CN106222262A - 引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因nrt1.1b基因型中的应用 - Google Patents
引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因nrt1.1b基因型中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106222262A CN106222262A CN201610608955.4A CN201610608955A CN106222262A CN 106222262 A CN106222262 A CN 106222262A CN 201610608955 A CN201610608955 A CN 201610608955A CN 106222262 A CN106222262 A CN 106222262A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- primer
- rice
- oryza sativa
- genotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 121
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title claims abstract description 119
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 89
- 101150097623 1B gene Proteins 0.000 claims description 50
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 17
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 8
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000618 nitrogen fertilizer Substances 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 240000002582 Oryza sativa Indica Group Species 0.000 description 3
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RXKGHZCQFXXWFQ-UHFFFAOYSA-N 4-ho-mipt Chemical compound C1=CC(O)=C2C(CCN(C)C(C)C)=CNC2=C1 RXKGHZCQFXXWFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000642195 Homo sapiens Protein turtle homolog A Proteins 0.000 description 2
- 229930186657 Lat Natural products 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100033219 Protein turtle homolog A Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 239000003202 long acting thyroid stimulator Substances 0.000 description 2
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150012555 Nrt gene Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 230000003050 macronutrient Effects 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型中的应用。所述引物对包括上游引物和下游引物，序列为：上游引物：5’‑TGAAGATGAGCACTGGGCGA‑3’；下游引物：5’‑GTAGCGGCCGGTGTGTCGT‑3’。本发明引物对能够有效鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型，且使用PCR的方法与传统的测序等方法相比，检测速度快、成本低、操作简单。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型中的应用。
背景技术
氮素是水稻生长所必需的大量营养元素，对于水稻的生命活动及产量形成具有重要意义，能显著影响水稻的穗数及每穗的颗粒数，同时对稻米中蛋白质含量也有一定影响。水稻产量和氮肥的施用量不是简单的直线关系，氮肥的过量施用会造成一系列的生态环境问题，培育氮高效利用水稻品种是提高水稻产量的有效途径。
籼稻(indica)和粳稻(japonica)是亚洲栽培稻的两个主要亚种，两者相比，籼稻具有较高的氮肥利用率，产量相对较高。水稻中大约40％的氮是以硝酸盐的形式被吸收，研究表明水稻根系的泌氧特征可使土壤硝化细菌将大量的NH4 +氧化成为NO3 -，进而通过NO3 -的作用来调控水稻的生长发育，另外NO3 -的存在还可以促进水稻对NH4 +的吸收。植物对NO3 -的吸收系统包括高亲和力转运系统(high-affinity transport system，HATS)和低亲和力转运系统(low-affinity transport system，LATS)，研究表明LATS与NRT1家族蛋白对应，HATS与NRT2家族蛋白对应，目前已发现并定位的水稻NRT基因已有100余个，以NRT1家族居多。
近来我国科学家通过图位克隆方法从籼稻IR24中克隆了硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B，将籼型NRT1.1B基因导入粳稻，可使粳稻的氮肥利用率和产量获得较大的提高，在改良粳稻的氮肥利用率、提高产量方面具有重大的利用价值。研究表明，NRT1.1B基因在籼粳稻间一个碱基的变异(SNP1c.980C>T)导致相应氨基酸的改变(籼稻为甲硫氨酸，粳稻为苏氨酸)，从而导致籼粳稻硝酸盐吸收利用的差异。
在利用籼型NRT1.1B基因进行氮高效粳稻品种选育的过程中，其杂交或回交后代中会分离出该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出籼型NRT1.1B基因纯合或杂合的单株，用于随后进一步的回交或自交。由于在DNA编码序列上，籼型NRT1.1B基因和粳型NRT1.1B基因仅存在单个核苷酸的差异，在检测NRT1.1B基因时可利用四引物扩增受阻突变体系PCR(tera-primer ARMS-PCR)对该单核苷酸变异进行检测(如公开号为CN105112504A的中国专利文献所涉及的方法)，但是通过该方法需要用四条引物扩增，成本较高。另外，如果通过对PCR扩增产物进行直接测序的方法去检测NRT1.1B基因型，不仅耗时太长，而且成本较高。
因此，有必要开发水稻氮高效利用基因NRT1.1B的更简便的分子标记，将其用于氮高效利用基因NRT1.1B的分子鉴定，以达到缩短育种周期，简化操作步骤、降低检测成本等目的。
发明内容
本发明提供了一种引物对，使用该引物对可以简单方便地通过PCR方法来鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型。
引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，序列为：
上游引物：5’-TGAAGATGAGCACTGGGCGA-3’；
下游引物：5’-GTAGCGGCCGGTGTGTCGT-3’。
NRT1.1B基因在籼粳稻间一个碱基的变异(SNP1c.980C>T)导致相应氨基酸的改变，从而导致籼粳稻硝酸盐吸收利用的差异。根据粳稻NRT1.1B基因及籼稻NRT1.1B基因的基因组DNA序列比对发现，NRT1.1B基因包含1个内含子，粳稻NRT1.1B基因内含子全长2039bp，籼稻NRT1.1B基因内含子全长1984bp，两者相差55bp。在内含子序列中，籼型NRT1.1B基因(NRT1.1B-indica)与粳型NRT1.1B基因(NRT1.1B-japonica)存在6处插入/缺失区域，其中1～5区域表现为籼稻比粳稻缺失71bp，第6区域表现为粳稻比籼稻缺失16bp。本发明针对NRT1.1B-japonica及NRT1.1B-indica基因在内含子区域插入/缺失位点1～5存在的71bp的差异，设计出一引物对，其中上游引物NRT1.1B-F和下游引物NRT1.1B-R分别位于插入/缺失位点1～5的两侧。利用该引物对籼稻及粳稻品种的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增产物大小即可区分NRT1.1B基因是籼型、粳型或籼粳杂合型。
本发明又提供了所述的引物对在鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型中的应用。
本发明还提供了所述的引物对在制备鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻样品的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物进行电泳检测，
若电泳检测结果只在422bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合粳型NRT1.1B基因；
若电泳检测结果只在351bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合籼型NRT1.1B基因；
若电泳检测结果在422bp和351bp处均有特异性条带，则待检测水稻样品含有籼粳杂合型NRT1.1B基因。
提取DNA时，可以采用水稻的种子、叶片、根、花器等组织。对水稻DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。
所述PCR扩增的体系和条件影响鉴别的准确性。
优选的，所述PCR扩增的体系为：
优选的，所述PCR扩增条件为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共36个循环；72℃延伸10min。
由于本发明在设计时，产生的特异性片段的大小至少为351bp，因此，可采用一般的琼脂糖凝胶进行电泳分析即可，琼脂糖的浓度可以为1.5％。
本发明引物对能够有效鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型，且使用PCR的方法与传统的测序等方法相比，检测速度快、成本低、操作简单。
附图说明
图1为水稻粳型与籼型NRT1.1B基因片段的序列比对结果图；
图2为利用本发明引物对鉴别30个水稻品种的电泳结果图(水稻品种编号见表2)；
图3为利用本发明引物对鉴别3份籼粳杂交稻和20株秀水134/D12的杂交F5代的电泳结果图(9311：籼型NRT1.1B基因对照；NIP：粳型NRT1.1B基因对照；YY9：甬优9号；YY12：甬优12号；JJZK3：嘉优中科3号；1～20：20株秀水134/D12的杂交F5代单株)。
具体实施方式
实施例1
根据粳稻NRT1.1B基因(GenBank：CP012618)及籼稻NRT1.1B基因(GenBank：AP014966)的基因组DNA序列比对发现，NRT1.1B基因包含1个内含子，粳稻NRT1.1B基因内含子全长2039bp，籼稻NRT1.1B基因内含子全长1984bp，两者相差55bp。共包括5个插入/缺失位点，其中1～4位点表现为籼稻比粳稻缺失71bp，第5位点表现为粳稻比籼稻缺失16bp。
为验证粳稻NRT1.1B基因及籼稻NRT1.1B基因在内含子区域的插入/缺失位点，选取15个籼稻品种及15个粳稻品种(表2)，设计引物NRT1.1B-F1和NRT1.1B-O-F(引物序列见表1)，通过PCR将内含子区域及NRT1.1B基因的SNP位点(SNP1c.980C>T)进行扩增并测序。
15个籼稻常规稻品种为：IR64、IR24、嘉育938、嘉育253、嘉育293、金早47、中早39、湘晚籼17号、湘早籼32号、玉针香、黄华占、中嘉早17、嘉育89、特青及9311。
15个粳稻常规稻品种为：浙粳88、浙粳22、秀水134、秀水09、嘉58、徐稻5号、扬粳4227、淮稻5号、淮稻13号、连粳7号、武运粳8号、武运粳23号、南粳46、中花11及日本晴。
用于NRT1.1B基因的内含子及SNP位点序列PCR扩增反应体系为：
反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，共36个循环；72℃延伸10min；4℃保温5min。
通过PCR扩增获得2300bp左右的片段，将扩增片段测序后进行序列比对，发现15个籼稻品种中NRT1.1B基因及15个粳稻品种中NRT1.1B基因在序列上分别表现为完全一致，序列长度均相差55bp。进一步与NCBI数据库下载序列比对发现，本研究获得的籼型NRT1.1B基因与粳型NRT1.1B基因存在6处插入/缺失区域，其中1～5区域表现为籼稻比粳稻缺失71bp，第6区域表现为粳稻比籼稻缺失16bp。另外，通过测序还发现30个水稻品种在NRT1.1B-japonica/indica基因的SNP位点(SNP1c.980C>T)也表现一致，籼稻为碱基“T”，粳稻为碱基“C”。
如图1所示，本发明利用籼型NRT1.1B基因与粳型NRT1.1B基因在内含子序列中存在的6处插入/缺失位点中的1～5处位点存在的71bp的差异，设计开发了能够鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的引物对NRT1.1B-F和NRT1.1B-R(序列见表1)。该引物对扩增粳型NRT1.1B基因得到422bp片段，扩增籼型NRT1.1B基因得到351bp片段。
表1引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| NRT1.1B-F1 | 5’-CAGAGGATGCCACACAGCA-3’ |
| NRT1.1B-O-F | 5’-GATGGAGGCGATGACGGAAGA-3’ |
| NRT1.1B-F | 5’-TGAAGATGAGCACTGGGCGA-3’ |
| NRT1.1B-R | 5’-GTAGCGGCCGGTGTGTCGT-3’ |
实施例2
选取15个籼稻常规稻品种、15个粳稻常规稻品种、3个籼粳杂交稻品种及秀水134/D12杂交的高世代(F5)育种材料20个单株，对本发明的引物对NRT1.1B-F和NRT1.1B-R进行验证。
15个籼稻常规稻品种为：IR64、IR24、嘉育938、嘉育253、嘉育293、金早47、中早39、湘晚籼17号、湘早籼32号、玉针香、黄华占、中嘉早17、嘉育89、特青及9311；
15个粳稻常规稻品种为：浙粳88、浙粳22、秀水134、秀水09、嘉58、徐稻5号、扬粳4227、淮稻5号、淮稻13号、连粳7号、武运粳8号、武运粳23号、南粳46、中花11及日本晴；
3个籼粳杂交稻品种为：甬优9号(YY9)、甬优12号(YY12)及嘉优中科3号(JJZK3)；
20个高世代育种材料为：秀水134/D12杂交的高世代(F5)育种材料，D12为含有NRT1.1B基因的育种中间材料。
利用CTAB法提取上述水稻品系叶片的基因组DNA作为PCR扩增模板，PCR扩增聚合酶使用rTaq(Takara公司)。
PCR扩增体系为：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min，4℃保温5min。
使用1.5％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，鉴定：
若扩增出422bp的一条特异DNA片段，则表明待检测水稻样品含有纯合粳型NRT1.1B基因；
若扩增出351bp的一条特异DNA片段，则表明待检测水稻样品含有纯合籼型NRT1.1B基因；
若扩增出422bp及351bp的两条特异DNA片段，则表明待检测水稻样品含有籼粳杂合型NRT1.1B基因。
电泳检测结果见图2和表2。从图2可以看出，利用设计的引物对NRT1.1B-F和NRT1.1B-R分别对30个水稻品种的NRT1.1B基因进行检测，扩增结果表明，15个粳稻品种均扩增出422bp的片段，表现为纯合粳型NRT1.1B基因；15个籼稻品种均扩增出351bp的片段，表现为纯合籼型NRT1.1B基因。
另外，利用NRT1.1B基因标记对3份籼粳杂交稻及来自秀水134/D12的杂交后代高世代(F5)材料20株单株的DNA进行PCR扩增，结果所有样品均得到了有效扩增，其中3份籼粳杂交稻均表现为籼粳杂合型NRT1.1B基因；F2代个体中表现纯合籼型NRT1.1B基因单株有9株，纯合粳型NRT1.1B基因单株有7株，籼粳杂合型NRT1.1B基因单株有4株(图3)。
通过对30个水稻品种、3份籼粳杂交稻及20个F5代单株的NRT1.1B基因型检测，表明本研究获得的引物对NRT1.1B-F和NRT1.1B-R，可以快速、准确鉴定水稻NRT1.1B基因的纯合籼型、纯合粳型及杂合基因型，可应用于NRT1.1B基因的分子标记辅助育种。
表2 NRT1.1B基因型检测结果。
注：(+)表示纯合籼型NRT1.1B基因；(-)表示纯合粳型NRT1.1B基因。
Claims (6)
1.引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，序列为：
上游引物：5’-TGAAGATGAGCACTGGGCGA-3’；
下游引物：5’-GTAGCGGCCGGTGTGTCGT-3’。
2.如权利要求1所述的引物对在鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型中的应用。
3.如权利要求1所述的引物对在制备鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的试剂盒中的应用。
4.一种鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻样品的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物进行电泳检测，
若电泳检测结果只在422bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合粳型NRT1.1B基因；
若电泳检测结果只在351bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合籼型NRT1.1B基因；
若电泳检测结果在422bp和351bp处均有特异性条带，则待检测水稻样品含有籼粳杂合型NRT1.1B基因。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增条件为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共36个循环；72℃延伸10min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610608955.4A CN106222262B (zh) | 2016-07-27 | 2016-07-27 | 引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因nrt1.1b基因型中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610608955.4A CN106222262B (zh) | 2016-07-27 | 2016-07-27 | 引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因nrt1.1b基因型中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106222262A true CN106222262A (zh) | 2016-12-14 |
| CN106222262B CN106222262B (zh) | 2019-10-18 |
Family
ID=57535829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610608955.4A Active CN106222262B (zh) | 2016-07-27 | 2016-07-27 | 引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因nrt1.1b基因型中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106222262B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107130018A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-09-05 | 深圳兴旺生物种业有限公司 | 水稻氮素高效利用基因qngr9的检测方法与应用 |
| CN109811081A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-28 | 江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所 | 一种利用分子标记辅助选择氮高效粳稻的选育方法 |
| CN110129480A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-08-16 | 江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所 | 检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN114921460A (zh) * | 2022-05-27 | 2022-08-19 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 一种氮高效基因nrt1.1b的功能标记引物及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104277101A (zh) * | 2014-09-24 | 2015-01-14 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 水稻硝酸盐转运蛋白nrt1.1b在提高植物氮利用效率中的应用 |
| CN105112504A (zh) * | 2015-07-23 | 2015-12-02 | 毕节市农业科学研究所 | 一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法 |
-
2016
- 2016-07-27 CN CN201610608955.4A patent/CN106222262B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104277101A (zh) * | 2014-09-24 | 2015-01-14 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 水稻硝酸盐转运蛋白nrt1.1b在提高植物氮利用效率中的应用 |
| CN105112504A (zh) * | 2015-07-23 | 2015-12-02 | 毕节市农业科学研究所 | 一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ZHICHANG CHEN等: "Improving Nitrogen Use Efficiency in Rice through Enhancing Root Nitrate Uptake Mediated by a Nitrate Transporter, NRT1.1B", 《JOURNAL OF GENETICS AND GENOMICS》 * |
| 卢宝荣等: "籼稻和粳稻的高效分子鉴定方法及其在水稻育种和进化研究中的意义", 《自然科学进展》 * |
| 李军等: "水稻氮高效利用基因NRT1.1B InDel分子标记的开发与应用", 《分子植物育种》 * |
| 李军等: "水稻氮高效利用基因NRT1.1B对粳稻农艺性状的影响", 《分子植物育种》 * |
| 田孟祥等: "一种水稻高氮利用率NRT1.1B基因功能标记的开发与应用", 《分子植物育种》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107130018A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-09-05 | 深圳兴旺生物种业有限公司 | 水稻氮素高效利用基因qngr9的检测方法与应用 |
| CN109811081A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-28 | 江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所 | 一种利用分子标记辅助选择氮高效粳稻的选育方法 |
| CN110129480A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-08-16 | 江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所 | 检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN114921460A (zh) * | 2022-05-27 | 2022-08-19 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 一种氮高效基因nrt1.1b的功能标记引物及其应用 |
| CN114921460B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-11-17 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 一种氮高效基因nrt1.1b的功能标记引物及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106222262B (zh) | 2019-10-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103305510B (zh) | 稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9SNP及制备与应用 | |
| CN102154471B (zh) | 水稻籽粒长度主效qtl位点的分子标记方法 | |
| CN102031253A (zh) | 用一粒稻谷鉴定籼稻和粳稻的分子标记方法 | |
| CN106222262A (zh) | 引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因nrt1.1b基因型中的应用 | |
| CN109929945A (zh) | 甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF2604引物及其应用 | |
| CN104120126B (zh) | 与番茄雄性不育基因紧密连锁的srap分子标记及其获得方法 | |
| Gichuhi et al. | Characterization and QTL analysis of Oryza longistaminata introgression line, pLIA-1, derived from a cross between Oryza longistaminata and Oryza sativa (Taichung 65) under non-fertilized conditions | |
| CN103789419A (zh) | 鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用 | |
| CN104805081A (zh) | 一种小麦粒重分子标记及其应用 | |
| CN104673917B (zh) | 稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记及其方法与应用 | |
| CN110468229A (zh) | 水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1 | |
| CN110358861A (zh) | 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁分子标记R13I14 | |
| CN102690818B (zh) | 与谷子抽穗期基因紧密连锁的分子标记SIsv0832 | |
| CN105671039B (zh) | 大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1及其应用 | |
| CN109554498B (zh) | 一种鉴定单季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法 | |
| CN104313143B (zh) | 一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法 | |
| CN112941224A (zh) | 一种金针菇金6046菌种的ssr标记指纹图谱的鉴定方法及其构建方法与应用 | |
| CN106868189B (zh) | 用于鉴定春夏谷类型的引物对及其应用 | |
| CN105483281A (zh) | 一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的snp分子标记及其鉴定方法 | |
| CN105018479A (zh) | 与苎麻纤维强度紧密连锁的分子标记、获得方法及用途 | |
| CN111004857A (zh) | 大豆分枝数主效qtl位点的分子标记引物及其应用 | |
| CN114990251B (zh) | 与油菜甲基硒代半胱氨酸含量性状qtl紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| CN103789431A (zh) | 辅助筛选和培育抗条锈病小麦新品系的专用引物、试剂和试剂盒及其选育方法 | |
| CN105420235B (zh) | 黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的Indel标记及其应用 | |
| CN105316423B (zh) | 水稻品种光复粳抗黑条矮缩病位点qRBSDV18及其分子标记方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 314016 Shuangjiang, Wang Jiang Jing Town, Xiuzhou District, Jiaxing, Zhejiang Patentee after: Jiaxing Academy of Agricultural Sciences Address before: 314016 Shuangjiang, Wang Jiang Jing Town, Xiuzhou District, Jiaxing, Zhejiang Patentee before: Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, Zhejiang Province |