CN102352354A - 小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，具体为根据植物重复序列信息设计引物，利用PCR技术从小麦-长穗偃麦草附加系中扩增得到长穗偃麦草的特异DNA片段并进行测序，依据与小麦无同源性的序列重新设计引物而获得长穗偃麦草染色体特异的分子标记。所说的分子标记是本发明提出的8对引物之一。这些标记可用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定，可用于抗赤霉病基因的连锁分析，可作为特异分子标记鉴定长穗偃麦草染色质而用于小麦抗赤霉病和抗逆性育种中。

Description

小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，根据植物重复序列信息设计引物，利用PCR技术从小麦-长穗偃麦草附加系中扩增得到长穗偃麦草的特异片段并进行测序，依据测序结果重新设计引物而获得长穗偃麦草染色体特异的分子标记。这些标记可用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定，可用于小麦抗赤霉病和抗逆基因的连锁分析，可用于小麦抗赤霉病和抗逆性育种中的分子标记辅助选择。

背景技术

(1)小麦育种目标和其野生近缘种

小麦是世界总产量仅次于玉米的第二粮食作物。近半个世纪来，世界小麦的总产量已经增加了两倍多，其中，优良的小麦品种对提高小麦产量发挥了决定性的作用。目前小麦育种研究主要集中在四个方面：第一、提高小麦产量，降低生产成本；第二、分子标记辅助育种；第三、小麦抗逆性育种；第四、小麦营养品质。为完成以上育种目标，小麦本身的遗传资源已经明显不够，而与小麦具有近缘关系的许多野生物种中却存在着大量小麦中所没有的有利遗传资源。因此，利用小麦近缘野生种中的优良基因资源培育小麦新品种已经成为小麦育种的目标之一。

小麦(AABBDD，2n＝42)是异源六倍体植物，属于禾本科小麦属普通小麦种(Triticumaestivum L.)，自然界中生长许多小麦的野生近缘物种，这些野生近缘种植物中蕴含着大量优良基因，是一个巨大的具有潜在利用价值的遗传基因库，该基因库的优良基因如得到利用，对小麦遗传改良将具有重要的价值，不仅能提高其产量、改良品质，更能将丰富的抗病，抗逆基因转入小麦，改良小麦的抗病和抗逆性。目前已经与小麦进行杂交的种属有黑麦属、簇毛麦属、偃麦草属、山羊草属、大麦属等。这些远缘杂交的成功为近缘野生种的抗旱、耐盐碱以及抗病虫害的优良基因向小麦基因组进行转移奠定了坚实的基础，使得从小麦近缘种属中寻找或开拓新的重要基因资源成为可能。随着现代分子生物学的发展，分子标记与作物育种相结合，它不仅弥补了作物育种中传统的选择准确率低的缺点，而且加快了育种进程。

(2)小麦赤霉病抗性和长穗偃麦草特异分子标记

小麦生产中倍受关注的病害为小麦赤霉病，它是全球性致使小麦产量降低和品质下降的小麦主要病害，也是影响中国小麦生产的主要病害。该病由多种镰刀菌引起，病原菌侵染小麦籽粒后产生多种真菌毒素，这些毒素对人畜有害，严重威胁着人类和家畜的健康。我国长江中下游冬麦区是小麦赤霉病的多发区和重灾区，近年来黄淮麦区和关中麦区小麦赤霉病发生也日趋严重，影响着国内小麦主产区的粮食安全。

多年的小麦抗赤霉病育种研究表明，小麦种内抗赤霉病的资源很少，而且已经发现的抗性资源在小麦育种实际中也难以有效利用。从小麦近缘物种中开拓新的赤霉病抗源是小麦抗赤霉病育种中的重要策略，并且进行了大量的相关研究。偃麦草属(Thinopyrum)是禾本科大麦族(Horseae)，小麦亚族(Triticeae)中的多年生草本植物，与普通小麦的亲缘关系较近，世界范围内约有50种，主要分布在温带和寒带地区。该属适应性和繁殖能力较强，并且具有许多优良基因和性状，如抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱和穗大多花等，是小麦遗传改良中极具应用价值的小麦近缘物种之一。自然界中存在3种类型的长穗偃麦草，即二倍体长穗偃麦草(Th.elongatum，2n＝14)、四倍体长穗偃麦草(Th.elongatum，2n＝28)和十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum，2n＝70)。二倍体长穗偃麦草具有E染色体组，E染色体组是偃麦草属多倍体物种的基本染色体组，许多抗病基因如抗大麦黄矮病基因和抗小麦锈病基因等都在偃麦草属的E染色体组中存在。对小麦-长穗偃麦草二体附加系接种小麦赤霉病菌后发现，在长穗偃麦草1E上携带控制赤霉病抗性的主效基因，同时在3E、4E及6E染色体上可能存在微效抗性基因。Jauhar等报道长穗偃麦草1E染色体跟赤霉病的抗性有关，并且已经建立了1E的特异染色体标记，可以用来筛选抗病杂交种。Somers等报道长穗偃麦草的7E染色体带有赤霉病抗性基因。多个研究也认为7E染色体具有抗赤霉病基因并将该抗性基因初步定位于7E染色体长臂上。

对于赤霉病抗性的鉴定，研究者使用的方法和表示参数各不相同，而且抗性鉴定结果受环境条件的影响比较大，建立稳定可靠的赤霉病接种方法和鉴定标准是评价品种抗病性最关键的问题。为了使抗性鉴定更加准确，研究者将目标转移到分子标记。分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段(Ribaut et al，1998)。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离的分子标记对选择个体进行目标以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。在不同植物中利用不同的方法发展分子标记是分子标记辅助选择和传统育种技术相结合进行作物遗传改良的重要研究内容。

赤霉病抗性比较复杂，人工鉴定结果受环境的影响较大，因此利用分子标记进行辅助选择将是有效途径。在长穗偃麦草向小麦转移优良的抗赤霉病基因的研究中，已有部分研究进行了长穗偃麦草染色体特异分子标记研究。到目前为止，通过RAPD，AFLP，SSR等分子标记发展技术获得了部分染色体特异标记，但发展的长穗偃麦草染色体特异分子标记不但数量少，远远满足不了小麦抗性育种实际的需要，而且染色体特异性及稳定性还不理想，发展更多的覆盖相关染色体的分子标记，进一步研究这些分子标记与抗病，抗逆基因的连锁关系，在小麦抗逆、抗病育种实际中利用这些标记进行辅助选择是非常重要和迫切需要的。

(3)长穗偃麦草染色体特异分子标记的发展

植物基因组存在大量的简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，也称微卫星DNA，是一类由1-6个碱基组成的基序(motif)串联重复序列，其中最常见是双核苷酸重复和三核苷酸重复，如(CA)_n、(AT)_n、(TG)_n、(GGC)_n、(GAT)_n等。每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目一般为10-60，它们广泛分布于绝大多数真核生物基因组中，其高度多态性主要来源于串联重复数目的不同。微卫星序列两侧一般是相对保守的单拷贝序列，根据保守序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定多态性。而采用SSR技术发展分子标记的前提条件是必须知道重复序列两端的DNA序列的信息，如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。因此，传统的SSR分子标记开发方法工作量大，需花费大量人力、物力，而且效率较低。由于没有长穗偃麦草基因组序列，使得在长穗偃麦草中发展SSR标记难以进行。

简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat，ISSR)是Zietkeiwitcz等于1994年提出的一种以微卫星为基础的分子标记，它检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。由于SSR序列广泛分布于高等生物的基因组中，所以ISSR具有很强的多态性。ISSR引物的开发不需要获得SSR两侧的单拷贝序列，开发费用降低，而且ISSR引物可以在不同的物种间通用，揭示的多态性较高，检测非常方便，是一种非常有发展前途的分子标记。目前，ISSR标记已广泛应用于多种植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究中，但在长穗偃麦草中没有进行研究。

植物基因组中还存在可以移到的DNA片段，即转座子。其中以RNA为媒介反转录为DNA后再进行转座的成分为反转录转座子。反转录转座子是目前植物基因组中所知的数量最大的一类可移动成分(Grandbastien et al，1998)。由于反转录转座子在基因组中的复制与转座造成基因组的多样性，使植物的反转录转座子很容易作为一种分子标记应用于遗传变异的研究中。

反转录转座子位点间多态性的分子标记(inter-retrotransposon amplified polymorphism，IRAP)的原理是根据反转录转座子中LTR的保守序列设计引物，这些引物在PCR过程中可以与LTR序列退火，从而扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段。也可以根据反转录酶基因的相对保守序列设计引物进行扩增。目前，IRAP分子标记技术已应用于大麦、柑橘、网茅、马铃薯等植物的遗传研究中。该技术在长穗偃麦草中没有进行研究。

反转座子微卫星扩增多态性(retrotransposon microsatellite amplified polymorphism，REMAP)也是一种基于反转录转座子的标记技术。REMAP技术原理是根据反转录转座子的LTR保守序列和微卫星序列设计引物，然后进行PCR，扩增出反转录转座子与邻近的微卫星间的片段，从而检测出反转录转座子与邻近简单重复序列之间的多态性。该技术在长穗偃麦草中也没有进行研究。

利用特定引物进行PCR扩增，克隆回收扩增产物并进行测序来发展分子标记，其中方法之一是根据序列结果，将这些扩增片段转换为序列特异性扩增区标记(Sequence-characterized Amplified Region，SCAR)。SCAR标记对待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示，一般表现为扩增片段的有无，为显性标记。SCAR标记方便，不需要酶切、连接、PAGE电泳、银染显色、放射显影等过程，只需简单的PCR和琼脂糖凝胶电泳就可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。

本发明利用ISSR/IRAP/REMAP技术，获得长穗偃麦草染色体特异的DNA片段，并将其转化成染色体特异SCAR标记。利用这些长穗偃麦草染色体特异标记不但可以检测小麦背景中的长穗偃麦草染色质，为小麦育种中外源染色质的快速便捷检测提供新途径，而且可以用于长穗偃麦草抗赤霉病基因的连锁定位，为抗赤霉病基因的克隆和小麦抗赤霉病育种的分子标记辅助选择提供坚实的基础。

本发明所用ISSR/IRAP/REMAP技术在没有序列信息的长穗偃麦草中发展分子标记比其他的分子标记技术的效率高，可以用于没有序列信息的植物中发展分子标记。

发明内容

本发明根据反转录转座子的保守序列和简单重复序列，利用ISSR/IRAP/REMAP技术，合成11条引物共组成35个引物组合对普通小麦中国春、长穗偃麦草和中国春-长穗偃麦草二体附加系材料进行PCR扩增，筛选具有染色体特异片段扩增的引物组合，共筛选出8个组合可扩增染色体特异片段，分布于长穗偃麦草除2E外的1E、3E、4E、5E、6E、7E染色体。

本发明将这些特异片段进行克隆和测序，测序结果在NCBI GenBank中与小麦基因组进行同源比对。对非小麦同源序列的片段设计PCR引物，分别对普通小麦中国春、长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草二体附加系和相应代换系进行了PCR扩增，其中编号为Z34-1E₂₀₀、Z29-3E₆₇₄、Z8-4E₃₇₄、Z2-5E₃₀₄、Z17-6E₁₉₉和Z31-7E₂₁₅ Z21-7E₃₂₉，Z12-7E₁₀₅的扩增片段只出现在长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草相对应染色体的二体附加系及代换系，大小与理论值相一致，表明位于1E染色体(Z34-1E₂₀₀)、3E染色体(Z29-3E₆₇₄)、4E染色体(Z8-4E₃₇₄)、5E染色体(Z2-5E₃₀₄)、6E染色体(Z17-6E₁₉₉)以及7E染色体(Z31-7E₂₁₅，Z21-7E₃₂₉，Z12-7E₁₀₅)上的6个E染色体特异的片段能够被转换为相对应染色体的特异SCAR标记。

本发明利用标记Z31-7E₂₁₅进一步扩增7ES和7EL的端体附加系，又能将这个标记进一步定位到7E染色体臂。结果显示引物Z31-7E₂₁₅只在7EL端体附加系中扩增出条带，即7E染色体长臂特异的SCAR标记。

本发明所述一种长穗偃麦草染色体特异标记，它是下列8对引物之一：

第1对：

L：5’-GATGTCACCAAGCCCTAC-3’(SEQ ID NO.12)

R：5’-TCCTACGAAACACCCAAG-3’(SEQ ID NO.13)；

第2对：

L：5’-TCGCTCGCCCACTAC-3’(SEQ ID NO.14)

R：5’-GGTTCGGCCCATGTCTAT-3’(SEQ ID NO.15)；

第3对：

L：5’-TGTTGCCAGTGGAGGAAG-3’(SEQ ID NO.16)

R：5’-TTGAACTACTGAACCGAAT-3’(SEQ ID NO.17)；

第4对：

L：5’-ACAGTGAGCCCGAAGGAA-3’(SEQ ID NO.18)

R：5’-AACACCAGCGGACAAAGC-3’(SEQ ID NO.19)；

第5对：

L：5’-ATTGCTCTTAGGGCATAT-3’(SEQ ID NO.20)

R：5’-CTCTGTCTCGGTTGTTTC-3’(SEQ ID NO.21)；

第6对：

L：5’-TGTCAACTCACGCCTACT-3’(SEQ ID NO.22)

R：5’-CCCTGGGAATCTAATGTG-3’(SEQ ID NO.23)；

第7对：

L：5’-GGTAACACCTAGATGGCACT-3’(SEQ ID NO.24)

R：5’-GGCACCCTAAACCCTAAT-3’(SEQ ID NO.25)；

第8对：

L：5’-TCCTTCAACTGCATTCCCTA-3’(SEQ ID NO.26)

R：5’-ATTGCTCGATTTCGGTGT-3’(SEQ ID NO.27)。

本发明还公开了上述长穗偃麦草染色体特异标记在小麦抗赤霉病和抗逆性育种中的应用。本发明所获染色体特异标记可跟踪长穗偃麦草的染色体或染色质，可用于抗赤霉病基因的连锁分析，可用于分子标记辅助选择，提高小麦抗赤霉病和抗逆性育种的效率。

本发明利用中国春-长穗偃麦草7E代换系(DS7E/7A)与普通小麦品种扬麦16分别进行正交和反交，然后以F1代自交获得F2代。选择了7E染色体上的一个分子标记Z31-7E₂₁₅对杂交F1代、F2代、中国春、长穗偃麦草等材料进行扩增。结果表明杂交F1代无论是正交还是反交都能扩增出特异条带，而在F2代中，部分单株有扩增条带结果，部分单株没有，符合预期的孟德尔遗传的3∶1分离。此结果表明所获长穗偃麦草特异染色体SCAR标记在世代间的表现也是稳定的，可利用这些分子标记对长穗偃麦草染色体或染色体片段在世代间进行跟踪检测，为小麦染色体工程中外源偃麦草染色质的检测提供了便捷的分子标记。

本发明的分子标记重复性好，扩增稳定，操作简便，成本低廉，不仅在不同材料中表现出优越的稳定性，在不同世代间也表现出良好的性能，为分子标记辅助育种提供了优良的标记资源。

1.本发明利用ISSR/IRAP/REMAP技术，获得长穗偃麦草染色体特异的分子标记。

2本发明所获长穗偃麦草染色体特异标记在不同材料和不同世代间表现稳定，可用于小麦背景中长穗偃麦草染色质的鉴定，可用于抗性基因的连锁分析，也可作为特异分子标记用于小麦抗赤霉病育种中进行辅助选择。

附图说明

图1：小麦背景中PCR扩增的长穗偃麦草特异片段聚丙烯酰胺凝胶的原始图。箭头所示为扩增的4E染色体片段；

1-7：附加系(DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E、DA7E)；8：中国春小麦；9：长穗偃麦草(2X)。

图2：小麦背景中PCR扩增的长穗偃麦草各引物组合扩增的E染色体特异片段。

各引物组合扩增的E染色体特异片段

1：1E特异片段、3：3E特异片段、4：4E特异片段、5：5E特异片段、6：6E特异片段、7：7E特异片段；

1-7：附加系(DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E、DA7E)；8：中国春小麦；9：长穗偃麦草(2X)。

图3：长穗偃麦草聚丙烯酰胺凝胶上染色体4E的特异片段。

1E：1E附加系，2E：2E附加系，3E：3E附加系，4E：4E附加系，5E：5E附加系，6E：6E附加系，7E：7E附加系，CS：中国春，EE：长穗偃麦草

图4：长穗偃麦草特异扩增片段的回收及菌落PCR

1-10：4E特异片段转化大肠杆菌后菌落PCR结果M：DL2000标记.

图5：长穗偃麦草染色体特异标记

M：DL2000标记；1-7：附加系(DA1E，DA2E，DA3E，DA4E，DA5E，DA6E，DA7E)；8-14：代换系(DS1E/1D，DS2E/2D，DS3E/3D，DS4E/4D，DS5E/5D，DS6E/6D，DS7E/7D)；15：中国春小麦；16：长穗偃麦草；17-18：7E端体附加系(DA7ES，DA7EL)

图6：长穗偃麦草染色体特异标记正交检测稳定性

M：DL2000标记1：二倍体长穗偃麦草；2：中国春小麦；3：DS7E/7D×扬麦16F1；4-42：DS7E/7D×扬麦16F2单株

图7：长穗偃麦草染色体特异标记反交检测稳定性

M：DL2000标记1：二倍体长穗偃麦草；2：中国春小麦；3：DS7E/7D×扬麦16F1；4-42：DS7E/7D×扬麦16F2单株。

具体实施方式

实施例1植物材料和PCR引物序列

(1)植物材料

本发明所用材料包括7份中国春小麦-长穗偃麦草二体附加系(Triticum aestivum cv.Chinese Spring-Thinopyrum elongatum disomic additional lines，DA1E，DA2E，DA3E，DA4E，DA5E，DA6E，DA7E，)、2份中国春小麦-长穗偃麦草7E长臂和7E短臂附加系(DA7ES，DA7EL)，19份中国春小麦-长穗偃麦草二体代换系(Triticum aestivum cv.ChineseSpring-Thinopyrum elongatum disomic substitutional lines，如DS1E/1A，DS2E/2A，DS3E/3A至DS3E/19A、1份小麦中国春(Triticum aestivum)和1份二倍体长穗偃麦草。以上材料由加拿大农业部的Dr.Fedax惠赠并保存在扬州大学生物技术学院分子细胞遗传实验室。

(2)PCR扩增引物

根据大麦(Hordeum vulgare)反转录转座子BARE-1(Accessing Number Z17327)从309bp-2137bp的LTR序列设计2条引物，yr-1和yr-2；根据文献合成7条引物，yr-3、yr-4、yr-5、s-1、s-2、s-3和s-4；根据水稻反转录转座子RIRE-1的反转录酶中心序列设计引物2条引物，PL1和PR1。yr-1、yr-2、yr-3、yr-4、yr-5、PL1和PR1为依据反转录转座子设计的引物，s-1、s-2、s-3和s-4为微卫星引物。利用11条基础引物组合了35个引物组合后进行PCR扩增，选择出8个具有长穗偃麦草特异扩增的引物组合，这些引物组合分别属于ISSR/IRAP/REMAP 3类分子标记。基础引物的序列和具有长穗偃麦草特异片段扩增的引物组合分别见表1和表2。上述引物保存在扬州大学生物技术学院分子细胞遗传实验室。

表111条基础引物的序列

表2具有长穗偃麦草特异片段扩增的引物组合

实施例2基因组DNA的提取

利用SDS酚-氯仿法微量提取DNA。其步骤如下：

(1)取幼嫩叶片(约0.1g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用研磨棒碾碎至粉末状；

(2)离心管放置于室温稍冷却，加入700μl的缓冲液A，轻轻混匀，然后65℃水浴20min，期间每隔5min上下颠倒混匀一次；

缓冲液A：

ddH2O定容至1L灭菌后用。

(3)取出稍冷却至室温，加入苯酚和氯仿各350μl，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(4)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中；

(5)加入约750μl氯仿，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(6)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中；

(7)加入约560μl异丙醇，轻慢混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀；

(8)12000rpm，离心10min，弃去上清液；

(9)加500μl 70％的乙醇溶液洗涤两次，每次2-3min.室温晾干；

(10)晾干的DNA溶解于20μl TER中，37℃温浴45min.-20℃保存备用。

实施例3长穗偃麦草特异片段的PCR扩增

依据表1的基础引物组合后进行PCR扩增。PCR具体反应体系及反应程序见表3和表4。PCR反应结束后以6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物(图1)，各引物组合扩增的长穗偃麦草特异片段大小及特异染色体见表2。由于具备一整套中国春-长穗偃麦草二体附加系材料，因此可将扩增的特异片段进一步定位到不同的E染色体上。

表3PCR反应体系

表4PCR反应程序

实施例4长穗偃麦草特异扩增片段的回收

(1)用干净的刀片将含有特异扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶胶条从胶板上割下，放入1.5ml离心管中，加入TE_0.1200μl，浸泡30min，用移液枪去除液体，重复2次。

(2)加入200μl ddH₂O，浸泡30min，用移液枪去除液体。

(3)加入30μl ddH₂O，100℃水浴10min。

(4)将胶块捣碎，100℃水浴10min。

(5)3700rpm，离心15min，20μl的PCR反应体系中加入3μl上清液作为模板，采用相应引物相同PCR程序对其进行扩增。

(6)以割胶回收的条带为模板PCR扩增产物与首次PCR扩增得到的对应产物，同时进行1％琼脂糖凝胶检测，若两者的电泳迁移率相同，则割胶回收的条带为目的产物(图3)。

(7)将1％琼脂糖凝胶上证明正确的目的产物与pMD18/19-T载体(TaKaRa，Code：D102A)连接，具体步骤如下：在微量离心管中加入1μl的pMD18/19-T载体，加入0.1pmol至0.3pmol样品DNA，用ddH₂O定容至5μl。再加入5μl(等量)的Solution I。16℃反应30min，并且4℃过夜。

实施例5感受态大肠杆菌的制备和转化

氯化钙法制备感受态细胞(Bio Basic，No.BS525)

(1)取少量冻存菌株大肠杆菌(E.coli)DH5α，在LB平板培养基上进行划线培养，恒温培养箱(37℃)中培养16～20h。

(2)挑取一个单菌落，接种于含2ml SOB培养液中，恒温摇床(37℃，250rpm/min)上培养12～16h。

(3)接种1ml的培养物到500ml锥形瓶中(内含100ml SOC培养液)，恒温摇床(37℃，250rpm/min)上培养至OD₆₀₀≈0.35。

(4)迅速将培养物置于冰浴中20min，期间缓慢摇匀使内容物充分均匀冷却。同时将2个50ml离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。

(5)将细菌转移至预冷的离心管中，4℃，4000rpm离心15min，弃去上清液。

(6)用16ml的溶液A小心的悬浮细菌，冰上放置15min。

(7)4℃，4000rpm离心15min，收集菌体。

(8)用4ml溶液B重新悬浮细菌，分装，80μl/管，液氮速冻，-70℃保存。

(9)用于转化时，将100pg到10ng DNA加到感受态细胞(冰上溶解)中。

(10)细胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37℃培养5min或42℃培养90s，然后再次冰上放置2min。

(11)加入1ml SOC培养基，37℃温和摇动培养1h。

(12)在选择性培养基上涂布培养细胞，恒温培养箱(37℃)中培养12～16h。

实施例6菌落PCR

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测为单一目的条带后，连接到pMD19-T(TaKaRa，Code：D102A)载体上，然后转化入感受态大肠杆菌细胞中。将菌种接种到固体LB培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行菌落PCR。在96孔培养板孔中加入含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基30μl/孔，用灭菌枪头从转化平板上挑取一个白色菌落，在培养液中轻轻吹打几下，确保枪头上的菌体吹入培养液中，将培养板置于37℃培养箱30min。配制PCR反应母液，在另一块96孔板中，顺序加入预先准备的菌落液0.5μl和PCR反应母液9.5μl，将PCR板混匀离心后进行反应。将余下的菌落液放入4℃冰箱保存。PCR具体反应体系及反应程序见表5和表6。菌落PCR结果见图4。

表5菌落PCR反应体系

表6菌落PCR反应程序

实施例7长穗偃麦草染色体特异SCAR标记的建立

将表2引物组合特异扩增的DNA片段回收，菌落PCR后在阳性克隆中选择2～3个样品进行DNA测序。测序结果与网上已公布的小麦序列进行同源比对，保留无小麦同源序列的片段，用Primer Premier 5软件设计引物。经过序列比对后发现有8条与小麦无同源序列或只含有小部分同源序列，这8条特异序列命名为Z34-596(1E)、Z29-900(3E)、Z8-525(4E)、Z2-445(5E)、Z17-294(6E)、Z31-464(7E)、Z21-757(7E)、Z12-325(7E)，它们的序列分别如SEQ ID NO.28-35所示。以这8条特异序列为模板设计引物，对中国春小麦、二倍体长穗偃麦草和中国春-长穗偃麦草二体附加系以及中国春-长穗偃麦草二体置换系进行PCR扩增。

表7所示为依据ISSR/IRAP/REMAP技术扩增的8条源片段序列在不同区段所设计的新引物序列，这些引物能在二倍体长穗偃麦草和相对应的中国春-长穗偃麦草二体附加系以及代换系中扩增出与理论扩增片段大小一致的染色体特异片段(图5)。表明特异扩增的源片段成功地被转换为除2E外其他6条染色体的特异SCAR标记。以Z31-7E₂₁₅进一步扩增7ES和7EL的端体附加系，又能将这个标记进一步定位到7E染色体臂，图5表明引物Z31-7E₂₁₅只在7EL端体附加系中扩增出条带，即7E染色体长臂特异的SCAR标记。

本发明表示在长穗偃麦草中依据ISSR/IRAP/REMAP技术发展染色体特异分子标记示可行的。

表7.长穗偃麦草染色体特异SCAR标记及它们的引物序列

实施例8长穗偃麦草E染色体SCAR标记的稳定性

图5结果显示各染色体特异SCAR标记在附加系和相应染色体的代换系中都能扩增，表现了所发展的分子标记在不同材料中的染色体稳定性。稳定性除了不同材料的表现外，在不同世代间的表现对该标记的应用更重要。为了检测长穗偃麦草特异染色体标记在小麦背景中遗传的稳定性，将二体代换系与小麦品种进行杂交，利用开发出来的长穗偃麦草特异染色体SCAR标记来检测其杂交后代。

本发明选择了中国春-长穗偃麦草7E代换系(DS7E/7A)与普通小麦品种扬麦16分别进行正交(DS7E/7A×扬麦16)和反交，然后以F1代自交获得F2代。选择了7E染色体上的一个分子标记Z31-7E₂₁₅对杂交F1代、F2代、中国春、长穗偃麦草等材料进行扩增(图6，7)。从图中可以看出，杂交F1代无论是正交还是反交都能扩增出特异条带，而在F2代中，部分单株有扩增条带结果，部分单株没有，符合预期的孟德尔遗传的3∶1分离。此结果表明所获长穗偃麦草特异染色体SCAR标记在世代间的表现也是稳定的，可利用这些分子标记对长穗偃麦草染色体或染色体片段在世代间进行跟踪检测，为小麦染色体工程中外源偃麦草染色质的检测提供了便捷的分子标记。

Claims (2)

1.一种长穗偃麦草染色体特异标记，它是下列8对引物之一：

第1对：

L: 5’- GATGTCACCAAGCCCTAC -3’ （SEQ ID NO.12）

R: 5’- TCCTACGAAACACCCAAG -3’ （SEQ ID NO.13）；

第2对：

L: 5’-TCGCTCGCCCACTAC-3’ （SEQ ID NO.14）

R: 5’-GGTTCGGCCCATGTCTAT-3’ （SEQ ID NO.15）；

第3对：

L: 5’- TGTTGCCAGTGGAGGAAG -3’ （SEQ ID NO.16）

R: 5’- TTGAACTACTGAACCGAAT -3’ （SEQ ID NO.17）；

第4对：

L: 5’-ACAGTGAGCCCGAAGGAA-3’ （SEQ ID NO.18）

R: 5’-AACACCAGCGGACAAAGC-3’ （SEQ ID NO.19）；

第5对：

L: 5’- ATTGCTCTTAGGGCATAT -3’ （SEQ ID NO.20）

R: 5’- CTCTGTCTCGGTTGTTTC -3’ （SEQ ID NO.21）；

第6对：

L:5’-TGTCAACTCACGCCTACT-3’ （SEQ ID NO.22）

R:5’-CCCTGGGAATCTAATGTG-3’ （SEQ ID NO.23）；

第7对：

L:5’-GGTAACACCTAGATGGCACT-3’ （SEQ ID NO.24）

R: 5’-GGCACCCTAAACCCTAAT-3’ （SEQ ID NO.25）；

第8对：

L: 5’-TCCTTCAACTGCATTCCCTA-3’ （SEQ ID NO.26）

R: 5’-ATTGCTCGATTTCGGTGT-3’ （SEQ ID NO.27）。

2.权利要求1所述长穗偃麦草染色体特异标记在小麦抗赤霉病和抗逆性育种中的应用。

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