CN104109666A - 小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用。本发明根据植物EST序列信息设计引物，利用PCR技术从小麦-长穗偃麦草附加系中扩增得到长穗偃麦草的特异DNA片段并进行测序，依据与小麦无同源性的序列重新设计引物而获得长穗偃麦草染色体特异的分子标记。这些标记可用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定，可用于抗赤霉病基因的连锁分析，可作为特异分子标记鉴定长穗偃麦草染色质而用于小麦抗赤霉病和抗逆性育种中。本发明克服了通过RAPD，AFLP，SSR等分子标记发展技术获得了部分染色体特异标记，但发展的长穗偃麦草染色体特异分子标记不但数量少，远远满足不了小麦抗性育种实际的需要，而且染色体特异性及稳定性还不理想的缺陷。

Description

小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，特别涉及小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用。

背景技术

(1)小麦育种目标和其野生近缘种

小麦是世界总产量仅次于玉米的第二粮食作物。近半个世纪来，世界小麦的总产量已经增加了两倍多，其中，优良的小麦品种对提高小麦产量发挥了决定性的作用。

自然界中生长许多小麦的野生近缘物种，这些野生近缘物种植物中蕴含着大量优良基因，是一个巨大的具有潜在利用价值的遗传基因库，该基因库的优良基因如得到利用，对小麦遗传改良将具有重要的价值，不仅能提高其产量、改良品质，更能将丰富的抗病，抗逆基因转入小麦，改良小麦的抗病和抗逆性。目前已经与小麦进行杂交的种属有黑麦属、簇毛麦属、偃麦草属、山羊草属、大麦属等。这些远缘杂交的成功为近缘野生种的抗旱、耐盐碱以及抗病虫害的优良基因向小麦基因组进行转移奠定了坚实的基础，使得从小麦近缘物种属中寻找或开拓新的重要基因资源成为可能。随着现代分子生物学的发展，分子标记与作物育种相结合，它不仅弥补了作物育种中传统的选择准确率低的缺点，而且加快了育种进程。

(2)小麦赤霉病抗性和长穗偃麦草特异分子标记

小麦生产中倍受关注的病害为小麦赤霉病，它是全球性致使小麦产量降低和品质下降的小麦主要病害，也是影响中国小麦生产的主要病害。

多年的小麦抗赤霉病育种研究表明，小麦种内抗赤霉病的资源很少，而且已经发现的抗性资源在小麦育种实际中也难以有效利用。从小麦近缘物种中开拓新的赤霉病抗源是小麦抗赤霉病育种中的重要策略。偃麦草属适应性和繁殖能力较强，并且具有许多优良基因和性状，如抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱和穗大多花等，是小麦遗传改良中极具应用价值的小麦近缘物种之一。研究表明，长穗偃麦草1E染色体跟赤霉病的抗性有关，并且已经建立了1E的特异染色体标记，可以用来筛选抗病杂交种。长穗偃麦草的7E染色体带有赤霉病抗性基因，认为7E染色体具有抗赤霉病基因并将该抗性基因初步定位于7E染色体长臂上。

分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段(Ribaut et al，1998)。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离的分子标记对选择个体进行目标以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。在不同植物中利用不同的方法发展分子标记是分子标记辅助选择和传统育种技术相结合进行作物遗传改良的重要研究内容。

赤霉病抗性比较复杂，人工鉴定结果受环境的影响较大，因此利用分子标记进行辅助选择将是有效途径。在长穗偃麦草向小麦转移优良的抗赤霉病基因的研究中，已有部分研究进行了长穗偃麦草染色体特异分子标记研究。到目前为止，通过RAPD，AFLP，SSR等分子标记发展技术获得了部分染色体特异标记，但发展的长穗偃麦草染色体特异分子标记不但数量少，远远满足不了小麦抗性育种实际的需要，而且染色体特异性及稳定性还不理想，发展更多的覆盖相关染色体的分子标记，进一步研究这些分子标记与抗病，抗逆基因的连锁关系，在小麦抗逆、抗病育种实际中利用这些标记进行辅助选择是非常重要和迫切需要的。

(3)长穗偃麦草染色体特异分子标记的发展

表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)是指从不同组织来源的cDNA序列。EST序列代表了基因组的编码区，保守性强，稳定性好，且在不同物种间有很好的通用性。基于EST序列开发的分子标记是开展物种遗传多样性分析，进行功能基因定位和连锁分析的一种理想标记。

TRAP是从SRAP标记技术改进过来的，同样是一种基于PCR技术的标记。TRAP标记原理是利用已知的cDNA或EST序列信息来设计引物，对目标候选基因区域进行扩增产生多态性。这一点与RAPD、ISSR、AFLP和SRAP等标记无须任何序列信息即可直接扩增有所不同。其固定引物是通过所研究植物的EST序列信息来设计，随机引物的设计和SRAP相似，在5’端有一段填充序列，紧接着一个含个含4-6个富含AT或GC核苷酸的核心区；最后在3’端连接3-4个随机的碱基。TRAP标记具有操作简单、重复性好、多态性高、效率高等优点。

利用特定引物进行PCR扩增，克隆回收扩增产物并进行测序来发展分子标记，其中方法之一是根据序列结果，将这些扩增片段转换为序列特异性扩增区标记(Sequence-characterized Amp I ified Region，SCAR)。SCAR标记对待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示，一般表现为扩增片段的有无，为显性标记。SCAR标记方便，不需要酶切、连接、PAGE电泳、银染显色、放射显影等过程，只需简单的PCR和琼脂糖凝胶电泳就可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用。

本发明的技术方案是：

小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其主要技术特征在于步骤：

(1)利用SDS酚-氯仿法微量提取基因组DNA；

(2)长穗偃麦草特异片段的PCR扩增；

(3)长穗偃麦草特异扩增片段的回收；

(4)氯化钙法制备感受态细胞；

(5)菌落PCR；

(6)长穗偃麦草染色体特异SCAR标记的建立；

所述引物根据长穗偃麦草的EST序列设计固定引物，根据SRAP引物设计随机引物，由固定引物和随机引物随机组合共56对引物，利用18条基础引物组合了56个引物组合后进行PCR扩增，选择出21个具有长穗偃麦草特异扩增的引物组合。

本发明的另一技术方案是：

小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记应用，其主要技术特征在于以长穗偃麦草的特异分子标记作为实验用的引物，对硬粒小麦与异源六倍体小麦8801进行杂交产生杂种后代，对(8801-1/Id-1)F1-10、(8801-1/Id-1)F1-11、(8801-2/Id-1)F1-1、(8801-2/Id-1)F1-7材料进行分子的技术鉴定，首先用全基因组的引物QT24‘-全对38株正常小麦进行基因组的扩增，在总共的38个样品中，筛选出其中27个有特异的条带，然后用长穗偃麦草1E-7E特异的标记对具有27个条带的植株，进行PCR扩增；F2代单株的染色体数目分布为28-42条，E染色体在不同单株的附加数目范围是1-14条。

本发明的优点和效果在于利用TRAP技术，获得长穗偃麦草染色体特异的DNA片段，并将其转化成染色体特异SCAR标记。利用这些长穗偃麦草染色体特异标记不但可以检测小麦背景中的长穗偃麦草染色质，为小麦育种中外源染色质的快速便捷检测提供新途径，而且可以用于长穗偃麦草抗赤霉病基因的连锁定位，为抗赤霉病基因的克隆和小麦抗赤霉病育种的分子标记辅助选择提供坚实的基础。

本发明所用TRAP技术在没有序列信息的长穗偃麦草中发展分子标记比其他的分子标记技术的效率高，可以用于没有序列信息的植物中发展分子标记。

本发明的分子标记重复性好，扩增稳定，操作简便，成本低廉，不仅在不同材料中表现出优越的稳定性，在不同世代间也表现出良好的性能，为分子标记辅助育种提供了优良的标记资源。

1.本发明利用TRAP分子技术，获得长穗偃麦草染色体特异的分子标记。

2.本发明所获长穗偃麦草染色体特异标记在不同材料和不同世代间表现稳定，可用于小麦背景中长穗偃麦草染色质的鉴定，可用于抗性基因的连锁分析，也可作为特异分子标记用于小麦抗赤霉病育种中进行辅助选择。

附图说明

图1——固定引物序列(固定引物依据长穗偃麦草的EST序列设计)。

图2——随机引物序列(随机引物依据文献(G.Li·C.F.Quiros，2001)中公布的引物设计)。

图3——TRAP技术所用引物组合(引物组合依据固定引物与随机引物随机组合而成，共56对)。

图4——PCR反应体系。

图5——PCR反应程序(反应程序依据文献(Hu等，2003)公布的反应程序)。

图6——各引物组合扩增的长穗偃麦草1E-7E和全基因组染色体特异片段(1-7：中国春-长穗偃麦草1E-7E染色体附加系；8：中国春；9：长穗偃麦草(2n＝2X)G：E染色体特异的片段(1E、2E、3E、4E、5E、6E、7E)；H：E染色体全基因的片段)。

图7——长穗偃麦草聚丙烯酰胺凝胶上染色体2E的特异片段(1-7：中国春—长穗偃麦草1E-7E染色体附加系；8：中国春；9：长穗偃麦草(2n＝2Ｘ）)。

图8——长穗偃麦草特异扩增片段的菌落PCR(M：DL2000marker；1-3：同一片段的菌落PCR；4-6：同一片段的菌落PCR；7-9：同一片段的菌落PCR)。

图9——-Q1-T15标记与小麦序列进行同源比对的结果(蓝色部分为载体的序列，红色的部分为目的片段)。

图10——长穗偃麦草特异1E-7E和全基因组的标记对中国春、长穗麦草、中国春-长穗偃麦草二体附加系扩增结果(M：DL2000marker；1-7：附加系(DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E、DA7E)；8：中国春；9：长穗偃麦草)。

图11——长穗偃麦草染色体特异标记的应用之一(引物QT24‘-全对38株正常小麦的DNA扩增PCR的结果Mark：DL2000marker1-38：38株正常小麦39：硬粒小麦40：8801)。

图12——长穗偃麦草染色体特异标记的应用之二(长穗偃麦草特异标记对27个植株扩增PCR的结果Mark：DL2000marker1-38：27株正常小麦39：硬粒小麦40：8801)。

具体实施方式

本发明的技术思路是：

根据植物EST序列设计引物，利用PCR技术从小麦-长穗偃麦草附加系中扩增得到长穗偃麦草的特异片段并进行测序，依据测序结果重新设计引物而获得长穗偃麦草染色体特异的分子标记，并将其应用。

这些标记可用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定和硬粒小麦-长穗偃麦草附加系的创建，可用于小麦抗赤霉病和抗逆基因的连锁分析，可用于小麦抗赤霉病和抗逆性育种中的分子标记辅助选择。

本发明根据EST序列信息，利用TRAP分子技术，合成18条引物共组成56个引物组合对普通小麦中国春、长穗偃麦草和中国春-长穗偃麦草二体附加系材料进行PCR扩增，筛选具有染色体特异片段扩增的引物组合，共筛选出8个组合可扩增染色体特异片段，分布于长穗偃麦草的1E、2E、3E、4E、5E、6E、7E染色体。

本发明将这些特异片段进行克隆和测序，测序结果在NCBI GenBank中与小麦基因组进行同源比对。对非小麦同源序列的片段设计PCR引物，分别对普通小麦中国春、长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草二体附加系和相应代换系进行了PCR扩增，其中这21对引物的扩增片段只出现在长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草相对应染色体的二体附加系及代换系，大小与理论值相一致，表明位于1E、2E、3E、4E、5E、6E以及7E等这些E染色体特异的片段能够被转换为相对应染色体的特异SCAR标记。

下面具体说明本发明。

本发明所用材料包括7份中国春小麦-长穗偃麦草二体附加系(Triticumaestivum cv.Chinese Spring-Thinopyrum e/ongatum disomic additionallines，DA1E，DA2E，DA3E，DA4E，DA5E，DA6E，DA7E，)，19份中国春小麦-长穗偃麦草二体代换系(Triticum aestivum cv.Chinese Spring-Thinopyrume/ongatum di somic substitutional lines，如DS1E/1A，DS2E/2A，DS3E/3A至DS7E/7A)、1份小麦中国春(Triticum aestiyum)和1份二倍体长穗偃麦草。以上材料由加拿大农业部的Dr.Fedax惠赠并保存在扬州大学生物技术学院分子细胞遗传实验室。

实施例1引物的设计

如图1所示为依据TRAP技术的引物设计原理，根据长穗偃麦草的EST序列设计固定引物8条，碱基数目为18-19之间。图2所示为根据文献(G.Li·C.F.Quiros，2001)中公布的SRAP引物设计随机引物共14条，碱基数目在17-19之间。如图3所示为由固定引物和随机引物随机组合共56对引物。利用18条基础引物组合了56个引物组合后进行PCR扩增，选择出21个具有长穗偃麦草特异扩增的引物组合。上述引物保存在扬州大学生物技术学院分子细胞遗传实验室。

实施例2基因组DNA的提取

利用SDS酚-氯仿法微量提取基因组DNA。其步骤如下：

(1)取幼嫩叶片(约0.1g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用研磨棒碾碎至粉末状；

(2)离心管放置于室温稍冷却，加入700μl的缓冲液A，轻轻混匀，然后65℃水浴20min，期间每隔5min上下颠倒混匀一次；

(3)取出稍冷却至室温，加入苯酚和氯仿各350μl，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(4)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中；

(5)加入约750μl氯仿，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(6)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中；

(7)加入约560μl异丙醇，轻慢混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀；

(8)12000rpm，离心10min，弃去上清液；

(9)加500μl70％的乙醇溶液洗涤两次，每次2-3min.室温晾干；

(10)晾干的DNA溶解于20μl TER中，37℃温浴45min.-20℃保存备用。

实施例3长穗偃麦草特异片段的PCR扩增

依据图3的引物组合后进行PCR扩增。如图4所示为25μl的PCR反应体系，此体系为PCR最基本的反应体系。图5所示为依据文献(Hu等，2003)中TRAP技术的35个循环反应程序。PCR反应结束后以6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，如图6所示为各引物组合扩增的长穗偃麦草1E-7E和全基因组染色体特异片段，其中1-7为中国春-长穗偃麦草二体附加系，8为中国春，9为长穗偃麦草，A-G分别代表1E-7E的特异标记，H代表全基因组的特异标记，从图中可以看出每个染色体都有其特有的片段，可以发展为染色体特异标记。由于具备一整套中国春-长穗偃麦草二体附加系材料，因此可将扩增的特异片段进一步定位到不同的E染色体上。

实施例4长穗偃麦草特异扩增片段的回收

(1)用刀片将含有特异扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶胶条从胶板上割下，放入1.5ml离心管中，加入TEO.1200μl，浸泡30min，用移液枪去除液体，重复2次。

(2)加入200μl ddH20，浸泡30min，用移液枪去除液体。

(3)加入30μl ddH20，100℃水浴10min。

(4)将胶块捣碎，100℃水浴10mi n。

(5)3700rpm，离心15min，20μl的PCR反应体系中加入3μl上清液作为模板，采用相应引物相同PCR程序对其进行扩增。

(6)以割胶回收的条带为模板PCR扩增产物与首次PCR扩增得到的对应产物，同时进行1％琼脂糖凝胶检测，若两者的电泳迁移率相同，则割胶回收的条带为目的产物。如图7所示，1-7为中国春-长穗偃麦草二体附加系，8为中国春，9为长穗偃麦草，从图中可以看出1E、3E-7E和中国春都没有条带，只有2E和长穗偃麦草有条带，说明此条带为2E所特有，可以发展为2E的特异标记。

(7)将1％琼脂糖凝胶上证明正确的目的产物与pMD18/19-T载体(TaKaRa，Code：D102A)连接，具体步骤如下：在微量离心管中加入1μl的pMD18/19-T载体，加入0.1pmol至0.3pmol样品DNA，用ddH20定容至5μl。再加入5μl(等量)的Solution l。16℃反应30min，并且4℃过夜。

实施例5氯化钙法制备感受态细胞(Bio Basic，No.BS525)

(1)取少量冻存菌株大肠杆菌(E.co/i)DH5α，在LB平板培养基上进行划线培养，恒温培养箱(37℃)中培养16～20h。

(2)挑取一个单菌落，接种于含2ml SOB培养液中，恒温摇床(37℃，250rpm/min)上培养12～16h。

(3)接种1ml的培养物到500ml锥形瓶中(内含100ml SOC培养液)，恒温摇床(37℃，250rpm/min)上培养至OD₆₀₀≈0.35。

(4)迅速将培养物置于冰浴中20min，期间缓慢摇匀使内容物充分均匀冷却。同时将2个50ml离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。

(5)将细菌转移至预冷的离心管中，4℃，4000rpm离心15min，弃去上清液。

(6)用16ml的溶液A小心的悬浮细菌，冰上放置15min。

(7)4℃，4000rpm离心15min，收集菌体。

(8)用4ml溶液B重新悬浮细菌，分装，80μl/管，液氮速冻，-70℃保存。

(9)用于转化时，将100pg到10ng DNA加到感受态细胞(冰上溶解)中。

(10)细胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37℃培养5min或42℃培养90s，然后再次冰上放置2min。

(11)加入1ml SOC培养基，37℃温和摇动培养1h。

(12)在选择性培养基上涂布培养细胞，恒温培养箱(37℃)中培养12～16h。

实施例6菌落PCR

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测为单一目的条带后，连接到pMD19-T(TaKaRa，Code：D102A)载体上，然后转化入感受态大肠杆菌细胞中。将菌种接种到固体LB培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行菌落PCR。

用灭菌枪头从转化平板上挑取一个白色菌落，将枪头打入盛有1ml的2×YT培养基的1.5ml的离心管中，置于37℃要床上震荡8h左右。取出进行菌落PCR，如图8所示为3个不同的片段所产生的3组菌落PCR，其中1-3为一组，4-6为一组，7-9为一组。琼脂糖电泳，如果所产生的特异条带与目的片段的大小一致，则进行测序。最后将克隆测序得到的核苷酸序列在NCBI GenBank中与已知普通小麦DNA序列进行比对，无同源性或同源性小于50％的序列即视为长穗偃麦草染色体特异序列，以此特异序列设计引物发展出长穗偃麦草的SCAR标记。

实施例7长穗偃麦草染色体特异SCAR标记的建立

将图3中引物组合特异扩增的DNA片段回收，菌落PCR后在阳性克隆中选择2～3个样品进行DNA测序。测序结果与网上已公布的小麦序列进行同源比对，保留无小麦同源序列的片段，如图9所示为某一大小为242bp的特异片段与小麦进行同源比对，其中蓝色部分序列为载体序列，红色部分序列为目的片段，通过目的片段与小麦序列的比对，从图可以看出该片段在50-90bp和150-180bp(蓝色部分)之间具有较高的同源性，同源性的大小在40-50bp之间，去掉同源性高的部分，无同源性的部分用Primer Premier5软件设计引物。经过序列比对后设计了21对特异性的引物。以这21对特异引物，对中国春小麦、二倍体长穗偃麦草和中国春-长穗偃麦草二体附加系进行PCR扩增。

依据TRAP技术设计的21对引物，这些引物能在二倍体长穗偃麦草和相对应的中国春-长穗偃麦草二体附加系中扩增出与理论扩增片段大小一致的染色体特异片段。如图10所示为长穗偃麦草特异1E-7E和全基因组的标记对中国春、长穗麦草、中国春-长穗偃麦草二体附加系扩增结果，其中1-7为中国春-长穗偃麦草二体附加系，8为中国春，9为长穗偃麦草，从图中可以看出1E-7E二体附加系和长穗偃麦草都出现了单一的特异条带，说明是每个染色体所特有的特异片段，结果表明特异扩增的源片段成功地被转换7条染色体的特异SCAR标记。本发明表示在长穗偃麦草中依据TRAP技术发展染色体特异分子标记示可行的。

实施例8长穗偃麦草E染色体SCAR标记的应用

硬粒小麦是普通小麦近缘种中可以进行杂交利用的重要资源。一般来说，在我国硬粒小麦产量适应性和生产利用价值不如普通小麦，但是硬粒小麦个别性状，常常显著超过普通小麦，把它的优良性状转移到普通小麦上来，可以育成遗传基因广泛、优良性突出的小麦新品系硬粒小麦的蛋白质含量较高，平均比普通小麦高2～3个百分点，湿面筋含量也较高。但是硬粒小麦也存在一些不良的性状和易感病的问题。因此，创建硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系，对于研究长穗偃麦草优良基因和硬粒小麦的遗传改良具有重要意义。

本研究以本实验室发展的长穗偃麦草的特异分子标记作为实验用的引物，对硬粒小麦(Langdon)与异源六倍体小麦8801进行杂交产生杂种后代，如(8801-1/Id-1)F1-10、(8801-1/Id-1)F1-11、(8801-2/Id-1)F1-1、(8801-2/Id-1)F1-7等材料进行分子的技术的鉴定，选育出能够稳定遗传的硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系，为硬粒小麦利用长穗偃麦草优良基因提供新的种质资源。本研究用的材料由加拿大农业部Dr.Fedak提供。

如图11所示为用全基因组的引物QT24‘-全对38株正常小麦进行基因组扩增的结果，其中1-38为正常的小麦，39为硬粒小麦，40为8801，在总共的38个样品中，其中27个有特异的条带，说明在这27个小麦中增添了一条或者多条染色体，为所需要的符合条件的植株。用长穗偃麦草1E-7E特异的标记对具有27个条带的植株，进行PCR扩增的结果，从图12结果所示，在这27个植株中，其中3E2株(29、38)，4E3株(13、23、37)，5E1株(9)，7E3株(2、5、20)，这些植株仅一条染色体特异扩增，表明附加了相同染色体，染色体数目为29条或者30条，是我们所想要的材料。而其他的植株在两条或更多的染色体上扩增出条带，不是我们所要的材料，但可以继续种植，借助染色体的分离重组获得附加单条E染色体的植株。筛选出符合条件的植株，然后将这些植株继续种植，再在其后代利用染色体数目检测，在其中筛选出硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系。此结果表明所获长穗偃麦草特异染色体SCAR标记在创建硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系，和对长穗偃麦草染色体世代间进行跟踪检测起到了重要的作用，为小麦外源偃麦草染色质的检测提供了便捷的分子标记。

Claims (9)

1.小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤： 

(1)利用SDS酚-氯仿法微量提取基因组DNA； 

(2)长穗偃麦草特异片段的PCR扩增； 

(3)长穗偃麦草特异扩增片段的回收； 

(4)氯化钙法制备感受态细胞； 

(5)菌落PCR； 

(6)长穗偃麦草染色体特异SCAR标记的建立； 

所述引物根据长穗偃麦草的EST序列设计固定引物，根据SRAP引物设计随机引物，由固定引物和随机引物随机组合共56对引物，利用18条基础引物组合了56个引物组合后进行PCR扩增，选择出21个具有长穗偃麦草特异扩增的引物组合。 

2.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(1)利用SDS酚-氯仿法微量提取基因组DNA中，其步骤如下： 

(1-1)取幼嫩叶片(约0.1g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用研磨棒碾碎至粉末状； 

(1-2)离心管放置于室温稍冷却，加入700μl的缓冲液A，轻轻混匀，然后65℃水浴20min，期间每隔5min上下颠倒混匀一次； 

(1-3)取出稍冷却至室温，加入苯酚和氯仿各350μl，上下颠倒，充分混匀，抽提5min； 

(1-4)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中； 

(1-5)加入约750μl氯仿，上下颠倒，充分混匀，抽提5min； 

(1-6)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中； 

(1-7)加入约560μl异丙醇，轻慢混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀； 

(1-8)12000rpm，离心10min，弃去上清液； 

(1-9)加500μl70％的乙醇溶液洗涤两次，每次2-3min.室温晾干； 

(1-10)晾干的DNA溶解于20μlTER中，37℃温浴45min.-20℃保存备用。 

3.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(2)长穗偃麦草特异片段的PCR扩增中，其步骤如下： 

(2-1)依据引物组合进行PCR扩增； 

(2-2)PCR反应结束后以6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物。 

4.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(3)长穗偃麦草特异扩增片段的回收中，步骤如下： 

(3-1)用刀片将含有特异扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶胶条从胶板上割下，放入1.5ml离心管中，加入TEO.1200μl，浸泡30min，用移液枪去除液体，重复2次： 

(3-2)加入200μlddH20，浸泡30min，用移液枪去除液体； 

(3-3)加入30μlddH20，100℃水浴10min； 

(3-4)将胶块捣碎，100℃水浴10min； 

(3-5)3700rpm，离心15min，20μl的PCR反应体系中加入3μl上清液作为模板，采用相应引物相同PCR程序对其进行扩增； 

(3-6)以割胶回收的条带为模板PCR扩增产物与首次PCR扩增得到的对应产物，同时进行1％琼脂糖凝胶检测，若两者的电泳迁移率相同，则割胶回收的条带为目的产物； 

(3-7)将1％琼脂糖凝胶上证明正确的目的产物与pMD18/19-T载体连接，具体步骤如下：在微量离心管中加入1μl的pMD18/19-T载体，加入0.1pmol至0.3pmol样品DNA，用ddH20定容至5μl，再加入5μl等量的Solutionl。16℃反应30min，并且4℃过夜。 

5.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(4)氯化钙法制备感受态细胞中，其步骤如下： 

(4-1)取少量冻存菌株大肠杆菌DH5α，在LB平板培养基上进行划线培养，恒温培养箱(37℃)中培养16～20h： 

(4-2)挑取一个单菌落，接种于含2ml SOB培养液中，恒温摇床，37℃，250rpm/min，上培养12～16h； 

(4-3)接种1ml的培养物到500ml锥形瓶中，内含100ml SOC培养液，恒温摇床，37℃，250rpm/min，上培养至OD₆₀₀≈0.35； 

(4-4)迅速将培养物置于冰浴中20min，期间缓慢摇匀使内容物充分均匀冷却； 

(4-5)将细菌转移至预冷的离心管中，4℃，4000rpm离心15min，弃去上清液； 

(4-6)用16ml的溶液A小心的悬浮细菌，冰上放置15min； 

(4-7)4℃，4000rpm离心15min，收集菌体； 

(4-8)用4ml溶液B重新悬浮细菌，分装，80μl/管，液氮速冻，-70℃保存； 

(4-9)用于转化时，将100pg到10ng DNA加到感受态细胞中； 

(4-10)细胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37℃培养5min或42℃培养90s，然后再次冰上放置2min； 

(4-11)加入1ml SOC培养基，37℃温和摇动培养1h； 

(4-12)在选择性培养基上涂布培养细胞，恒温培养箱(37℃)中培养12～16h。 

6.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(5)菌落PCR中，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测为单一目的条带后，连接到pMD19-T载体上，然后转化入感受态大肠杆菌细胞中，将菌种接种到固体LB培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行菌落PCR；用灭菌枪头从转化平板上挑取一个白色菌落，将枪头打入盛有1ml的2×YT培养基的1.5ml的离心管中，置于37℃要床上震荡8h左右；取出进行菌落PCR，琼脂糖电泳；将克隆测序得到的核苷酸序列在NCBIGenBank中与已知普通小麦DNA序列进行比对，无同源性或同源性小于50％的序列即视为长穗偃麦草染色体特异序列，以此特异序列设计引物发展出长穗偃麦草的SCAR标记。 

7.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(6)长穗偃麦草染色体特异SCAR标记的建立中，将引物组合特异扩增的DNA片段回收，菌落PCR后在阳性克隆中选择2～3个样品进行DNA测序，测序结果与小麦序列进行同源比对，保留无小麦同源序列的片段，经过序列比对后的21对特异引物，对中国春小麦、二倍体长穗偃麦草和中国春-长穗偃麦草二体附加系进行PCR扩增，21对引物能在二倍体长穗偃麦草和相对应的中国春-长 穗偃麦草二体附加系中扩增出与理论扩增片段大小一致的染色体特异片段，表明特异扩增的源片段成功地被转换7条染色体的特异SCAR标记。 

8.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记应用，其特征在于以长穗偃麦草的特异分子标记作为实验用的引物，对硬粒小麦与异源六倍体小麦8801进行杂交产生杂种后代，对(8801-1/Id-1)F1-10、(8801-1/Id-1)F1-11、(8801-2/Id-1)F1-1、(8801-2/Id-1)F1-7材料进行分子的技术鉴定，首先用全基因组的引物QT24‘-全对38株正常小麦进行基因组的扩增，在总共的38个样品中，筛选出其中27个有特异的条带，然后用长穗偃麦草1E-7E特异的标记对具有27个条带的植株，进行PCR扩增；F2代单株的染色体数目分布为28-42条，E染色体在不同单株的附加数目范围是1-14条。 

9.根据权利要求8所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记应用，其特征在于对于多条E染色体的植株，借助染色体的分离重组获得附加单条E染色体的植株，将选择出具有单一E染色体扩增条带的单株进行自交，然后再利用染色体数目的检查、GISH鉴定，在其中筛选出硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系。