CN106222262A - 引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因nrt1.1b基因型中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型中的应用。所述引物对包括上游引物和下游引物，序列为：上游引物：5’‑TGAAGATGAGCACTGGGCGA‑3’；下游引物：5’‑GTAGCGGCCGGTGTGTCGT‑3’。本发明引物对能够有效鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型，且使用PCR的方法与传统的测序等方法相比，检测速度快、成本低、操作简单。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型中的应用。
背景技术
氮素是水稻生长所必需的大量营养元素，对于水稻的生命活动及产量形成具有重要意义，能显著影响水稻的穗数及每穗的颗粒数，同时对稻米中蛋白质含量也有一定影响。水稻产量和氮肥的施用量不是简单的直线关系，氮肥的过量施用会造成一系列的生态环境问题，培育氮高效利用水稻品种是提高水稻产量的有效途径。
籼稻(indica)和粳稻(japonica)是亚洲栽培稻的两个主要亚种，两者相比，籼稻具有较高的氮肥利用率，产量相对较高。水稻中大约40％的氮是以硝酸盐的形式被吸收，研究表明水稻根系的泌氧特征可使土壤硝化细菌将大量的NH4 +氧化成为NO3 -，进而通过NO3 -的作用来调控水稻的生长发育，另外NO3 -的存在还可以促进水稻对NH4 +的吸收。植物对NO3 -的吸收系统包括高亲和力转运系统(high-affinity transport system，HATS)和低亲和力转运系统(low-affinity transport system，LATS)，研究表明LATS与NRT1家族蛋白对应，HATS与NRT2家族蛋白对应，目前已发现并定位的水稻NRT基因已有100余个，以NRT1家族居多。
近来我国科学家通过图位克隆方法从籼稻IR24中克隆了硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B，将籼型NRT1.1B基因导入粳稻，可使粳稻的氮肥利用率和产量获得较大的提高，在改良粳稻的氮肥利用率、提高产量方面具有重大的利用价值。研究表明，NRT1.1B基因在籼粳稻间一个碱基的变异(SNP1c.980C>T)导致相应氨基酸的改变(籼稻为甲硫氨酸，粳稻为苏氨酸)，从而导致籼粳稻硝酸盐吸收利用的差异。
在利用籼型NRT1.1B基因进行氮高效粳稻品种选育的过程中，其杂交或回交后代中会分离出该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出籼型NRT1.1B基因纯合或杂合的单株，用于随后进一步的回交或自交。由于在DNA编码序列上，籼型NRT1.1B基因和粳型NRT1.1B基因仅存在单个核苷酸的差异，在检测NRT1.1B基因时可利用四引物扩增受阻突变体系PCR(tera-primer ARMS-PCR)对该单核苷酸变异进行检测(如公开号为CN105112504A的中国专利文献所涉及的方法)，但是通过该方法需要用四条引物扩增，成本较高。另外，如果通过对PCR扩增产物进行直接测序的方法去检测NRT1.1B基因型，不仅耗时太长，而且成本较高。
因此，有必要开发水稻氮高效利用基因NRT1.1B的更简便的分子标记，将其用于氮高效利用基因NRT1.1B的分子鉴定，以达到缩短育种周期，简化操作步骤、降低检测成本等目的。
发明内容
本发明提供了一种引物对，使用该引物对可以简单方便地通过PCR方法来鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型。
引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，序列为：
上游引物：5’-TGAAGATGAGCACTGGGCGA-3’；
下游引物：5’-GTAGCGGCCGGTGTGTCGT-3’。
NRT1.1B基因在籼粳稻间一个碱基的变异(SNP1c.980C>T)导致相应氨基酸的改变，从而导致籼粳稻硝酸盐吸收利用的差异。根据粳稻NRT1.1B基因及籼稻NRT1.1B基因的基因组DNA序列比对发现，NRT1.1B基因包含1个内含子，粳稻NRT1.1B基因内含子全长2039bp，籼稻NRT1.1B基因内含子全长1984bp，两者相差55bp。在内含子序列中，籼型NRT1.1B基因(NRT1.1B-indica)与粳型NRT1.1B基因(NRT1.1B-japonica)存在6处插入/缺失区域，其中1～5区域表现为籼稻比粳稻缺失71bp，第6区域表现为粳稻比籼稻缺失16bp。本发明针对NRT1.1B-japonica及NRT1.1B-indica基因在内含子区域插入/缺失位点1～5存在的71bp的差异，设计出一引物对，其中上游引物NRT1.1B-F和下游引物NRT1.1B-R分别位于插入/缺失位点1～5的两侧。利用该引物对籼稻及粳稻品种的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增产物大小即可区分NRT1.1B基因是籼型、粳型或籼粳杂合型。
本发明又提供了所述的引物对在鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型中的应用。
本发明还提供了所述的引物对在制备鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻样品的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物进行电泳检测，
若电泳检测结果只在422bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合粳型NRT1.1B基因；
若电泳检测结果只在351bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合籼型NRT1.1B基因；
若电泳检测结果在422bp和351bp处均有特异性条带，则待检测水稻样品含有籼粳杂合型NRT1.1B基因。
提取DNA时，可以采用水稻的种子、叶片、根、花器等组织。对水稻DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。
所述PCR扩增的体系和条件影响鉴别的准确性。
优选的，所述PCR扩增的体系为：
优选的，所述PCR扩增条件为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共36个循环；72℃延伸10min。
由于本发明在设计时，产生的特异性片段的大小至少为351bp，因此，可采用一般的琼脂糖凝胶进行电泳分析即可，琼脂糖的浓度可以为1.5％。
本发明引物对能够有效鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型，且使用PCR的方法与传统的测序等方法相比，检测速度快、成本低、操作简单。
附图说明
图1为水稻粳型与籼型NRT1.1B基因片段的序列比对结果图；
图2为利用本发明引物对鉴别30个水稻品种的电泳结果图(水稻品种编号见表2)；
图3为利用本发明引物对鉴别3份籼粳杂交稻和20株秀水134/D12的杂交F5代的电泳结果图(9311：籼型NRT1.1B基因对照；NIP：粳型NRT1.1B基因对照；YY9：甬优9号；YY12：甬优12号；JJZK3：嘉优中科3号；1～20：20株秀水134/D12的杂交F5代单株)。
具体实施方式
实施例1
根据粳稻NRT1.1B基因(GenBank：CP012618)及籼稻NRT1.1B基因(GenBank：AP014966)的基因组DNA序列比对发现，NRT1.1B基因包含1个内含子，粳稻NRT1.1B基因内含子全长2039bp，籼稻NRT1.1B基因内含子全长1984bp，两者相差55bp。共包括5个插入/缺失位点，其中1～4位点表现为籼稻比粳稻缺失71bp，第5位点表现为粳稻比籼稻缺失16bp。
为验证粳稻NRT1.1B基因及籼稻NRT1.1B基因在内含子区域的插入/缺失位点，选取15个籼稻品种及15个粳稻品种(表2)，设计引物NRT1.1B-F1和NRT1.1B-O-F(引物序列见表1)，通过PCR将内含子区域及NRT1.1B基因的SNP位点(SNP1c.980C>T)进行扩增并测序。
15个籼稻常规稻品种为：IR64、IR24、嘉育938、嘉育253、嘉育293、金早47、中早39、湘晚籼17号、湘早籼32号、玉针香、黄华占、中嘉早17、嘉育89、特青及9311。
15个粳稻常规稻品种为：浙粳88、浙粳22、秀水134、秀水09、嘉58、徐稻5号、扬粳4227、淮稻5号、淮稻13号、连粳7号、武运粳8号、武运粳23号、南粳46、中花11及日本晴。
用于NRT1.1B基因的内含子及SNP位点序列PCR扩增反应体系为：
反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，共36个循环；72℃延伸10min；4℃保温5min。
通过PCR扩增获得2300bp左右的片段，将扩增片段测序后进行序列比对，发现15个籼稻品种中NRT1.1B基因及15个粳稻品种中NRT1.1B基因在序列上分别表现为完全一致，序列长度均相差55bp。进一步与NCBI数据库下载序列比对发现，本研究获得的籼型NRT1.1B基因与粳型NRT1.1B基因存在6处插入/缺失区域，其中1～5区域表现为籼稻比粳稻缺失71bp，第6区域表现为粳稻比籼稻缺失16bp。另外，通过测序还发现30个水稻品种在NRT1.1B-japonica/indica基因的SNP位点(SNP1c.980C>T)也表现一致，籼稻为碱基“T”，粳稻为碱基“C”。
如图1所示，本发明利用籼型NRT1.1B基因与粳型NRT1.1B基因在内含子序列中存在的6处插入/缺失位点中的1～5处位点存在的71bp的差异，设计开发了能够鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的引物对NRT1.1B-F和NRT1.1B-R(序列见表1)。该引物对扩增粳型NRT1.1B基因得到422bp片段，扩增籼型NRT1.1B基因得到351bp片段。
表1引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| NRT1.1B-F1 | 5’-CAGAGGATGCCACACAGCA-3’ |
| NRT1.1B-O-F | 5’-GATGGAGGCGATGACGGAAGA-3’ |
| NRT1.1B-F | 5’-TGAAGATGAGCACTGGGCGA-3’ |
| NRT1.1B-R | 5’-GTAGCGGCCGGTGTGTCGT-3’ |
实施例2
选取15个籼稻常规稻品种、15个粳稻常规稻品种、3个籼粳杂交稻品种及秀水134/D12杂交的高世代(F5)育种材料20个单株，对本发明的引物对NRT1.1B-F和NRT1.1B-R进行验证。
15个籼稻常规稻品种为：IR64、IR24、嘉育938、嘉育253、嘉育293、金早47、中早39、湘晚籼17号、湘早籼32号、玉针香、黄华占、中嘉早17、嘉育89、特青及9311；
15个粳稻常规稻品种为：浙粳88、浙粳22、秀水134、秀水09、嘉58、徐稻5号、扬粳4227、淮稻5号、淮稻13号、连粳7号、武运粳8号、武运粳23号、南粳46、中花11及日本晴；
3个籼粳杂交稻品种为：甬优9号(YY9)、甬优12号(YY12)及嘉优中科3号(JJZK3)；
20个高世代育种材料为：秀水134/D12杂交的高世代(F5)育种材料，D12为含有NRT1.1B基因的育种中间材料。
利用CTAB法提取上述水稻品系叶片的基因组DNA作为PCR扩增模板，PCR扩增聚合酶使用rTaq(Takara公司)。
PCR扩增体系为：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min，4℃保温5min。
使用1.5％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，鉴定：
若扩增出422bp的一条特异DNA片段，则表明待检测水稻样品含有纯合粳型NRT1.1B基因；
若扩增出351bp的一条特异DNA片段，则表明待检测水稻样品含有纯合籼型NRT1.1B基因；
若扩增出422bp及351bp的两条特异DNA片段，则表明待检测水稻样品含有籼粳杂合型NRT1.1B基因。
电泳检测结果见图2和表2。从图2可以看出，利用设计的引物对NRT1.1B-F和NRT1.1B-R分别对30个水稻品种的NRT1.1B基因进行检测，扩增结果表明，15个粳稻品种均扩增出422bp的片段，表现为纯合粳型NRT1.1B基因；15个籼稻品种均扩增出351bp的片段，表现为纯合籼型NRT1.1B基因。
另外，利用NRT1.1B基因标记对3份籼粳杂交稻及来自秀水134/D12的杂交后代高世代(F5)材料20株单株的DNA进行PCR扩增，结果所有样品均得到了有效扩增，其中3份籼粳杂交稻均表现为籼粳杂合型NRT1.1B基因；F2代个体中表现纯合籼型NRT1.1B基因单株有9株，纯合粳型NRT1.1B基因单株有7株，籼粳杂合型NRT1.1B基因单株有4株(图3)。
通过对30个水稻品种、3份籼粳杂交稻及20个F5代单株的NRT1.1B基因型检测，表明本研究获得的引物对NRT1.1B-F和NRT1.1B-R，可以快速、准确鉴定水稻NRT1.1B基因的纯合籼型、纯合粳型及杂合基因型，可应用于NRT1.1B基因的分子标记辅助育种。
表2 NRT1.1B基因型检测结果。
注：(+)表示纯合籼型NRT1.1B基因；(-)表示纯合粳型NRT1.1B基因。
Claims (6)
1.引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，序列为：
上游引物：5’-TGAAGATGAGCACTGGGCGA-3’；
下游引物：5’-GTAGCGGCCGGTGTGTCGT-3’。
2.如权利要求1所述的引物对在鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型中的应用。
3.如权利要求1所述的引物对在制备鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的试剂盒中的应用。
4.一种鉴别水稻氮高效利用基因NRT1.1B基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻样品的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物进行电泳检测，
若电泳检测结果只在422bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合粳型NRT1.1B基因；
若电泳检测结果只在351bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合籼型NRT1.1B基因；
若电泳检测结果在422bp和351bp处均有特异性条带，则待检测水稻样品含有籼粳杂合型NRT1.1B基因。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增条件为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共36个循环；72℃延伸10min。
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