CN104388425A - 水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记及其专用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记及其专用引物，属于分子生物学领域。获得水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记的引物对，其正向引物为：GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG，反向引物为：AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。用该引物对在含Pi1的C101LAC序列中扩增出来的核苷酸序列即为本发明水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记。通过本发明的特异性分子标记及引物对能特异检测水稻样品中是否含有抗稻瘟病基因Pi1，100％准确跟踪遗传分离群体中的抗稻瘟病基因Pi1存在与否。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记及其专用引物。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食。稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe grisea(Hebert)Barr)引起的广泛发生在世界各稻区的重要病害之一，严重威胁着世界的粮食安全。目前主要通过化学防治和种植抗性品种来控制稻瘟病。化学防治在一定程度上能减轻病害、减少产量损失，但对环境造成污染，因而通过选育抗病品种来预防稻瘟病是最佳选择，但由于其病菌小种遗传的复杂性和致病性的多样性，抗病新品种在推广3-5年后丧失抗性。目前，抗稻瘟病分子标记辅助育种主要利用与抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，大大提高了育种效率，但往往也存在分子标记与抗病基因不连锁导致辅助选择失败的情况。而利用抗病基因序列建立与稻瘟病抗病基因完全共分离的基因标签，则能让辅助选择理论上达到100％的准确性。
抗稻瘟病基因Pi1是较为广谱的抗性基因，但目前尚未有基因内特异性标记开发应用的报道。
目前，跟踪抗稻瘟病基因Pi1的分子标记一般用紧密连锁的SSR标记RM224或MGR4766，距离Pi1均有一定的距离，选择效率无法达到100％；也无法直接用来检测水稻样品中是否含有Pi1基因。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，开发一种水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记。本发明的目的还在于提供扩增该特异性分子标记的专用引物(引物对)。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种获得水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记的引物对，其正向引物为：GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG，反向引物为：AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。
所述的水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记为用上述引物对在含Pi1的C101LAC序列中扩增出来的核苷酸序列。
所述的引物对及分子标记可用于检测水稻样品是否含有抗稻瘟病基因Pi1。
通过本发明的特异性分子标记及专用引物能特异检测水稻样品中是否含有抗稻瘟病基因Pi1，100％准确跟踪遗传分离群体中的抗稻瘟病基因Pi1存在与否。
附图说明
图1是用引物对M-Pi1检测72个水稻品系的电泳图(部分)，1为Marker2000，从上到下的条带依次为2000、1000、750、500、250、100bp；条带2为水稻品系中编号为1含抗稻瘟病基因Pi1的单基因系IRBL1-CL，其余品种名见表1。
图2是用引物对M-Pi1检测LTH/IRBL1-CL的F2代单株的电泳图，1为Marker2000，从上到下的条带依次为2000、1000、750、500、250、100bp；有条带的单株对稻瘟病叶瘟表现为抗(R)，无带的单株对稻瘟病叶瘟表现为感病(S)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
根据抗稻瘟病基因Pi1与其等位基因Pikm，日本晴上的感病基因序列比对，设计出了能特异跟踪Pi1的引物对，命名为M_Pi1，其中，正向引物：GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG，反向引物：AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。
用引物对M_Pi1在含Pi1的C101LAC序列中可扩增出460bp的片段，该片段即为本发明水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记。
实施例2特异性检验
1.材料与方法
1.1水稻材料：水稻品系共72份(表1)。
1.2水稻基因组DNA提取
分别取种植于南宁的72份水稻叶片，通过CTAB法(Murray M G,ThompsonW F.Rapidisolation ofhigh molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research,1980,8(19):4321-4326.)提取水稻基因组DNA。
1.3PCR扩增
PCR反应体系为20μL的体系：2.0μL 10×Buffer，2.0μL dNTPs，正、反向引物各1.0μL(4mol/L)，0.2μL Taq DNA聚合酶，2.0μL模板DNA，13.8μL ddH2O。PCR反应程序94℃5min，然后35个循环94℃30s、58℃30s、72℃45s，最后72℃延伸10min。扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照。
2.结果与分析
在72个水稻品系中，只有含抗稻瘟病基因Pi1的抗稻瘟病单基因系IRBL1-CL有460bp的扩增产物，其余71个水稻品系均没有(图1)，从而说明用引物对M-Pi1PCR扩增得到的序列为抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记。
表172个水稻品系及M-Pi1检测的基因型
实施例3准确性测定
1材料与方法
1.1水稻材料
水稻品系IRBL1-CL与丽江新团黑谷(LTH)的F2代384个单株于2013年早稻种植于岑溪梨木镇稻瘟病病圃。
1.2水稻基因组DNA提取
插秧后14天分别取种植于384个单株的水稻叶片，通过CTAB法提取水稻基因组DNA。
1.3PCR扩增
PCR反应体系为20μL的体系：2.0μL 10×Buffer，2.0μL dNTP，正、反向引物各1.0μL(4mol/L)，0.2μL Taq DNA聚合酶，2.0μL模板DNA，13.8μL ddH2O。PCR反应程序94℃5min，然后35个循环94℃30s，58℃30s，72℃45s，最后72℃延伸10min。扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照。
1.4抗性调查插秧后35天，对F2群体的叶瘟发病情况进行调查，有稻瘟病典型病斑的记为S(对稻瘟病叶瘟表现为感病)，无典型病斑的记为R(对稻瘟病叶瘟表现为抗病)。
结果如下：水稻品系IRBL1-CL表现为抗(R)，LTH表现为感(S)。384个单株中，有293个单株表现为抗(R)，91个单株表现为S，R:S分离比为3:1(卡方0.35)。用引物对M-Pi1PCR扩增检测这384个单株，293个抗性单株均有460bp的产物，而91个单株无扩增产物(图2)。从而说明M-Pi1能100％准确跟踪抗稻瘟病基因Pi1。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种获得水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记的引物对，其特征在于：正向引物为：GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG，反向引物为：AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。
2.一种水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记，其特征在于：所述的分子标记为用权利要求1所述的引物对在含Pi1的C101LAC序列中扩增出来的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的分子标记在检测水稻样品是否含有抗稻瘟病基因Pi1中的应用。
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