下河地区农科所用扬91F138和扬90-30杂交育成)，宁麦13(N13，即宁0078，国审麦2006004,由江苏省农科院粮食作物研究所从宁麦9号系选育)，扬麦14(Y14，即扬0-139，江苏里下河农科所用扬麦158和扬麦6号杂交育成)，上述材料有江苏省里下河农科所提供，均有市售；安农8455（An8455，可从安徽华韵生物科技有限公司购买）。

（2）引物设计

根据NCBI公布的18s rRNA基因的核苷酸序列（GenBank：HQ870412.1），在两个Rsa Ⅰ位点间序列设计引物，18s-254F：GCTCTGGATACATTAGCATG GGATA（SEQ ID No.1）；18s-254R：

TCGGCATCGTTTATGGTTGAG（SEQ ID No.2）。其扩增片段长度为254bp，引物18s-254F和18s-254R所扩增片段可在构建文库时检测连接效率和消减效率。依据试剂盒（PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit，Clontech公司）中提供的接头1(adaptor 1)和接头2R(adaptor 2R)序列设计以下三个引物。PCRprimer 1：CTAATACGACTCACTATAGGGC（SEQ ID No.3）；Nest primer 1：TCGAGCGGCCGCCCGGG CAGGT（SEQID No.4）；Nest primer 2：AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT（SEQ ID No.5）。

实施例2基因组DNA的提取

供试材料生长至两叶一心期，以SDS法提取基因组DNA。其步骤如下：

(1)取幼嫩叶片(约0.1g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用研磨棒碾碎至粉末状；

(2)离心管放置于室温稍冷却，加入700μl的缓冲液A，轻轻混匀，然后65℃水浴20min，期间每隔5min上下颠倒混匀一次；

缓冲液A：NaCl             29.2g

         1M Tris-HCl      100ml

         EDTA             18.6g

         SDS              15g

ddH2O定容至1L灭菌后用。

(3)取出稍冷却至室温，加入苯酚和氯仿各350μl，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(4)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中；

(5)加入约750μl氯仿，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(6)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中；

(7)加入约560μl异丙醇，轻慢混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀；

(8)12000rpm，离心10min，弃去上清液；

(9)加500μl 70%的乙醇溶液洗涤两次，每次2-3min.室温晾干；

(10)晾干的DNA溶解于20μl TER中，37℃温浴45min.-20℃保存备用。

实施例3抑制消减杂交文库的构建

利用抑制消减杂交（SSH）技术构建杂交文库，具体步骤如下：

(1)DNA酶切和连接及效率检测。通过Rsa Ⅰ酶(Clontech公司)对长穗偃麦草、中国春的DNA进行酶切，酶切反应总体积50μL，37℃孵育24h，中间补加一次Rsa Ⅰ1.5μL。长穗偃麦草的酶切产物分别与接头1、接头2R进行连接。连接反应后对连接产物进行连接效率检查，连接产物进行2轮杂交、2轮PCR扩增，相关操作按PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit说明进行。长穗偃麦草和中国春基因组DNA经RsaⅠ酶切后的电泳结果显示未消化的基因组DNA位于凝胶加样孔的顶端，表明提取的基因组DNA没有发生降解，质量较好。而消化后的基因组DNA则表现为小于2500bp弥散的片段,酶切后DNA片段集中在200bp-2000bp，和预期结果一致。将酶切后的实验组DNA片段与接头1和接头2R进行连接后得到实验组-1和实验组-2。以18s rRNA作为参照基因，利用18s rRNA基因特异性引物18s-254F和18s-254R，在长穗偃麦草和中国春中扩增出长度为254bp的片段，而具有接头的片段利用PCRprimer 1和18s-254F可扩增出850bp左右的片段，2种长度片段的亮度比较就可反映连接效率。以实验组-1和实验组-2为模板，用引物18s-254F和PCR primer 1获得850bp左右的片段，表明连接成功。该产物的亮度相当于18s-254F和18s-254R扩增所得产物的亮度的1/4，这表明酶切产物与接头的连接效率满足要求（图1）。

(2)消减杂交。第一轮消减杂交是将具有接头1和接头2R连接的长穗偃麦草Rsa Ⅰ酶切基因组DNA分别与中国春Rsa Ⅰ酶切基因组DNA（100ng μL-1）混合，杂交完成后立即进入第二轮。在PCR管中加入变性后的中国春Rsa Ⅰ酶切基因组DNA和第一轮杂交产物，68℃维持24h，加入200μL稀释液，然后68℃7min终止非特异性杂交，杂交产物贮存于-20℃保存。

(3)抑制性PCR扩增。取稀释后的第二轮消减杂交产物、未消减杂交对照DNA加至无菌PCR管中进行第一轮抑制性PCR。第一轮PCR首先在72℃作用5min以补平接头，立即进行如下循环：94℃,2min；94℃40s，66℃40s,72℃1.5min，28个循环；72℃5min。取第一轮PCR产物稀释10倍后作为第二轮PCR的模板。反应体系中除Nest 1primer和Nest 2primer(10μM)替换PCR primer 1外，其他成分相同。第二轮PCR程序：94℃2min；94℃45s，68℃45s，72℃1.5min，15个循环；72℃5min。2%的琼脂糖电泳检测。其余样品储存于-20℃。以长穗偃麦草和中国春基因组DNA经消减杂交的产物和未经消减杂交的产物为模板分别进行PCR，PCR产物呈现连续的弥散型条带（图2）。由图可见消减产物主要分布在150bp～2000bp的范围内，与酶切产物的片段大小相近。经过消减杂交的模板在弥散的条带中有一些较集中的条带，应为实验组中特有的差异片段。经第二轮PCR扩增，其产物浓度高于第一轮PCR。说明经过二次PCR使得差异片段特异性扩增，从而得到富集。

(4)消减杂交效率。取稀释10倍后的消减杂交与未消减杂交对照的二轮PCR产物，加入引物18s-254F和18s-254R进行PCR。PCR程序：94℃45s，58℃40s，72℃1min，12循环结束后从每管取出5μL PCR产物，剩余的样品继续进行4个循环后再分别取出5μL PCR产物。每4个循环重复一次，直至28个循环结束。以2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR结果（图3）。从图中可以看出，未消减组在18个循环即出现254bp的特异性条带，而消减组在23个循环才表现254bp的特异性条带，说明消减效率较高。

(5)消减片段的连接反应。将经过消减后的第二轮PCR产物与pMD18/19-T载体(TaKaRa，Code:D102A)连接。连接产物转化感受态大肠杆菌(E.coli)，蓝白斑筛选构建抑制消减杂交文库。

实施例4感受态大肠杆菌的制备和转化

氯化钙法制备感受态细胞(Bio Basic,No.BS525)

(1)取少量冻存菌株大肠杆菌(E.coli)DH5α，在LB平板培养基上进行划线培养，恒温培养箱(37℃)中培养16～20h。

(2)挑取一个单菌落，接种于含2ml SOB培养液中，恒温摇床(37℃,250rpm/min)上培养12～16h。

(3)接种1ml的培养物到500ml锥形瓶中(内含100ml SOC培养液)，恒温摇床(37℃,250rpm/min)上培养至OD₆₀₀≈0.35。

(4)迅速将培养物置于冰浴中20min，期间缓慢摇匀使内容物充分均匀冷却。同时将2个50ml离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。

(5)将细菌转移至预冷的离心管中，4℃，4000rpm离心15min，弃去上清。

(6)用16ml的溶液A小心的悬浮细菌，冰上放置15min。

(7)4℃，4000rpm离心15min，收集菌体。

(8)用4ml溶液B重新悬浮细菌，分装，80μl/管，液氮速冻，-70℃保存。

(9)用于转化时，将100pg到10ng DNA加到感受态细胞(冰上溶解)中。

(10)细胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37℃培养5min或42℃培养90s，然后再次冰上放置2min。

(11)加入1ml SOC培养基，37℃温和摇动培养1h。

(12)在选择性培养基上涂布培养细胞，恒温培养箱(37℃)中培养12～16h。

实施例5菌落PCR与测序

将菌种接种到固体LB培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行菌落PCR。在96孔培养板孔中加入含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基30μl/孔，用灭菌枪头从转化平板上挑取一个白色菌落，在培养液中轻轻吹打几下，确保枪头上的菌体吹入培养液中，将培养板置于37℃培养箱30min。配制PCR反应母液，在另一块96孔板中，顺序加入预先准备的菌落液0.5μl和PCR反应母液9.5μl，将PCR板混匀离心后进行反应。最后PCR产物用2%的琼脂糖电泳检测。根据菌落PCR的结果，选择适合大小的阳性克隆进行测序。PCR具体反应体系及反应程序见表1和表2。

表1菌落PCR反应体系

表2菌落PCR反应程序

实施例6长穗偃麦草基因组特异分子标记的建立

通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落构建抑制消减文库。图4为部分菌落PCR结果，插入片段大小不等，片段大小范围为150～2000bp。先后随机挑取55个插入片段在400bp以上的克隆进行测序。依据测序结果并进行网上比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov），去除80%以上区段与小麦同源性大于80%的8条序列，以80%以下区段与小麦具有不同程度同源性的47条序列设计了52对引物。对7个附加系、EE、CS、Y158、Y16、N13、0425和Y14进行PCR，成功获得了36个长穗偃麦草基因组特异分子标记（表3），以测序的克隆计算成功效率为65.45%，以设计的引物计算，成功效率为69.23%。在36对长穗偃麦草基因组特异分子标记的引物中，能特异扩增长穗偃麦草的7条E染色体有27对（图5），能特异扩增6条E染色体为4对，能特异扩增1条、2条、3条、4条、5条E染色体的引物各1对。

表3长穗偃麦草基因组特异分子标记的引物序列

实施例7长穗偃麦草基因组特异分子标记的稳定性检测

获得的基因组特异分子标记是否稳定对其应用非常重要，通过利用相同引物对含有E组染色体的不同小麦背景和不同世代的材料进行PCR，如能扩增出相应的特异条带，就说明我们所发展的长穗偃麦草基因组特异分子标记是稳定的。可以跟踪E组染色体。以长穗偃麦草代换系DS3E(3D)与安农8455进行杂交，代换系DS3E(3A)与扬麦16，代换系DS7E(7A)与扬麦16进行杂交，选择引物MEG-1₃₀₃对上述杂交F1、F2、F3代进行扩增。从图6结果可以看出，所得扩增标记和预期条带大小一致，F1均表现，F2分离比约为3：1，表明3E染色体的存在，在不同小麦背景杂交后代中3E染色体也同样稳定存在。相同分子标记在同一杂交组合的不同世代中可以稳定遗传，图7表明7E染色体的存在，图中的F3单株是来自F2的一个单株，利用标记可以甄别2条7E染色体的个体。

Claims (1)

1.一种用于扩增长穗偃麦草基因组特异分子标记的特异性引物MEG-1₃₀₃，

L: 5’-TGGATGGTGGCTGCTGAT-3’

R: 5’-CCGTTATGCTGCCCGATT-3’。

Images