CN116479159A - 一种与小麦籽粒镉积累相关的Indel分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与小麦籽粒镉积累相关的Indel分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。所述Indel分子标记为核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的DNA分子。本发明通过比较不同籽粒镉含量的小麦种质的TaHMTP功能基因，在DNA序列中确定了一个特有的188bp缺失多态性，以此作为分子标记应用于小麦籽粒镉含量的分子标记辅助选择，通过检测不同小麦品种的基因组中是否含有该188bp片段对小麦籽粒镉积累种质进行判断，可以快速筛选出小麦籽粒镉低积累新品种，提高小麦籽粒低镉积累新品种的选育效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种与小麦籽粒镉积累相关的Indel分子标记及其应用。
背景技术
镉(Cadmium,Cd)是已知生物毒性最强和农田受污染最严重的重金属之一，土壤中的镉主要来源于矿物岩石和大气沉降等自然因素，以及采矿、冶炼、工业“三废”的肆意排放以及农业生产等人为因素，而人类活动被认为是引起镉污染的主要因素。镉具有半衰期长，不易被微生物分解等特点，使其进入土壤后表现为不可逆的累积过程。
镉在土壤中的迁移性强，易被作物吸收并转移至地上部，不仅影响作物的品质和产量，更会通过食物链进入人体，严重危害人类健康。我国土壤镉污染问题严峻，2014年生态环境部和国土资源部发布的《中国土壤污染现状联合报告》显示在被认定为被污染的土壤中，82.4％的样本是由金属和类金属物质引起，而其中镉(7％)在重金属中排名最高。土壤镉污染已成为制约我国粮食安全生产和农业可持续发展的主要逆境之一。对于大规模的中、轻度镉污染农田，最经济有效的方式便是培育和种植可食用部位低镉积累品种。
减少作物食用器官镉积累已成为持续高效利用土地资源和保证农产品质量安全的一项重要科学任务。小麦是全世界最重要的粮食作物，也是种植面积最大的粮食作物之一，随着经济发展和人口增加，小麦需求也在不断增长，籽粒镉超标已成为小麦安全生产的最大威胁之一。研究表明，小麦不同品种间镉积累差异显著，籽粒镉含量主要取决于根和地上部的镉含量。镉在地上部的迁移控制着小麦籽粒镉的积累(Effects of noderestriction on cadmium accumulation in eight Chinese wheat(Triticum turgidum)cultivars.Science of The Total Environment,2020,725.)。杨玉敏等研究发现不同小麦品种的籽粒镉含量和镉迁移积累系数差异较大，存在明显基因型差异，利用基因型差异筛选出5份籽粒镉量较低且表现较稳定的小麦品种(四川推广小麦品种在镉胁迫下籽粒镉积累和生长响应[J].西南农业学报,2018,31(9):1796-1801.)。
因此，快速、准确、简易地对小麦籽粒镉积累特性进行鉴定对筛选和培育小麦籽粒低镉积累新品种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与小麦籽粒镉积累相关的Indel分子标记，将其用于鉴定小麦籽粒镉高积累和低积累种质，在小麦遗传育种领域加快籽粒低镉积累小麦品种的选择育种进程。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种与小麦籽粒镉积累相关的Indel分子标记，所述Indel分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
所述Indel分子标记由188个核苷酸组成，位于小麦2B染色体。本发明研究表明，在不同籽粒镉含量的小麦种质中存在两种单倍型，在镉低积累品种中，TaHMTP(Heavy metaltransport/detoxification superfamily protein)基因中存在188bp的片段，而镉高积累品种中没有该片段的插入。因此，通过检测小麦基因组DNA中是否含有该片段来辅助筛选小麦籽粒镉低积累种质。
本发明提供了所述的Indel分子标记在鉴别小麦籽粒镉积累品种或辅助筛选小麦籽粒镉低积累品种中的应用，所述应用包括：通过分子生物学手段检测待测小麦基因组DNA中是否含有所述的Indel分子标记，如含有所述Indel分子标记则判断待测小麦为籽粒镉低积累品种，反之则判断为籽粒镉高积累品种。
所述小麦籽粒镉低积累品种中籽粒镉含量低于0.050mg/kg，所述小麦籽粒镉高积累品种中籽粒镉含量≥0.050mg/kg。
进一步的，所述应用包括：利用PCR技术对待测小麦基因组DNA进行检测，PCR反应体系包括扩增包含所述Indel分子标记在内的小麦基因组DNA片段的PCR引物。
优选的，所述PCR引物包括上游引物和下游引物，上游引物为：5’-GTGGCAGTCTGGAATGAGCA-3’；下游引物为：5’-TCTGAGCAAAGAATAGGCGCA-3’。
利用上述引物对对不同小麦基因型进行PCR扩增，可用于筛选不同籽粒镉含量的小麦种质资源，具体的，当待测小麦为籽粒镉低积累品种时，利用上述PCR引物扩增得到的PCR产物为1521bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中含有188bp的Indel分子标记(Indel+188)，Indel起始位点位于扩增片段的第419bp后。当测小麦为籽粒镉高积累品种时，利用上述PCR引物扩增得到的PCR产物为1345bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中缺失188bp的Indel分子标记(Indel-188)。
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒镉积累品种的方法，包括以下步骤：
(1)以待测小麦基因组DNA为模板，利用上述PCR引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)根据PCR产物是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Indel分子标记进行小麦品种鉴定；
所述PCR产物不含所述Indel分子标记的待测小麦籽粒镉积累高于所述PCR产物含有所述Indel分子标记的待测小麦。
所述Indel分子标记在小麦的各个组织及发育阶段均可检测到，因此可以在小麦苗期进行筛选，加快其选择育种进程。优选的，步骤(1)中，取待测小麦苗期叶片进行基因组DNA提取。
优选的，PCR扩增反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix 10μL，10μmol/L Primer各1μL，模板DNA 0.04-0.4μg，无菌水补齐20μL。
优选的，PCR反应程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
步骤(2)中，通过琼脂糖凝胶电泳图谱判断扩增产物条带位置大小。若扩增产物包含188bp序列，则待测小麦为籽粒低镉积累材料；若扩增产物不包含188bp序列，则待测小麦为籽粒高镉积累材料。
本发明具备的有益效果：
本发明通过比较不同籽粒镉含量的小麦种质的TaHMTP功能基因，在其DNA序列中确定了一个特有的188bp缺失多态性，以此作为分子标记应用于小麦籽粒镉含量的分子标记辅助选择，通过检测不同小麦品种的基因组中是否含有该188bp片段对小麦籽粒镉积累种质进行判断，可以快速筛选出小麦籽粒镉低积累新品种，提高小麦籽粒低镉积累新品种的选育效率。
附图说明
图1为8份不同籽粒镉含量小麦种质的PCR扩增产物电泳图。
图2为2种单倍型小麦籽粒镉含量(平均值)。
图3为75份小麦种质中两种单倍型籽粒镉含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
(1)供试材料
利用8份核心种质为材料，于2018-2019年种植于浙江宁波，成熟期收获种子，干燥后保存。
(2)籽粒镉含量测定
将种子研磨成粉，称取0.3g放入硝解管并加入硝酸，微波消解法提取籽粒中镉，ICP-MS测定提取液中镉含量。结果见表1。
表1
(3)Indel分子标记确定
前期研究中，我们通过全基因组关联分析在染色体2B上鉴定到的一个与小麦籽粒镉含量显著关联的QTL。在该QTL区间范围内结合基因注释筛选到一个与重金属转运解毒相关的基因TaHMTP(HEAVY METAL TRANSPORT/DETOXIFICATION SUPERFAMILY PROTEIN)，GeneID为TraesCS2B02G023300，Location 2B:10867999-10869126。
在不同种质中对该基因的全基因组DNA序列进行扩增，上游引物F为5’-GTGGCAGTCTGGAATGAGCA-3’；下游引物R为：5’-TCTGAGCAAAGAATAGGCGCA-3’。方法如下：
1)DNA提取
将约2cm长的小麦叶片置于装有研磨珠的1.5ml离心管中，加入500μL 1.5×CTAB，设定研磨机程序(频率为50Hz；时间：2min)，研磨完毕后至于56℃水浴锅中，水浴加热20min。水浴完毕，加入500μL氯仿置于摇床中，设定转速为60rpm，30min。然后将离心管置于离心机，8000rpm离心10min。吸取400μL上清液至新的离心管，加入800μL冷却的无水乙醇，放置于-20℃冷却20min。等其冷却完毕，12000rpm离心，10min，弃上清，并加入500μL 75％乙醇，再进行12000rpm离心5min，弃上清。最后置于超净台吹干或自然晾干之后，加30-100μL ddH2O溶解，待用。
2)PCR反应
PCR扩增反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)10μL，10μmol/L Primer各1μL，模板DNA 1μL(20μL体系模板量0.04-0.4μg)，无菌水7μL，反应总量20μL。
PCR反应在PCR仪上进行，反应程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
对8份小麦种质资源的全基因组DNA扩增，发现电泳条带存在高低差异，扩增大小为1521bp和1345bp，经测序，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。测序结果显示该序列在镉积累品种中存在两种单倍型，在镉低积累品种中存在188bp片段，序列如SEQ ID NO.1所示，该片段起始位点位于扩增片段SEQ ID NO.2的第419bp后；镉高积累品种中缺失该片段，除了188bp大片段的缺失，还存在其他个别碱基差异。
结合表型数据，制作柱状图，如图2所示。镉低积累品种(Indel+188)中籽粒镉含量平均值为0.017mg kg-1，镉高积累品种(Indel-188)中籽粒镉含量平均值为0.095mg kg-1。
实施例2
(1)供试材料
利用75份核心种质为材料，于2018-2019年种植于浙江宁波，成熟期收获种子，干燥后保存。
(2)籽粒镉含量测定
将种子研磨成粉，微波消解法提取籽粒中镉，ICP-MS测定提取液中镉含量，结果如表2所示。
(3)Indel分子标记检测
提取75份小麦植株基因组DNA，依据前述引物对进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，进而判断是否有188bp插入，结果如表2所示。
表2
结合表型数据，Indel-188型籽粒镉含量显著高于Indel+188型籽粒镉含量，结果如图3所示。
我们扩大群体对75份小麦种质资源的DNA序列进行扩增，利用SPSS对籽粒镉含量与是否存在188bp片段两个变量进行皮尔逊相关性分析，结果表明相关系数达到0.81，在0.01水平上与籽粒Cd含量显著相关。说明该片段的插入与籽粒镉含量存在相关性，可以作为分子标记筛选低镉积累新品种。
以上结果说明该Indel分子标记可以应用于小麦籽粒镉含量的分子标记辅助选择。
Claims (8)
1.一种与小麦籽粒镉积累相关的Indel分子标记，其特征在于，所述Indel分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
2.如权利要求1所述的Indel分子标记在鉴别小麦籽粒镉积累品种或辅助筛选小麦籽粒镉低积累品种中的应用，其特征在于，所述应用包括：通过分子生物学手段检测待测小麦基因组DNA中是否含有所述的Indel分子标记，如含有所述Indel分子标记则判断待测小麦为籽粒镉低积累品种，反之则判断为籽粒镉高积累品种。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用PCR技术对待测小麦基因组DNA进行检测，PCR反应体系包括扩增包含所述Indel分子标记在内的小麦基因组DNA片段的PCR引物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR引物包括上游引物和下游引物，上游引物为：5’-GTGGCAGTCTGGAATGAGCA-3’；下游引物为：5’-TCTGAGCAAAGAATAGGCGCA-3’。
5.一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒镉积累品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测小麦基因组DNA为模板，利用权利要求3或4所述的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)根据PCR产物是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Indel分子标记进行小麦品种鉴定；
所述PCR产物不含所述Indel分子标记的待测小麦籽粒镉积累高于所述PCR产物含有所述Indel分子标记的待测小麦。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，取待测小麦苗期叶片进行基因组DNA提取。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：2×Rapid Taq MasterMix 10μL，10μmol/L Primer各1μL，模板DNA 0.04-0.4μg，无菌水补齐20μL。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
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