CN114921460A - 一种氮高效基因nrt1.1b的功能标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物，包括记引物NRT1.1B‑Caps‑F和引物NRT1.1B‑Caps‑R，核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑2所示，还提供了应用，用于分辨水稻NRT1.1B的基因型，对氮高效等位基因NRT1.1B和氮低效等位基因nrt1.1b进行区分。本发明可快速分辨水稻NRT1.1B的基因型。
Description
技术领域
本发明属于水稻基因型鉴定技术领域，具体涉及一种氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物及其应用。
背景技术
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，稻米产量在我国粮食供给侧发挥着举足轻重的作用。化肥能显著提高水稻产量高达40～50％，其中尤以氮肥的贡献率最大，最为直接。在稻米生产中习惯性多施、重施氮肥，这一方面在一定范围内显著提高了水稻单产，对保障粮食安全起到了积极的作用；然而，另一方面，过量施用氮肥也造成生产成本不断提高、土壤板结、水体富营养化等一系列的生态问题和社会问题。因此，提高水稻品种的氮肥利用效率进而减少农业生产中的氮肥施用量，对降低农产品生产成本、保护生态环境，以及实现农业可持续高质量发展均具有重要意义。
水稻的氮素利用效率是一个受多基因控制的复杂数量性状，通过定位和聚合氮高效基因，培育具有较高氮吸收和利用能力的水稻品种，是提高水稻氮肥利用效率的最经济、最直接有效的途径。前期，我国科学家在籼稻品种中克隆了提高水稻氮素利用的主效基因NRT1.1B，其编码一个硝酸盐转运蛋白，能增加硝酸盐从根向茎的运输能力，以及上调硝酸盐应答相关基因的表达，进而显著提高硝酸盐利用效率和水稻产量，设计开发NRT1.1B基因的功能标记，能极大地便利在种质资源中进行氮高效等位基因NRT1.1B的筛选鉴定，同时可以助力分子标记辅助培育氮高效水稻品种。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物及其应用，该氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物可快速分辨水稻NRT1.1B的基因型。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物，所述氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物包括记引物NRT1.1B-Caps-F和引物NRT1.1B-Caps-R，所述引物NRT1.1B-Caps-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物NRT1.1B-Caps-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了上述的氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物的应用，所述氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物用于分辨水稻NRT1.1B的基因型，对氮高效等位基因NRT1.1B和氮低效等位基因nrt1.1b进行区分；
所述氮高效等位基因NRT1.1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述氮低效等位基因nrt1.1b的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物用于分辨水稻NRT1.1B的基因型，对氮高效等位基因NRT1.1B和氮低效等位基因nrt1.1b进行区分的方法为：
S1、提取水稻叶片的DNA，得到待测基因组DNA；
S2、将S1中得到的待测基因组DNA用引物NRT1.1B-Caps-F和引物NRT1.1B-Caps-R进行PCR扩增，得到PCR产物；
所述PCR扩增的反应体系为：T3 Super PCR Mix 17μL、10μM的引物NRT1.1B-Caps-F 1μL、10μM的引物NRT1.1B-Caps-R 1μL、待测基因组DNA 1μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸5s，共34个循环；72℃延伸3min，12℃2min；
S3、对S2中得到的PCR产物用SalI内切酶在温度为37℃的条件下进行酶切反应3h～6h，将酶切后的PCR产物进行电泳，电泳得到大小为26bp和140bp的条带的对应的水稻具有氮低效等位基因nrt1.1b，电泳得到大小为162bp的条带的对应的水稻具有氮高效等位基因NRT1.1B；
所述酶切反应体系为：PCR产物2μL、SalI内切酶0.2μL、cutsmart buffer 1μL、ddH2O 6.8μL。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明是根据氮高效基因NRT1.1B的功能变异位点设计的功能标记，相较于连锁标记检测结果更加准确真实；本发明对实验室条件要求低，可及性较强，只需简单PCR扩增、酶切和电泳检测，即可快速分辨NRT1.1B的基因型，无需昂贵的检测仪器和荧光试剂，适用性更广。本发明属于共显性功能标记，相较于显性标记，不会出现假阴性的结果。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1的用氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物对水稻品种PCR扩增后的电泳图。
图2是本发明实施例1的用氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物对水稻品种PCR扩增后酶切后的电泳图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物，所述氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物包括记引物NRT1.1B-Caps-F和引物NRT1.1B-Caps-R，所述引物NRT1.1B-Caps-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物NRT1.1B-Caps-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本实施例还提供了上述的氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物的应用，所述氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物用于分辨水稻NRT1.1B的基因型，对氮高效等位基因NRT1.1B和氮低效等位基因nrt1.1b进行区分；
所述氮高效等位基因NRT1.1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述氮低效等位基因nrt1.1b的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物用于分辨水稻NRT1.1B的基因型，对氮高效等位基因NRT1.1B和氮低效等位基因nrt1.1b进行区分的方法为：
S1、提取水稻叶片的DNA，得到待测基因组DNA；
DNA提取均采用TPS抽提法，稍作修改，具体步骤如下：
(1)取水稻幼嫩的新鲜叶片1cm装入2mL离心管中，加入1mL TPS抽提液，放入一颗有磁性的钢珠，盖紧盖子后放入磨样机中研磨2次，每次50s；
(2)用磁铁吸出离心管中的钢珠，将离心管放入75℃的水浴锅中水浴加热30min；
(3)冷却后12600rpm离心10min，转移上清液600μL至新的1.5mL离心管中，加入600μL氯仿溶液并震荡混匀，待分层后13000rpm离心5min；
(4)吸上清液约500μL至新的1.5mL离心管中，加入1mL预冷的无水乙醇，上下轻柔混匀10次，放于-30℃冰箱中30min；
(5)取出冷冻的样品，12600rpm离心10min，倒掉上清液，倒扣晾干过夜；
(6)加入200μL ddH2O，放入摇床摇1-2h溶解；
S2、将S1中得到的待测基因组DNA用引物NRT1.1B-Caps-F和引物NRT1.1B-Caps-R进行PCR扩增，得到PCR产物；
所述PCR扩增的反应体系为：T3 Super PCR Mix 17μL、10μM的引物NRT1.1B-Caps-F 1μL、10μM的引物NRT1.1B-Caps-R 1μL、待测基因组DNA 1μL；所述T3 Super PCR Mix，市购，购于北京擎科生物科技有限公司；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸5s，共34个循环；72℃延伸3min，12℃2min；
S3、对S2中得到的PCR产物用SalI内切酶在温度为37℃的条件下进行酶切反应3h～6h，将酶切后的PCR产物进行电泳，电泳得到大小为26bp和140bp的条带的对应的水稻具有氮低效等位基因nrt1.1b，电泳得到大小为162bp的条带的对应的水稻具有氮高效等位基因NRT1.1B；
所述酶切反应体系为：PCR产物2μL、SalI内切酶0.2μL、cutsmart buffer 1μL、ddH2O 6.8μL。
本实施例中氮低效等位基因nrt1.1b扩增产物会包含一个限制性内切酶SalI的酶切位点“GTCGAC”，扩增产物可以被SalI酶切成26bp和140bp两段；而氮高效等位基因NRT1.1B的扩增产物相应位点为“GTCGAT”，不能被SalI识别和酶切，酶切后扩增产物仍是162bp；因此可以通过电泳酶切后的扩增产物变化，来区分NRT1.1B位点的不同等位基因。
(一)利用本实施例的的功能标记引物NRT1.1B-Caps-F和引物NRT1.1B-Caps-R扩增IR24,华占，华恢305，稻花香2号，博A，9311，垦稻12A，春江23A，中花11，R498，IAPAR9，Lemont，Khazar，Basmati，苏御糯，BG367，中4188，Amol3，华粳籼74，金农丝苗，广恢1380，19香，广恢油香等23个来源广泛的水稻品种，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，均能扩增出长度为162bp的产物(图1)。
图1中第1泳道和第25泳道为marker，2～24泳道分别为IR24,华占，华恢305，稻花香2号，博A，9311，垦稻12A，春江23A，中花11，R498，IAPAR9，Lemont，Khazar，Basmati，苏御糯，BG367，中4188，Amol3，华粳籼74，金农丝苗，广恢1380，19香，广恢油香。
(二)利用本实施例的的功能标记引物NRT1.1B-Caps-F和引物NRT1.1B-Caps-R扩增IR24,华占，华恢305，稻花香2号，博A，9311，垦稻12A，春江23A，中花11，R498，IAPAR9，Lemont，Khazar，Basmati，苏御糯，BG367，中4188，Amol3，华粳籼74，金农丝苗，广恢1380，19香，广恢油香的产物经SalI酶切后电泳，结果如图2所示，稻花香2号，垦稻12A，春江23A，中花11，IAPAR9，Lemont，Khazar，Basmati，苏御糯9个品种的扩增产物可以被SalI酶切成26bp和140bp的两条带，因此这9个材料的基因型为氮低效的nrt1.1b等位基因；其余材料的扩增产物不能被SalI酶切，属于氮高效的NRT1.1B等位基因类型。
图2中第1泳道和第25泳道为marker，2～24泳道分别为酶切后的扩增产物IR24,华占，华恢305，稻花香2号，博A，9311，垦稻12A，春江23A，中花11，R498，IAPAR9，Lemont，Khazar，Basmati，苏御糯，BG367，中4188，Amol3，华粳籼74，金农丝苗，广恢1380，19香，广恢油香。
本实施例的方法是根据氮高效基因NRT1.1B的功能变异位点设计的功能标记，相较于连锁标记检测结果更加准确真实；本发明对实验室条件要求低，可及性较强，只需简单PCR扩增、酶切和电泳检测，即可快速分辨NRT1.1B的基因型，无需昂贵的检测仪器和荧光试剂，适用性更广。本发明属于共显性功能标记，相较于显性标记，不会出现假阴性的结果。
氮高效等位基因NRT1.1B，其编码一个硝酸盐转运蛋白，能增加硝酸盐从根向茎的运输能力，以及上调硝酸盐应答相关基因的表达，进而显著提高硝酸盐利用效率；因此该等位基因可以大大提高水稻对氮肥的利用效率，在少施氮肥的情况下仍能达到水稻增产的效果，可以有效减少水稻生产过程中的氮肥施用量，做到减氮不减产，有效降低水稻生产成本、减少因多施氮肥造成的水体富营养化，具有重要的经济价值、生态价值和社会价值。而nrt1.1b对氮肥钝感，氮肥的利用效率低下，在含有的nrt1.1b等位基因的水稻品种生产中，需要多施、重施氮肥才能达到增产的效果，从而增加水稻生产成本，同时多施氮肥也带来了土壤板结、水体富营养化等一系列生态问题。水稻NRT1.1B编码区一个SNP变异(980C>T)是导致两种等位基因之间对氮肥吸收利用差异的功能性变异位点。因此，根据NRT1.1B的功能变异位点，设计开发该基因的功能标记，能极大地便利在种质资源中进行氮高效等位基因NRT1.1B的筛选鉴定，同时可以助力分子标记辅助培育氮高效水稻品种。
本实施例利用氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物，对氮高效等位基因NRT1.1B和氮低效等位基因nrt1.1b进行有效区分，一方面可以弄清广泛的种质资源中NRT1.1B位点等位基因分布情况，为氮高效等位基因的有效发掘和鉴定奠定基础；另一方面，该功能标记可以有效用于氮低效水稻品种的定向改良和分子标记辅助育种，通过利用氮高效的水稻品种和氮低效品种杂交，在后代中利用该功能标记定向标记选择氮高效等位基因，定向改良氮低效品种的氮肥利用效率，助力实现水稻生产中减氮不减产、资源节约、环境友好的可持续发展。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 广东省农业科学院水稻研究所
<120> 一种氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物及其应用
<130> 2022.3.11
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
caggtcggcg gcggagtcgc cgtcga 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
tgcgcgacgg cgaaggtggt catctgg 27
<210> 3
<211> 1791
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
atggcgatgg tgttgccgga gacggcggcg gaggggaagg cgctgacgga cgcgtgggac 60
tacaagggga ggccggcggg gagggcggcc accggcgggt ggggctgcgc ggcgatgatc 120
ctcggggcgg agctgttcga gcggatgacg acgctgggca tcgccgtcaa cctggtgccg 180
tacatgaccg ggacgatgca cctcggcaat gccgccgccg ccaacacggt caccaacttc 240
atcggcacct ccttcatgct ctgcctcctc ggcggcttcg tcgccgacac ctacctcggc 300
cgctacctca ccatcgccat cttcgaggcc gtccaggcca ccggcgtgat gatactcacg 360
atctccacgg cggcgccggg gctgcggccg ccggcgtgcg gcgacccgaa gggggcgagc 420
gcggagtgcg tggcggcgga cgggacgcag ctcggggtgc tctacctggg gctctacctg 480
acggcgctgg gcacgggggg gctcaagtcc agcgtctccg gcttcggctc cgaccagttc 540
gacgagtccg acgtcgacgg cgagaggaag aagatgatgc gcttcttcaa ctggttctac 600
ttcttcgtca gcctcggcgc gctgctcgcc gtcaccgtgc tggtgtacgt gcaggacaac 660
gtcggacgcc ggtgggggta cggcatctgc gccgccggca tcctcgccgg cctcgccgtg 720
ttcctctccg ggaccaggag gtacaggttc aagaagctgg tggggagccc cctcacccag 780
gtcgccgccg tcaccgccgc cgcctggagc aagaggtcgc tgccgctgcc gtccgaccca 840
gacatgctct acgacgtcga cgacgccgcc gccgccggcc atgacgtcaa gggcaagcag 900
aggatgccac acagcaagga gtgccggttc ctggaccatg cggcgatcat cgacaggtcg 960
gcggcggagt cgccggcgat ggcgagcaag tggaggctgt gcacgaggac ggacgtggag 1020
gaggtgaagc aggtggtgcg gatgctcccc atctgggcga ccaccatcat gttctggacc 1080
atccacgccc agatgaccac cttcgccgtc gcgcaggccg agctcatgga ccgccgcctc 1140
gccggcggct tcctcatccc ggcgggctcc ctcaccgtct tcctcatcgc ctccatcctc 1200
ctcaccgtcc ccttctacga ccgcctcgtc gtccccgtcg cgcgccgcgc cacggccaac 1260
ccgcacggcc tcaccccgct ccagcgcgtc ttcgtgggcc tctccctctc catcgccggc 1320
atggccgtcg ccgccgccgt cgagcgccac cgcgccaccg cctccgcctc cgccgccgcc 1380
gccgcgccca cggtgttcct cctcatgccg cagttcctcc tcgtcggcgc cggcgaggcg 1440
ttcacctaca tgggccagct cgacttcttc ctccgcgagt gccccaaggg gatgaagacc 1500
atgagcacgg gcctcttcct cagcacctgc gccatcggct tcttcttcag cacgctgctc 1560
gtcaccatcg tccacaaggt caccggccat ggcgcccgcg gcggcggctg gctcgccgac 1620
aacctcgacg acggcaggct cgactacttc tactggctgc tcgccgtcat cagcgccatc 1680
aacctcgtcc tcttcaccgt cgccgccagg gggtacgtct acaaggagaa gcgcctcgcc 1740
gacgccggca tcgagctcgc cgacgaggag accatcgccg tcggccacta a 1791
<210> 4
<211> 1791
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 4
atggcgatgg tgttgccgga gacggcggcg gaggggaagg cgctgacgga cgcgtgggac 60
tacaagggga ggccggcggg gagggcggcc accggcgggt ggggctgcgc ggcgatgatc 120
ctcggggcgg agctgttcga gcggatgacg acgctgggca tcgccgtcaa cctggtgccg 180
tacatgaccg ggacgatgca cctcggcaat gccgccgccg ccaacacggt caccaacttc 240
atcggcacct ccttcatgct ctgcctcctc ggcggcttcg tcgccgacac ctacctcggc 300
cgctacctca ccatcgccat cttcgaggcc gtccaggcca ccggcgtgat gatactcacg 360
atctccacgg cggcgccggg gctgcggccg ccggcgtgcg gcgacccgaa gggggcgagc 420
gcggagtgcg tggcggcgga cgggacgcag ctcggggtgc tctacctggg gctctacctg 480
acggcgctgg gcacgggggg gctcaagtcc agcgtctccg gcttcggctc cgaccagttc 540
gacgagtccg acgtcgacgg cgagaggaag aagatgatgc gcttcttcaa ctggttctac 600
ttcttcgtca gcctcggcgc gctgctcgcc gtcaccgtgc tggtgtacgt gcaggacaac 660
gtcggacgcc ggtgggggta cggcatctgc gccgccggca tcctcgccgg cctcgccgtg 720
ttcctctccg ggaccaggag gtacaggttc aagaagctgg tggggagccc cctcacccag 780
gtcgccgccg tcaccgccgc cgcctggagc aagaggtcgc tgccgctgcc gtccgaccca 840
gacatgctct acgacgtcga cgacgccgcc gccgccggcc atgacgtcaa gggcaagcag 900
aggatgccac acagcaagga gtgccggttc ctggaccatg cggcgatcat cgacaggtcg 960
gcggcggagt cgccggcgac ggcgagcaag tggaggctgt gcacgaggac ggacgtggag 1020
gaggtgaagc aggtggtgcg gatgctcccc atctgggcga ccaccatcat gttctggacc 1080
atccacgccc agatgaccac cttcgccgtc gcgcaggccg agctcatgga ccgccgcctc 1140
gccggcggct tcctcatccc ggcgggctcc ctcaccgtct tcctcatcgc ctccatcctc 1200
ctcaccgtcc ccttctacga ccgcctcgtc gtccccgtcg cgcgccgcgc cacggccaac 1260
ccgcacggcc tcaccccgct ccagcgcgtc ttcgtgggcc tctccctctc catcgccggc 1320
atggccgtcg ccgcggccgt cgagcgccac cgcgccaccg cctccgcctc cgccgccgcc 1380
gccgcgccca cggtgttcct cctcatgccg cagttcctcc tcgtcggcgc cggcgaggcg 1440
ttcacctaca tgggccagct cgacttcttc ctccgcgagt gccccaaggg gatgaagacc 1500
atgagcacgg gcctcttcct cagcacctgc gccatcggct tcttcttcag cacgctgctc 1560
gtcaccatcg tccacaaggt caccggccat ggcgcccgcg gcggcggctg gctcgccgac 1620
aacctcgacg acggcaggct cgactacttc tactggctgc tcgccgtcat cagcgccatc 1680
aacctcgtcc tcttcaccgt cgccgccagg gggtacgtct acaaggagaa gcgcctcgcc 1740
gacgccggca tcgagctcgc cgacgaggag accatcgccg tcggccacta a 1791
Claims (3)
1.一种氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物，其特征在于，所述氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物包括记引物NRT1.1B-Caps-F和引物NRT1.1B-Caps-R，所述引物NRT1.1B-Caps-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物NRT1.1B-Caps-R的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
2.一种如权利要求1所述的氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物的应用，其特征在于，所述氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物用于分辨水稻NRT1.1B的基因型，对氮高效等位基因NRT1.1B和氮低效等位基因nrt1.1b进行区分。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氮高效基因NRT1.1B的功能标记引物用于分辨水稻NRT1.1B的基因型，对氮高效等位基因NRT1.1B和氮低效等位基因nrt1.1b进行区分的方法为：
S1、提取水稻叶片的DNA，得到待测基因组DNA；
S2、将S1中得到的待测基因组DNA用引物NRT1.1B-Caps-F和引物NRT1.1B-Caps-R进行PCR扩增，得到PCR产物；
所述PCR扩增的反应体系为：T3 Super PCR Mix 17μL、10μM的引物NRT1.1B-Caps-F 1μL、10μM的引物NRT1.1B-Caps-R 1μL、待测基因组DNA 1μL；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸5s，共34个循环；72℃延伸3min，12℃2min；
S3、对S2中得到的PCR产物用SalI内切酶在温度为37℃的条件下进行酶切反应3h～6h，将酶切后的PCR产物进行电泳，电泳得到大小为26bp和140bp的条带的对应的水稻具有氮低效等位基因nrt1.1b，电泳得到大小为162bp的条带的对应的水稻具有氮高效等位基因NRT1.1B；
所述酶切反应体系为：PCR产物2μL、SalI内切酶0.2μL、cutsmart buffer 1μL、ddH2O6.8μL。
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2022
- 2022-05-27 CN CN202210593164.4A patent/CN114921460B/zh active Active
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