CN110373491B - 用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的KASP分子标记及应用 - Google Patents
用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的KASP分子标记及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的KASP分子标记及应用，该分子标记包括SNP位点1和SNP位点2。SNP位点1位于水稻11号染色体第30654770位碱基，分子标记多态性为A/T；SNP位点2位于水稻11号染色体第30655545位碱基，分子标记多态性分别为C/G。本发明的分子标记检测Pi1基因位点特异性高，提供的SNP分子标记的应用方法操作方便，检测结果准确可靠，可用于水稻Pi1基因的鉴定及辅助育种，能够解决传统选育的效率低和周期长的难题。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pil的KASP分子标记及应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是重要的粮食作物。水稻稻瘟病是由子囊菌引起的病害，从上个世纪90年代开始，我国年均稻瘟病发病面积超过4千万hm2，造成的损失达到10万kg，因此稻瘟病是我国水稻生产的严重障碍，也是水稻育种过程中的难题。几十年的生产实践经验表明，鉴定主栽水稻品种抗稻瘟病基因型，并选育抗病品种是解决稻瘟病最为经济和有效的手段。
截至2015年3月，已在69个抗稻瘟病位点中定位了84个主效基因，且克隆了其中的24个。这些基因成簇地位于除第3染色体外的所有水稻染色体。根据Gramene提供的资料，已定位了183个与稻瘟病抗性相关的QTL。其中，已鉴定的水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1位于水稻第11号染色体上，具有广谱持久的抗性。柳武革等通过分子标记辅助选择育种技术，将抗稻瘟基因Pi-1和Pi-2聚合到GD-7S中，获得具有持久稳定抗性的两系不育系，并育成多个通过省级审定的两系杂交稻组合。于苗苗等的研究结果表明，聚合Pi1/Pigm和Pi1/Pi2杂种的抗性频率均超过90％。
传统的水稻抗性育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。利用分子标记辅助育种(Molecular Marker－assisted Selection，MAS)简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期。目前常用的分子标记类型是SNP，通过分子标记辅助选择对这些品种聚合抗病基因的最适基因型组合，增加其抗性，这种提高稻瘟病抗性的改良将大大提高育种效率，带来巨大的社会经济效益。
KASP(KompetitiveAllele Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)是高通量SNP检测技术，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNPs和特定位点上的InDels进行非常准确的双等位基因判定，该技术具有高度稳定性和准确性，为选育抗病水稻品种提供重要技术支撑，解决了传统选育的效率低和周期长的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pil的KASP分子标记及应用。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的KASP分子标记，所述的分子标记包括SNP位点1和SNP位点2；
上述SNP位点1位于水稻11号染色体第30654770位碱基，分子标记多态性为A/T；该SNP位点1前后共401bp的序列如SEQ.ID.NO.7所示，第201bp的碱基即为SNP位点1；
上述SNP位点2位于水稻11号染色体第30655545位碱基，分子标记多态性为C/G；该SNP位点2前后共411bp的序列如SEQ.ID.NO.8所示，第211bp的碱基即为SNP位点2。
用于检测上述KASP分子标记的引物组合，包括检测SNP位点1和检测SNP位点2的引物组：
检测SNP位点1的引物组包括引物PrimerX1、PrimerY1、PrimerC1，PrimerX1的序列如SEQ.ID.NO.1所示，PrimerY1的序列如SEQ.ID.NO.2所示，PrimerC1的序列如SEQ.ID.NO.3所示；
检测SNP位点2的引物组包括引物PrimerX2、PrimerY2、PrimerC2，PrimerX2的序列如SEQ.ID.NO.4所示，PrimerY2的序列如SEQ.ID.NO.5所示，PrimerC2的序列如SEQ.ID.NO.6所示。
含有上述引物组合的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述引物组合在检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1中的应用。
所述的应用，进一步包括以下步骤：
(1)提取待测水稻基因组DNA；
(2)以待测水稻基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组合进行KASP反应检测；
(3)若在SNP位点1只检测到碱基A，则判定待检水稻样品为抗稻瘟病纯合基因型；若只检测到碱基T，则判定待检水稻样品为感病纯合基因型；若同时检测到碱基A和T，则判定待检水稻样品为杂合基因型；
若在SNP位点2只检测到碱基G，则判定待检水稻样品为抗稻瘟病纯合基因型；若只检测到碱基C，则判定待检水稻样品为感病纯合基因型；若同时检测到碱基C和G，则判定待检水稻样品为杂合基因型。
步骤(2)中KASP检测中PCR反应条件为：先30℃1min，94℃15min；然后进行第一步扩增反应，94℃20sec，61-55℃1min，每个循环退火及延伸温度降低0.6℃，共10个循环；再进行第二步扩增反应，94℃20sec，55℃1min，共36个循环；最后30℃1min；反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读数，读取的结果会转化成图形。
本发明提供了上述KASP分子标记在辅助鉴定水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1中的应用。
本发明提供了上述的KASP分子标记或引物组合或含有该引物组合的试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。
本发明提供了上述的KASP分子标记或引物组合或含有该引物组合的试剂盒在培育具有抗稻瘟病能力水稻中的应用。
本发明的有益效果
本发明提供了一种用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的分子标记，包括两个分子标记位点，它们检测Pi1基因位点特异性高，针对上述分子标记中的单碱基差异设计了KASP检测引物，利用KASP检测技术可快速鉴定水稻品种中的Pi1基因，能够克服现有的形态学鉴定方法检测周期长、需要丰富经验和PCR、PAPD、PCR-RELP、Southern杂交等检测方法操作复杂或灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好的缺点。本发明提供的SNP分子标记的应用方法操作方便，检测结果准确可靠，可用于水稻Pi1基因的鉴定及辅助育种，能够解决传统选育的效率低和周期长的难题。
附图说明
图1-94个待测样品的SNP位点1分型结果。
图2-94个待测样品的SNP位点2分型结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的分子标记的开发
本发明通过对6种广西壮族自治区农业科学院水稻研究所自己选育的水稻品种(N213、N91、N58、N1209、N1208、N1298)进行全基因组测序，将测序结果与NCBI上发布的水稻基因组进行blast分析，通过与已测序的Pi1基因序列进行比对，获得原始SNP位点，再将原始SNP位点经过实验验证，挑选出与抗性品种共分离及KASP反应扩增效果好的两个SNP分子标记位点。
上述的两个SNP分子标记位点为：
SNP位点1：位于水稻11号染色体第30654770位碱基，分子标记多态性为A/T，该SNP位点1前后共401bp的序列如SEQ.ID.NO.7所示，第201bp的碱基即为SNP位点1；抗稻瘟病广谱基因Pi1在该位点的碱基为A，若在该位点只检测到碱基A，就可以判定待检水稻样品为抗稻瘟病纯合基因型；当检测到到碱基T，说明该位点碱基出现了突变，判定待检水稻样品为感病纯合基因型；若同时检测到碱基A和T，则判定待检水稻样品为杂合基因型；
SNP位点2：位于水稻11号染色体第30655545位碱基，分子标记多态性分别为C/G；该SNP位点2前后共411bp的序列如SEQ.ID.NO.8所示，第201bp的碱基即为SNP位点2；抗稻瘟病广谱基因Pi1在该位点的碱基为G，若在该位点只检测到碱基G，就可以判定待检水稻样品为抗稻瘟病纯合基因型；当检测到到碱基C，说明该位点碱基出现了突变，判定待检水稻样品为感病纯合基因型；若同时检测到碱基C和G，则判定待检水稻样品为杂合基因型；根据LGC的KASP高通量技术平台SNP标记引物设计原则，设计检测上述分子标记的特异性引物组合，包括检测SNP位点1和检测SNP位点2的引物组：
检测SNP位点1的引物组包括引物PrimerX1、PrimerY1、PrimerC1，PrimerX1的序列如SEQ.ID.NO.1所示，PrimerY1的序列如SEQ.ID.NO.2所示，PrimerC1的序列如SEQ.ID.NO.3所示；
检测SNP位点2的引物组包括引物PrimerX2、PrimerY2、PrimerC2，PrimerX2的序列如SEQ.ID.NO.4所示，PrimerY2的序列如SEQ.ID.NO.5所示，PrimerC2的序列如SEQ.ID.NO.6所示。
特异性引物PrimerX1、PrimerX2和PrimerY1、PrimerY2的5’端分别连接KASP反应试剂特定的FAM和HEX荧光接头序列。
实施例2水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的KASP分子标记的应用
(1)提取待测水稻基因组DNA
待测水稻样品共94份，提取基因组DNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳和SMA4000对所提取的水稻基因组DNA的质量及浓度进行检测，确保基因组DNA条带完整无拖尾，以及确保A260/280介于1.8～2.0之间，A260/230介于1.8～2.0之间。
(2)KASP特异性PCR反应
对待测水稻材料基因组DNA进行KASP反应，KASP反应在LGC SNPline基因分型平台上进行，LGC SNPline基因分型平台与实验试剂等均购于荧光LGC公司。
KASP检测的PCR反应体系和条件如下所示：
表1 KASP检测的PCR反应体系
KASP检测中PCR反应条件为：先30℃1min，94℃15min；然后进行第一步扩增反应，94℃20sec，61-55℃1min，每个循环退火及延伸温度降低0.6℃，共10个循环；再进行第二步扩增反应，94℃20sec，55℃1min，共36个循环；最后30℃1min；反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读数，读取的结果会转化成图形。
(3)检测结果
①SNP分子标记1分型结果
94份水稻样品和2份纯水阴性对照品使用SNP分子标记1分型结果如图1所示，该基因型是通过检测PCR产物中两种荧光强度判断的，图中每一个小圆圈即表示每一份水稻样品的基因型或者纯水对照样品，检测结果原图为彩色图，考虑到专利申请时只能提交黑白图，因此申请人对图中的各小圆圈所代表的基因型进行了标注。
经过统计，该批待检水稻样品中的抗病纯合AA基因型样品28份，感病纯合TT基因型样品36份，杂合基因型样品27份，未检出3份。
②SNP分子标记2分型结果
94份水稻样品和2份纯水阴性对照品使用SNP分子标记2分型结果如图2所示，该基因型是通过检测PCR产物中两种荧光强度判断的，图中每一个小圆圈即表示每一份水稻样品的基因型或者纯水对照样品，检测结果原图为彩色图，考虑到专利申请时只能提交黑白图，因此申请人对图中的各小圆圈所代表的基因型进行了标注。
经过统计，该批待检水稻样品中的GG抗病纯合基因型样品27份，CC感病纯合基因型样品29份，CG杂合基因型17份，未检出9份，还有12份无信号。
用上述方法，分别对94份待测水稻样品进行KASP反应检测，从中筛选出SNP分子标记1抗病纯合基因型样品28份、SNP分子标记2抗病纯合基因型样品27份，育种科研人员可以从中再进一步筛选出SNP分子标记1、SNP分子标记2均为抗病纯合基因型的样品，可以快速预测水稻植株对稻瘟病的抗性，大大加快抗稻瘟病水稻材料的选择进度。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的KASP分子标记及应用
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<213> 用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的KASP分子标记及应用(Oryzasativa L.)
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Claims (2)
1.一种用于检测水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1的KASP分子标记在辅助鉴定水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1中的应用，其特征在于：所述分子标记包括SNP位点1和SNP位点2；
所述SNP位点1前后共401bp的序列如SEQ.ID.NO.7所示，第201bp的碱基即为SNP位点1，分子标记多态性为A/T；所述SNP位点2前后共411bp的序列如SEQ.ID.NO.8所示，第201bp的碱基即为SNP位点2，分子标记多态性为C/G。
2.一种用于检测权利要求1所述的KASP分子标记的引物组在在辅助鉴定水稻抗稻瘟病广谱基因Pi1中的应用，其特征在于：所述引物组由检测SNP位点1的引物组和检测SNP位点2的引物组组成；
所述检测SNP位点1的引物组包括引物PrimerX1、PrimerY1、PrimerC1，PrimerX1的序列如SEQ.ID.NO.1所示，PrimerY1的序列如SEQ.ID.NO.2所示，PrimerC1的序列如SEQ.ID.NO.3所示；所述SNP位点1前后共401bp的序列如SEQ.ID.NO.7所示，第201bp的碱基即为SNP位点1，分子标记多态性为A/T；
所述检测SNP位点2的引物组包括引物PrimerX2、PrimerY2、PrimerC2，PrimerX2的序列如SEQ.ID.NO.4所示，PrimerY2的序列如SEQ.ID.NO.5所示，PrimerC2的序列如SEQ.ID.NO.6所示；所述SNP位点2前后共411bp的序列如SEQ.ID.NO.8所示，第201bp的碱基即为SNP位点2，分子标记多态性为C/G。
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