CN104313143B - 一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法 - Google Patents

一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法。该分子标记由SEQ？ID？No.1所示和SEQ？ID？No.2所示的DNA分子组成。结果表明：采用此分子标记对待测普通菜豆的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增产物的大小可以有效检测出待测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病。该方法将会加速抗炭疽病新品种的选育进程，提高抗病育种效率、減少农药防治炭疽病造成的环境污染，同时节约种植成本，具有明显的经济效益、生态效益。

Description

一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法。
背景技术
普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)是全世界重要的食用豆类之一，含有丰富的蛋白质、淀粉、矿物质和多种维生素等。普通菜豆作为我国主要的杂粮作物，种植区域广泛，但是在生产上经常受到菜豆炭疽病的危害，炭疽病病原菌通过种子进而侵染植株整个地上部分，危害菜豆的叶片、茎、荚等，在冷凉潮湿的环境下尤为严重，减产30％～90％，流行年份植株萎蔫枯死，严重影响着普通菜豆的品质和产量。迄今为止，已经定位到20个炭疽病基因或QTL，但是缺乏有效应用于抗病育种的分子标记。因此，发掘抗病资源、开发抗病标记和克隆抗病基因对于提高菜豆的产量具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物对。
本发明提供的用于检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物对由SEQIDNo.1所示和SEQIDNo.2所示的DNA分子组成。
上述所述的引物对在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的试剂盒。
本发明提供的试剂盒包含上述所述的引物对。
上述所述的试剂盒在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用也是本发明的保护范围。
本发明最后一个目的是提供一种检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的方法。
上述所述的检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的方法包括如下步骤：
(1)提取待测普通菜豆的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，采用SEQIDNo.1所示和SEQIDNo.2所示的DNA分子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；若扩增产物大小为273bp，则待检测的普通菜豆为抗炭疽病；若扩增产物大小为406bp，则表明待测的普通菜豆为感炭疽病。
上述方法中，所述抗炭疽病为病情指数小于等于60，所述感炭疽病为病情指数大于60。
上述方法中，所述病情指数按照现有技术常规方法得到，具体可按如下方法得到：
DI＝∑(Ci×Ni)/9N，其中DI为病情指数；Ci为单株发病级别；Ni为各级别植株数；N为总株数。单株发病级别分为6级：0级，全株无症状表现；1级，叶片上有针尖大小病斑；3级，叶片上病斑面积小于10％；5级，叶片上病斑面积小于25％；7级，叶片上病斑面积50％；9级，叶片萎蔫枯死。
根据病情指数将普通菜豆对炭疽病的抗性划分为5个等级：高抗(HR)(病情指数≤2.0)；抗(R)(2.0<病情指数≤15.0)；中抗(MR)(15.0<病情指数≤60.0)；感(S)(60.0<病情指数≤80.0)；高感(HS)(病情指数>80.0)。
上述所述的方法在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法。结果表明：采用分子标记SNP+In/Del/Pro7对待测普通菜豆的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增产物的大小可以有效检测出待测普通菜豆的抗感炭疽病品种。该方法将会加速抗炭疽病新品种的选育进程，提高抗病育种效率、減少农药防治炭疽病造成的环境污染，同时节约种植成本，具有明显的经济效益、生态效益。
附图说明
图1为SNP+In/Del/Pro7标记引物对两个亲本红芸豆和京豆扩增产物测序后的序列比对结果。
图2为SNP+In/Del/Pro7标记在杂交组合F00002322×F00005600的F2分离群体中的扩增。
图3为SNP+In/Del/Pro7标记在普通菜豆10份抗病材料和8份感病材料中的扩增。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、分子标记SNP+In/Del/Pro7的获得
1、供试材料
普通菜豆高抗炭疽病种质红芸豆，统一编号：F00002322；感炭疽病种质京豆，统一编号：F00000777；以及其杂交F2:3群体。以上材料均来源于中国农业科学院作物科学研究所，在文献“MingliChen,JingWu,LanfengWang,XiaoyanZhang,MatthewW.Blair,JizengJia,ShuminWang.Developmentofmappedsimplesequencerepeatmarkersfromcommonbean(PhaseolusvulgarisL.)basedongenomesequencesofaChineselandraceanddiversityevaluation.Molecularbreeding201433:489-496”中公开过。
2、普通菜豆对炭疽病抗性鉴定
对亲本F00002322、F00000777及1,092个F2:3家系(每个F2:3家系取30粒种子)植株播种后，待植株三出复叶完全展开时，采用高压喷雾接种法对整株进行苗期接种鉴定。于人工气候室温度20～22℃，湿度95～100％条件下培养，7天后调查发病情况。
利用F2:3家系抗病表型推测F2群体的基因型。每个F2:3家系的30个单株表现全部抗病，对应F2单株基因型与母本一致；30个单株表现全部感病，对应F2单株基因型与父本一致；30个单株表现抗、感分离，对应F2单株基因型为杂合型。
3、SSR标记与抗病基因的连锁分析
根据初步的定位结果，参照普通菜豆基因组序列(http://www.phytozome.net/search.php)，利用PrimerPremier5.0软件在候选区段共开发了282对SSR分子标记。分别以抗、感病亲本及分离群体中的抗、感池DNA为模板，筛选282对SSR分子标记发现，其中32对标记在抗、感病亲本及分离群体中的抗、感池DNA中同时表现多态性。
利用32对多态性引物对群体进行遗传作图分析，利用软件Mapmarker3.0中Kosambi法计算位点间的距离，分析位于SSR标记与F2群体单株基因型间遗传连锁关系；MapDrawV2.1软件进行连锁图谱绘制。结果显示：标记PSSR0771和PSSR0869与基因Co-2322紧密连锁，标记之间的位置PSSR0771-Co-2322-PSSR0869，遗传距离分别为0.2cM和0.4cM。
4、筛选与抗炭疽病基因共分离的分子标记
进一步将标记PSSR0771和PSSR0869序列搜索普通菜豆全基因组序列数据库(http://www.phytozome.net/search.php)，显示两个标记之间的序列长度为76,622bp，依据76,622bp的序列设计特异性标记在抗、感亲本中进行序列扩增，基于序列差异开发了3个In/Del标记Clp-N1、TF1、Plc1用于精细定位(表1)。
表1、In/Del分子标记序列
为了明确上述3个In/Del分子标记与抗病基因Co-2322的连锁关系，将标记进一歩检测244个F2:3感病家系对应的F2群体中重组单株，Clp-N1检测到2个重组单株，TF1和Plc1各检测到1个重组单株，根据标记在染色体上的位置，构建Co-2322基因区段的物理图，将目的基因Co-2322定位在46,620bp的范围内，该区段内包含候选基因GENE1、GENE2、GENE3和GENE4。
利用特异性引物分析抗病亲本F00002322和感病亲本F00000777中GENE2基因的启动子(ATG上游约2kb)。克隆测序分析比对发现，F00002322和F00000777启动子序列存在明显差异。利用启动子序列差异位点开发分子标记：上游引物序列：5’-CTCTTGCCTCGCACCTTC-3’(如序列表中SEQIDNo.1所示)；下游引物序列：5’-TTCAGAGCCATTCCCATT-3’(如序列表中SEQIDNo.2所示)，并将其命名为SNP+In/Del/Pro7。
利用红芸豆(抗炭疽病)和京豆(感炭疽病)检测SNP+In/Del/Pro7标记。结果表明：SNP+In/Del/Pro7标记在红芸豆的基因组DNA扩增产物为273bp，在京豆的基因组DNA扩增产物为406bp，通过对上述两个亲本的PCR产物回收、纯化、测序和序列分析，SNP+In/Del/Pro7标记在两个亲本中存在10个SNP多态性位点、141个插入/缺失位点。如图1所示。
实施例2、分子标记SNP+In/Del/Pro7的验证
抗性鉴定结果表明：普通菜豆Michelite，统一编号：F00005600，来源于中国农业科学院作物科学研究所，对炭疽菌81号小种表现高感特性。本研究利用高抗炭疽病品种F00002322与高感病品种F00005600构建杂交组合，通过鉴定杂交组合F2分离群体单株的抗性表型与基因型的一致性，进一步对标记SNP+In/Del/Pro7进行验证。具体步骤如下：
1、将普通菜豆杂交组合F00002322×F00005600的F2代种子单粒播种于营养钵中，待三出复叶完全展开时，采集一片三出复叶以提取基因组DNA，隔天后对植株接种菜豆炭疽菌，适宜环境下培养，10天后鉴定植株表型。单株病情分为6级：0级，全株无症状表现；1级，叶片上有针尖大小病斑；3级，叶片上病斑面积小于10％；5级，叶片上病斑面积小于25％；7级，叶片上病斑面积50％；9级，叶片萎蔫枯死。选取表型为7级和9级的单株DNA作为共分离标记鉴定模板，分析标记SNP+In/Del/Pro7基因型。
2、采用改良的CTAB方法提取叶片的基因组DNA，以获得的DNA为模板，按下列反应体系进行PCR。
PCR反应体系为：100ng基因组DNA模板、400μMdNTPs、10×PCRbuffer、各0.5μM上下游引物，1.5UTaqDNA聚合酶，补纯水至20uL。
PCR扩增程序为:95℃4min；94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃10min；10℃冷却10min，结束反应。PCR反应在ABIVERITI热循环仪中进行，扩增产物加入指示剂(0.25％溴酚蓝、40％蔗糖水溶液)后用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶成像系统拍照后保存。
3、结果如图2所示，其中M：Marker；1：F00005600；2～16：表型为7级和9级的F2单株基因型。结果表明：标记SNP+In/Del/Pro7对F00002322×F00005600的F2代感病单株扩增条带均与感病材料F00005600带型一致(图2)，进一步证明标记SNP+In/Del/Pro7能够用于Co-2322基因的检测。
实施例3、分子标记SNP+In/Del/Pro7对普通菜豆抗感材料的标记基因型分析
本试验用于检测标记的10份抗病资源、8份感病资源均由中国农业科学院作物科学研究所提供，在文献“王坤.普通菜豆抗炭疽病基因的分子标记与定位研究.中国农业科学院,2008.”中公开过。
病情指数的计算方法和根据病情指数将菜豆对炭疽病的抗性进行划分的方法均参照文献“王坤.普通菜豆抗炭疽病基因的分子标记与定位研究.中国农业科学院,2008.”中的方法。
根据单株调查结果，利用公式DI＝∑(Ci×Ni)/9N计算病情指数，其中DI为病情指数；Ci为单株发病级别，单株发病分级与实例2中群体F00002322×F00005600的F2代单株病情调查标准一致；Ni为各级别植株数；N为总株数。
根据病情指数将菜豆对炭疽病的抗性划分为5个等级：高抗(HR)(病情指数≤2.0)；抗(R)(2.0<病情指数≤15.0)；中抗(MR)(15.0<病情指数≤60.0)；感(S)(60.0<病情指数≤80.0)；高感(HS)(病情指数>80.0)。
表2、供试普通菜豆的种质信息
注：CIAT，国际热带农业研究中心(哥伦比亚)；A，代表安第斯基因库；MA，代表中美基因库
利用改良的CTAB法提取10份抗病材料和8份感病材料基因组DNA，用标记SNP+In/Del/Pro7进行基因组扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，结果如图3所示，其中M：Marker；1～10：抗炭疽病材料；11～18：感炭疽病材料。
结果表明：10份抗病材料的扩增条带与F00002322一致，扩增产物为273bp；8份感病材料的扩增条带与F00000777的完全一致，扩增产物为406bp，说明标记SNP+In/Del/Pro7能够有效的检测普通菜豆炭疽病资源。

Claims (6)

1.一种用于检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物对；
所述引物对由SEQIDNo.1所示和SEQIDNo.2所示的DNA分子组成。
2.权利要求1所述的引物对在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用。
3.一种检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物对。
4.权利要求3所述的试剂盒在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用。
5.一种检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测普通菜豆的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，采用SEQIDNo.1所示和SEQIDNo.2所示的DNA分子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；若扩增产物大小为273bp，则待检测的普通菜豆为抗炭疽病品种；若扩增产物大小为406bp，则表明待测的普通菜豆为感炭疽病品种。
6.权利要求5所述的方法在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用。
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