CN106011301B - 一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其方法，该引物包括Vp1‑B1基因分子标记的2条正向引物和1条反向引物，TaPHS1基因分子标记的1条正向引物和1条反向引物，PM19‑A1基因分子标记的1条正向引物和1条反向引物，通过两次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳实现的。第一次PCR反应中用三对引物对全部待测材料进行检测，第二次PCR反应中用一对引物对第一次PCR反应中不能很好区分的材料进行检测。综合两次PCR可明确鉴定全部主效休眠等位基因，利用含有多对引物组合的第一次PCR反应可明确鉴定三个主效休眠位点的强休眠等位基因。本发明为小麦品种资源和育种群体后代休眠等位基因的有效鉴定和选择提供一种简单、快速和准确的方法。

Description

一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其 方法

技术领域

本发明属于植物分子标记技术领域，具体涉及一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其方法。

背景技术

穗发芽(Pre-harvest sprouting，简称PHS)是指收获前遇到阴雨天气时籽粒在穗上发芽的现象，是一种世界性的气候农业灾害。穗发芽不仅降低产量而且严重劣化籽粒品质和种用价值。我国长江中下游、西南冬麦区和东北春麦区是穗发芽危害频繁和严重的地区，黄淮和北部冬麦区也时有发生，受穗发芽危害的麦区约占全国小麦总面积的83％，对小麦的优质、高产生产极为不利。选育和推广抗穗发芽小麦品种是解决这一问题的最有效途径。

穗发芽是受遗传基因控制和环境因素影响的复杂数量性状。籽粒休眠特性是影响小麦穗发芽抗性的主要遗传因素。国内外学者利用不同的遗传分析群体，在2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D和7D等染色体上定位出了多个控制小麦籽粒休眠的QTL位点(数量性状遗传位点)，并建立了与基因位点连锁的分子标记。近年来的研究表明，位于染色体3BL、3AS和4AL的3个QTL位点是控制籽粒休眠的主效基因，与小麦种质资源的穗发芽性状密切相关。染色体3BL上的种子特异性的转录因子Vp1-B1，在促进种子成熟和维持胚休眠方面发挥重要作用。目前已报道Vp1-B1基因位点的突变类型(等位基因)有6个，编号分别为Vp1-B1a～Vp1-B1af。该基因等位变异与小麦种子休眠关系紧密，携有Vp1-B1a的品种休眠性最差，表现穗发芽敏感；携有Vp1-B1b和Vp1-B1f的品种休眠性强，表现抗穗发芽。位于染色体3AS上的TaPHS1基因具有促进种子休眠的作用，该基因内含子3区域发生的单碱基突变导致功能缺失的翻译蛋白，含有该突变等位基因的品种籽粒休眠性降低，表现易穗发芽。目前报道的TaPHS1等位基因有2个，分别控制种子的强、弱休眠特性。位于染色体4AL的PM19-A1基因编码受脱落酸ABA诱导的质膜蛋白19，是种子休眠的正向调控因子，有些品种在该基因启动子区发生18bp核苷酸片段的缺失，导致种子休眠性降低、易穗发芽；含有该18bp核苷酸片段的等位基因的品种则休眠性强、抗穗发芽。

研究表明，在多季节、多环境条件下，上述主效基因能解释绝大部分的小麦种子休眠变异和穗发芽表型变异。通过聚合优良抗性基因的分子育种手段提高种子休眠性，培育抗穗发芽品种，是降低小麦穗发芽危害的最有效途径。目前，能用于穗发芽抗性分子标记辅助选择的有效标记较少。近年来，有学者针对不同的休眠等位基因设计了与之紧密连锁的功能分子标记，但对每一种等位基因的检测都需要采用一对不同的标记引物和一次PCR反应。对于多基因控制性状的分子标记鉴定，这些标记检测方法均存在步骤繁琐，费时费力，且费用成本高等缺点，特别不适合大规模小麦种质资源和育种分离群体后代的鉴定工作，很难在科学研究或育种实践中普遍应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种简单、快速、准确地通量鉴定三个小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物，所述小麦种子主校休眠基因为Vp1-B1基因、TaPHS1基因和PM19-A1基因；其中，

所述Vp1-B1基因的分子标记引物包括2条正向引物和1条反向引物，正向引物1序列如SEQ ID No.1所示：5’-ACATATGATGGGAATCCG-3’，正向引物2序列如SEQ ID No.2所示：5’-TCTGATACCATATATACTTGC-3’，反向引物序列如SEQ ID No.3所示：5’-TCTCACCAGTGTTCTCTA-3’；

所述TaPHS1基因的分子标记引物包括1条正向引物和1条反向引物，正向引物序列如SEQ ID No.4所示：5’-GGAACAGATGCAACTAAAGA-3’，反向引物序列如SEQ ID No.5所示：5’-AGGATGTGAGACCAGTTGAC-3’；

所述PM19-A1基因的分子标记引物包括1条正向引物和1条反向引物，正向引物序列如SEQ ID No.6所示：5’-CGTGAGGTGGTTGATTCG-3’，反向引物序列如SEQ ID No.7所示：5’-TGGTGAAGTGGAGTGTAGT-3’。

上述的引物在通量鉴定小麦种子主效休眠基因的应用。

一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的试剂盒，包含如权利要求1所述的引物。

一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的试剂盒，它还包括Buffer、MgCl₂、dNTP和Taq酶。

上述试剂盒在通量鉴定小麦种子主效休眠基因的应用。

上述引物通量鉴定小麦种子休眠基因的方法，它包括以下步骤：

S1.使用Vp1-B1基因的分子标记正向引物1和反向引物、TaPHS1基因的分子标记引物和PM19-A1基因的分子标记引物形成的引物组合，对小麦DNA进行PCR扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，1224bp扩增条带鉴定为TaPHS1位点的弱休眠等位基因，强休眠等位基因没有扩增条带；484bp、677bp、459bp、614bp的扩增条带分别鉴定为Vp1-B1位点的等位基因Vp1-B1a、Vp1-B1b、Vp1-B1d和Vp1-B1f，其中Vp1-B1b和Vp1-B1f为强休眠等位基因，Vp1-B1a为弱休眠等位基因；195bp和177bp的扩增条带分别鉴定为PM19-A1位点的强休眠等位基因和弱休眠等位基因；

S2.使用Vp1-B1基因的分子标记正向引物2和反向引物进行PCR扩增检测，并将扩增产物进行凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，有扩增条带的鉴定为等位基Vp1-B1e，没有扩增条带的为等位基因Vp1-B1c。

本发明具有以下优点：本发明中设计的引物组合，在第一次PCR反应中可以鉴别三个主效休眠位点的强休眠等位基因，对于第一次PCR反应不能很好鉴别的等位基因Vp1-B1c和Vp1-B1e，通过第二次PCR反应十分容易区分。所以综合两次PCR结果，可以明确地鉴定三个主效休眠位点的全部休眠等位基因。实验结果经测序验证，本发明鉴定主效休眠等位基因结果可靠、重复性好，为小麦品种资源休眠等位基因的有效鉴定和选择提供一种简单、快速和准确地通量鉴定三个小麦主效休眠等位基因的引物、试剂盒及其检测方法，解决了传统分子标记技术在数量性状多基因检测过程中存在的操作繁琐、时间长和费用成本高的难题。

附图说明

图1为主效休眠等位基因在第一次PCR反应中的扩增片段凝胶电泳图；图中，字母a～f分别代表等位基因Vp1-B1a～Vp1-B1f，M为标准分子量D2000；

图2为等位基因Vp1-B1c和Vp1-B1e在第二次PCR反应中的扩增片段凝胶电泳图；图中，M为标准分子量D2000；

图3为部分四川小麦品种主效休眠等位基因的第一次PCR鉴定图；图中，泳道1～15表示供试小麦品种，M为标准分子量D2000；

图4为部分四川小麦品种主效休眠等位基因的第二次PCR鉴定图；图中，泳道12～15表示与第一次PCR对应的供试品种，e代表等位基因Vp1-B1e，M为标准分子量D2000。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1：DNA的提取及PCR引物设计

(1)DNA的提取及检测

采用CTAB方法提取小麦种子总DNA，利用紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度。

(2)PCR引物设计

分析比较等位基因序列的突变特征，针对基因扩增区域，采用Primer5生物学软件设计基因特异性分子标记引物，保证引物间连续互补不超过4bp以防止发生交叉错配，引物序列见表1。第一次PCR反应采用Vp1-B1基因正向引物1、反向引物，TaPHS1基因正、反向引物对和PM19-A1基因正、反向引物对组成的引物组合。第一次PCR实质是多重PCR，是在传统PCR原理的基础上进行改进即在同一反应体系中加入多对特异性引物对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。第二次PCR为普通PCR，采用Vp1-B1基因正向引物2和反向引物形成的引物对对目的基因进行PCR扩增，不同等位基因的预期扩增目的片段大小见表2。

表1：PCR引物序列

表2：等位基因扩增片段大小

注：表中-表示没有扩增产物；/表示未进行PCR反应。

实施例2：PCR体系的建立及测序验证

进一步优化PCR反应体系和热循环条件，利用实施例1的引物组合对含有不同等位基因的小麦材料进行PCR扩增及检测：

第一次(多重)PCR反应体系总体积为20ul，包括1×PCR Buffer(Mg2+Free)、2.5mMMgCl₂、300uM dNTP、2U的Taq酶和400ng的模板DNA，PHS1基因上下游引物分别为10pmol，VP1-B1基因上下游引物分别为12pmol，PM19-A1基因上下游引物分别为2pmol。

第一次(多重)PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30S，62℃退火30S，72℃延伸1min，10个循环。94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

第二次PCR反应体系总体积为20ul，包括1×PCR Buffer(Mg²⁺Free)、1.5mM MgCl₂、200uM dNTP、0.5U的Taq酶和100ng的模板DNA，上下游引物分别为5pmol。

第二次PCR扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸30S，30个循环，最后72℃延伸10min。

第一次(多重)PCR产物用3.5％的琼脂糖凝胶电泳0.5-1h，第二次PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳0.5h，EB染色后用凝胶成像系统观察并拍照。每个等位基因材料均能扩出唯一一条清晰的带，结果见图1、图2。由图1可知，第一次(多重)PCR反应可以明确地鉴定VP1-B1a(484bp)、P1-B1b(677bp)、VP1-B1d(459bp)、VP1-B1f(614bp)，VP1-B1c(401bp)和VP1-B1e(405bp)扩增片段相近，在第一个PCR反应检测中不能很好区分。TaPHS1位点的强休眠等位基因无扩增条带，弱休眠等位基因产生1224bp扩增片段。PM19-A1位点的强、弱休眠等位基因则分别产生195bp和177bp的扩增条带；在第二次PCR反应中用一对引物对第一次PCR反应中不能很好区分的材料进行检测，第二次PCR反应可以明确地区分VP1-B1c(无扩增产物)和VP1-B1e(237bp)，结果如图2所示。

进一步利用相应的引物对上述扩增片段直接测序，测序结果分别与GeneBank中对应的VP1-B1、TaPHS1和PM19-A1等位基因序列进行比对分析，证明每个等位基因的特异性扩增片段与预期结果吻合。所以，综合两次PCR的结果，能够明确地鉴定三个休眠主效位点的全部等位基因类型。尤其是利用第一次(多重)PCR可以一次性鉴定三个位点的强休眠等位基因，可以作为抗穗发芽育种过程中强休眠等位的分子标记辅助选择技术，加快优良抗性基因在小麦遗传背景中的快速聚合。

实施例3:四川育成小麦品种主效休眠等位基因的鉴定

利用本发明的分子标记，鉴定98份四川小麦育成品种在三个主效休眠位点的等位基因组成。DNA提取及分子标记PCR检测方法同实施例1和实施例2。结果如图3、图4所示，图3表示利用第一次(多重)PCR对其中15份供试材料主效休眠基因的鉴定结果，对于泳道12～15检测材料中不能分辨的VP1-B1e和VP1-B1c等位基因，继续利用第二次PCR进行鉴别，结果表明均为等位基因VP1-B1e，如图4所示。实验数据表明，98份四川小麦育成品种在VP1-B1位点存在5种等位基因类型。其中，64份材料含有VP1-B1e，频率为65.3％，21份材料含有VP1-B1c，频率为21.4％，12份材料含有VP1-B1a，频率为12.2％，含有VP1-B1b和VP1-B1d的材料均只有1份，未检测到强休眠等位基因VP1-B1f。可见，四川小麦在VP1-B1位点的强休眠等位基因频率极低，在抗穗发芽育种中应加强VP1-B1b和VP1-B1f强休眠等位基因的利用。四川小麦品种在TaPHS1位点出现2种等位基因，即强休眠等位基因和弱休眠等位基因，频率分别为98％和2％。四川小麦品种在PM19-A1位点出现2种等位基因，即强休眠等位基因和弱休眠等位基因，频率分别为3％和97％。上述检测结果表明，四川小麦抗穗发芽育种应加强对VP1-B1和PM19-A1位点的种子强休眠基因的引进和利用，本发明建立的强休眠主效等位基因特异性分子标记及检测方法为小麦抗穗发芽分子育种提供了强有力技术手段。

Claims (6)

1.一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物，其特征在于，所述小麦种子主校休眠基因为Vp1-B1基因、TaPHS1基因和PM19-A1基因；其中，

所述Vp1-B1基因的分子标记引物包括2条正向引物和1条反向引物，正向引物1序列如SEQ ID No. 1所示，正向引物2序列如SEQ ID No. 2所示，反向引物序列如SEQ ID No. 3所示；

所述TaPHS1基因的分子标记引物包括1条正向引物和1条反向引物，正向引物序列如SEQ ID No. 4所示，反向引物序列如SEQ ID No. 5所示；

所述PM19-A1基因的分子标记引物包括1条正向引物和1条反向引物，正向引物序列如SEQ ID No. 6所示，反向引物序列如SEQ ID No. 7所示。

2.如权利要求1所述的引物在通量鉴定小麦种子主效休眠基因中的应用。

3.一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的引物。

4.如权利要求3所述的一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的试剂盒，其特征在于，它还包括Buffer、MgCl2、dNTP和Taq酶。

5.如权利要求3或4所述的试剂盒在通量鉴定小麦种子主效休眠基因中的应用。

6.如权利要求1所述的引物通量鉴定小麦种子主效休眠基因的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

首先，使用Vp1-B1基因的分子标记正向引物1和反向引物、TaPHS1基因的分子标记引物和PM19-A1基因的分子标记引物形成的引物组合，对小麦DNA进行PCR扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，1224 bp扩增条带鉴定为TaPHS1位点的弱休眠等位基因，强休眠等位基因没有扩增条带；484 bp、677 bp、459 bp、614 bp的扩增条带分别鉴定为Vp1-B1位点的等位基因Vp1-B1a、Vp1-B1b、Vp1-B1d和Vp1-B1f，其中Vp1-B1b和Vp1-B1f为强休眠等位基因，Vp1-B1a为弱休眠等位基因；195 bp和177bp的扩增条带分别鉴定为PM19-A1位点的强休眠等位基因和弱休眠等位基因；

其次，使用Vp1-B1基因的分子标记正向引物2和反向引物进行PCR扩增检测，并将扩增产 物进行凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，有扩增条带的鉴定为等位基Vp1-B1e，没有扩 增条带的为等位基因Vp1-B1c。