CN111455090A

CN111455090A - 与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的关键snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111455090A
Application number: CN202010442342.4A
Authority: CN
Inventors: 姚小华; 林萍; 王开良
Original assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2040-05-22
Also published as: CN111455090B

Abstract

本发明提供与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记及其应用。所述分子标记选自PB.70158.1‑473、PB.70158.1‑649、PB.70158.1‑704和PB.70158.1‑707中的任一个。本发明提供的SNP标记位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响，目的性更强，工作量小，效率更高，成本低。通过检测这些SNP位点，可在苗期进行鉴定和辅助筛选，大大节约生产成本和提高选择效率。利用本发明的分子标记进行高亚麻酸含量油茶育种，可提高油茶育种的选择效率，加快育种进程。

Description

与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体地说，涉及与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记及其应用。

背景技术

近年来产业的迅速发展使得油茶(Camellia oleifera)作为唯一的木本油料，成为我国四大油料(油菜、花生、大豆和油茶)之一。油茶油不饱和脂肪酸含量高，且以性质稳定的油酸为主要成分，是营养价值可与橄榄油媲美，又适应中国民众高温烹饪习惯的高档保健食用油。大力发展油茶产业，既可以有效缓解耕地压力，增加我国食用油供给能力，又可有效改善我国居民的膳食结构。油茶产业健康、持续发展，高产、高油、质优的新品种是基础和关键。

目前，油茶育种以选择和杂交育种为主要手段、以产果量为主要育种目的，并已取得了重要进展，以改良含油率和油脂品质为目的的育种研究开展较少。项目组的前期研究表明，以已收集的大量优良种质为基础，选育高产、高含油率和高油脂品质的“三高”新品种是可行及必要的。但是，由于童期长，采用选择和杂交等传统育种技术选育油茶新品种的周期长达12～20年，缓慢的良种选育速度严重阻滞了油茶产业的发展。分子标记辅助选择(MAS)育种可大幅缩短育种的进程，将其应用于童期长的果用经济林的育种，优势尤其明显。因此，发掘油茶含油率、脂肪酸组分等性状的等位基因变异，解析其油脂性状调控机制，是推动油茶经济性状分子辅助育种的关键，这将有效缩短育种周期，加快油茶育种的进程。

油茶分子标记辅助育种研究起步较晚，主要集中在品种鉴别、自然群体或杂交群体遗传多样性研究等方面，与性状，尤其是经济性状相关的分子标记辅助育种研究较少涉及。同时，由于生产上广泛种植的普通油茶为6倍体，高度复杂的遗传背景为油茶经济性状相关标记开发及关键调控基因挖掘带来巨大阻碍。

发明内容

本发明的目的是提供与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记，所述分子标记选自PB.70158.1-473、PB.70158.1-649、PB.70158.1-704和PB.70158.1-707中的任一个；

其中，标记PB.70158.1-473含有油茶如SEQ ID NO:3所示序列第473bp处的多态性为C/G的核苷酸序列；

标记PB.70158.1-649含有油茶如SEQ ID NO:3所示序列第649bp处的多态性为A/G的核苷酸序列；

标记PB.70158.1-704含有油茶如SEQ ID NO:3所示序列第704bp处的多态性为G/A的核苷酸序列；

标记PB.70158.1-707含有油茶如SEQ ID NO:3所示序列第707bp处的多态性为A/C的核苷酸序列。

其中，标记PB.70158.1-473所含多态性位点的基因型为GG，对应于高亚麻酸含量，若基因型为CG或CC，对应于低亚麻酸含量；

标记PB.70158.1-649所含多态性位点的基因型为GG，对应于高亚麻酸含量，若基因型为AG或AA，对应于低亚麻酸含量；

标记PB.70158.1-704所含多态性位点的基因型为AA，对应于高亚麻酸含量，若基因型为AG或GG，对应于低亚麻酸含量；

标记PB.70158.1-707所含多态性位点的基因型为CC，对应于高亚麻酸含量，若基因型为AC或AA，对应于低亚麻酸含量。

第二方面，本发明提供与油茶种子亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记组合，所述分子标记组合选自PB.70158.1-473、PB.70158.1-649、PB.70158.1-704和PB.70158.1-707中的至少两个。

优选地，该分子标记组合包括上述全部四个SNP分子标记。

第三方面，本发明提供与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的DNA分子标记，所述分子标记包含4个SNP位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中第473、649、704和707bp处的碱基n分别为c或g，a或g，g或a，a或c。

第四方面，本发明提供用于扩增所述分子标记的引物，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。

第五方面，本发明提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。

第六方面，本发明提供高亚麻酸含量油茶品种的鉴定及选育方法，包括：

1)提取待测油茶总RNA，反转录合成cDNA；

2)以cDNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

优选地，PCR反应程序为：95℃3min；95℃15s，68℃45s，共40个循环；68℃5min。

步骤3)包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：

若标记PB.70158.1-473对应的多态性位点的基因型为GG，判定待测油茶为高亚麻酸含量，若基因型为CG或CC，则待测油茶为低亚麻酸含量；和/或

若标记PB.70158.1-649对应的多态性位点的基因型为GG，判定待测油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AG或AA，则待测油茶为低亚麻酸含量；和/或

若标记PB.70158.1-704对应的多态性位点的基因型为AA，判定待测油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AG或GG，则待测油茶为低亚麻酸含量；和/或

若标记PB.70158.1-707对应的多态性位点的基因型为CC，判定待测油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AC或AA，则待测油茶为低亚麻酸含量。

第七方面，本发明提供所述分子标记、所述分子标记组合、所述引物或所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)用于油茶种质资源亚麻酸含量的鉴定及改良；

(2)用于油茶亚麻酸含量早期预测；

(3)用于油茶亚麻酸含量性状的分子标记辅助育种。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

1、在油茶全分布区内广泛收集油茶种质资源，建立油脂中亚麻酸含量发生广泛分离的油茶自然群体。

2、采集自然群体500份油茶种质的完全成熟种子，用气象色谱法测定成熟种子油脂的5种脂肪酸成分含量，包括硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，具体方法按照GB/T17376《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》和GB/T 17377《动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析》执行。

3、采集自然群体500个油茶单株的油脂高速合成期的种仁，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)提取总RNA，每样本分别构建cDNA文库，利用Illumina HiSeq^TM 4000平台进行二代转录组测序。

4、采集油茶“长林4号”的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子，采用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取RNA，各组织RNA等比例混合，构建PacBio SMRTbell文库，在PacBio Sequel平台进行三代转录组测序。测序结果过滤掉低质量数据和冗余序列后，对所有转录本进行注释分析。分析过程中使用的软件包括：LoRDEC(http://www.atgc-montpellier.fr/lordec/)、CD-HIT v4.6(Fu L,Niu B,Zhu Z,Wu S,Li W,2012.CD-HIT:accelerated for clustering the next-generation sequencing data.Bioinformatics 28,3150-2.)、Coding PotentialCalculator(CPC)(Kong L,Zhang Y,Ye Z-Q,et al.,2007.CPC:assess the protein-coding potential of transcripts using sequence features and support vectormachine.Nucleic Acids Research 35,W345.)和Coding-Non-Coding Index(CNCI)(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)。

5、以步骤4中获得的全长转录组序列为参考序列，采用多序列比对法，分析步骤3中获得的500个样本转录组序列的SNP位点。SNP数据根据以下原则严格过滤：每个位点只有2个等位基因；基因型缺失率≤20％；最小等位基因频率≥5％；SNP质量值≥100；纯合基因型样本数超过10个；杂合基因型率≤70％。分析过程中使用的软件为bcftools v1.9software(http://www.htslib.org/doc/bcftools.html)。

6、将群体的基因型数据输入GCTA v1.25.2(Jian Y,S Hong L,Goddard ME,Visscher PM,2011.GCTA:a tool for genome-wide complex trait analysis.AmericanJournal of Human Genetics 88,76-82.)软件，进行主成分分析(PCA)。

7、将群体的基因型数据、前10个主成分数据、油脂中亚麻酸含量的表型数据以及Kinship矩阵数据输入TASSEL5.0(http://www.maizegenetics.net/tassel)软件中，采用统一混合模型方法(MLM)分析SNPs标记和油茶油脂中亚麻酸含量性状的连锁不平衡性。

采用上述方法，本发明最终获得了与油茶油脂中亚麻酸含量极显著关联的4个SNP标记(P<10^-5)，这些标记位于油茶的PB.70158.1转录本内(表1)，对表型变异的贡献率为19.25％～28.62％(R2，表1)。

表1

序号

Associated SNP

REF

ALT

Region

function_type

function

P-value

R<sup>2</sup>(％)

1

PB.70158.1-473

C

G

exonic

nonsynonymous

exon1:c.C449G:p.A150G

1.80E-16

28.62

2

PB.70158.1-649

A

G

exonic

nonsynonymous

exon1:c.A625G:p.I209V

1.04E-10

19.25

3

PB.70158.1-704

G

A

exonic

synonymous

exon1:c.G680A:p.X227X

4.44E-13

23.44

4

PB.70158.1-707

A

C

downstream

-

5.62E-12

21.50

进一步地，本发明与油茶油脂中亚麻酸含量相关的SNP分子标记可以分别由核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得。

>PB.70158.1

ACACACACACACAGCAGAGGAAAAATGAAAAGCATTCCAGAGATGTTACTGTGTTGTAGTTCTGATCATAAGCCAATTCCTCTTGTGGGGTTTGGAACAGCTGTTTATCCTCTTTCATCCTCTGAAACCATGAAACAATCCATCCTCCATGCAATCAAACTTGGTTACAGACACTTCGACTCTGCAACTTTATACCAGTCAGAGCAGCCTCTTGGAGAATCAATTGTTGATGCCATACGCCTAGGCTTCATTCAATCTCGCCAAGACCTCTTCATCACCTCTAAGCTTTGGTGTTCTGATGCTCACCCTCATCATGTCCTCCCTGCTCTTCAAAATTCACTCAAGAATCTTGGATTGGAATACCTTGATCTGTATCTCATTCACTGGCCAGTGAGCTCAAAGCCAGGTAAATTTGAGTATCCGGTGAACAAGCAAGAGCTTCTTCCCATGGATTTCAAGTCTGTTTGGGAAGCCATGGAGGAGTGTCAGAATCTTGGCCTCACAAAATTTATTGGAGTCAGTAACTTCTCATGCAAGAAGCTCCAATTATTACTAGCAACCGCAAAGATCCCTCCAGCTGTCAACCAGGTCGAGATGAACCCACTTTGGCAACAGAAGAAGCTAAGAGAGTTTTGTGAGAAAAATGGTATTCATATCACAGCTTACTCTCCTTTGGGCGCCAAAGGAACAATTTGGGGGAAGTGACAAAGTCATGGAATGTGAGGTGCTCAAACAGATTGCCAAAGCTAGAGGAAAATCTGTTGCCCAGGTTTGTCTCAGATAGGGTTTATGAGCAAGGGGTGAGTGTTCTGGTGAAGAGCTTCAGTGAGGAGAGGATGAAAGAGAACCTTCAAATATTTGATTGGGAGCTAAGCGCACAAGACTCCGAGATGATAAATCAAATTTCACAGTATAAAGGATGTGCTGGACTTGATTTCATATCAGATGAAGGCCCTTACAAATCTCTCCAGGATTTATGGGATGGTGAAATTGTTTGATCCTGTAAACGTGTAGCCAAAAACCACTTAGATACCGTTTGATAACATTTTATGCTTACAACACAAATTAATGTGTGTTTTATGTTTACAAAAACTTTGGAAACTGTTTGGTTTTTTATTTTCATTTATGGTTTGATCATTGATTTCACAGTTACATTTCACTTTATTGAATGTCATTGCTTGGTTGGTGCTGCT

本发明与油茶油脂中亚麻酸含量相关的SNP分子标记PB.70158.1-473、PB.70158.1-649、PB.70158.1-704和PB.70158.1-707通过核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.70158.1转录本的473bp、649bp、704bp和707bp处的碱基，其多态性分别为C/G、A/G、G/A和A/C。

本发明提供了上述4个SNP分子标记在鉴定油茶种仁油中亚麻酸含量表型中的应用，若PB.70158.1-473位点的基因型为GG时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为CG或CC时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-649位点的基因型为GG时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AG或AA时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-704位点的基因型为AA时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AG或GG时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-707位点的基因型为CC时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AC或AA时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。

具体方法为：(1)将待鉴定油茶材料嫩叶提取总RNA，反转录生成单链cDNA后，分别采用引物对SEQ ID NO:1-2进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物；

(2)对PCR产物进行测序，并分别鉴定4个位点的基因型，若PB.70158.1-473位点的基因型为GG时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为CG或CC时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-649位点的基因型为GG时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AG或AA时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-704位点的基因型为AA时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AG或GG时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-707位点的基因型为CC时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AC或AA时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。

所述待鉴定油茶可以为任何育种材料，包括自然群体个体和有性群体个体。

上述方法中，提取油茶总RNA采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)。反转录合成单链cDNA，采用PrimeScript RTMaster Mix试剂盒(TaKaRa)。

上述方法中，PCR反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性15s，68℃退火及延伸45s，40个循环；68℃5min，1个循环彻底延伸。

琼脂糖凝胶电泳所使用的琼脂糖凝胶浓度为1.2％。胶回收使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AxyGEN,Code No.AP-GX-50)。上述方法测定PCR产物的碱基序列，采用引物对SEQ ID NO:1-2作为测序引物，采用一代测序技术。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供4个与油茶种仁油中亚麻酸含量高度关联的SNP位点，分别可以解释28.62％、19.25％、23.44％和21.50％的亚麻酸含量表型方差。利用这4个标记对有性油茶群体进行了辅助选择，结果表明，PB.70158.1-473位点的基因型为GG的单株中，91.67％的个体其种子油脂中亚麻酸含量高于群体亚麻酸含量平均值；PB.70158.1-649位点的基因型为GG的个体中，85.19％的个体其种子油脂中亚麻酸含量高于群体平均值；PB.70158.1-704位点的基因型为AA的单株中，94.44％的个体其种子油脂中亚麻酸含量高于群体平均值；PB.70158.1-707位点的基因型为CC的单株中，90.00％的个体其种子油脂中亚麻酸含量高于群体平均值。这表明该标记用于辅助选择是切实有效的。

本发明提供的油茶种子油脂中亚麻酸含量关联位点的开发方法，其原理是油茶是典型的异交物种，连锁不平衡(LD)通常在较小的范围内迅速消减，因此可以开展重要性状的LD作图。油茶的种仁全部转录本作为本发明标记开发的区域。在具备产生了大量明显的遗传变异的油茶自然群体的前提下，可有效开展与油茶亚麻酸含量变异显著相关的标记开发。

在油茶常规选择育种中，油脂中亚麻酸含量性状的鉴定需要幼苗造林5-6年才能测定，费时费力。本发明提供的SNP位点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响，目的性更强，工作量小，效率更高，成本低。因此，通过检测该批SNP位点，可在苗期进行鉴定和辅助筛选，大大节约生产成本和提高选择效率。利用本发明的分子标记进行高亚麻酸含量油茶育种，可提高油茶育种的选择效率，加快育种进程。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中所用的自然群体材料500份油茶单株，均由中国林业科学研究院亚热带林业研究所木本油料研究组收集、评价，并保存于浙江金华婺城区东方红林场种质资源圃。

实施例1油茶油脂中亚麻酸含量分离群体的构建及性状测定

本实施例中使用普通油茶资源收集圃内500份种质资源的自然群体，其起源地涵盖我国油茶主产区的大部分，包括浙江省、湖南省、江西省、广西区、福建省、广东省等。500个体待果实完全成熟后(5％果实开裂)，分别采集种子，提取油脂测定脂肪酸成分及含量。其操作步骤如下：

(1)适量油茶种子用烤箱80℃烘烤过夜至恒重，剥去硬种皮。

(2)种仁用粉碎机粉碎后，用中速滤纸包好，加入适量石油醚浸泡抽提过夜。

(3)待石油醚完全挥发后，利用Agilent6890N气相色谱仪按照GB/T17376-2008、GB/T17377-2008方法测定脂肪酸成分及含量。

脂肪酸成分含量测定结果表明，自然群体种仁油中亚麻酸含量均呈正态分布，说明该性状具有数量性状特点。

实施例2油茶三代转录组测序及注释分析

1、三代测序样本RNA的提取

采集油茶“长林4号”的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取RNA，具体步骤如下：

(1)首先在1.5ml离心管中加入500μl的裂解液SL(预先加入β-巯基乙醇)。取0.1g样本材料加入液氮充分研磨，迅速将研磨好的粉末加入到离心管中，立即旋涡剧烈震荡混匀。

(2)12000rpm离心2分钟。

(3)将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm离心2分钟，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

(4)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。注意，若果上清液体积有损失，请相应调整乙醇的加量。

(5)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(6)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free的离心管中，加入70μl RDD缓冲液，轻柔混匀。

(7)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15分钟。

(8)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(10)重复步骤9。

(11)12000rpm离心2分钟，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，得到RNA溶液。

2、三代转录组测序与注释分析

通过纯度和浓度检测的五个组织样品总RNA，等比例混合，利用Clontech

PCR cDNA合成试剂盒进行反转录合成单链cDNA。利用KAPA HiFi PCR试剂盒以单链cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，生成双链cDNA。生成的双链cDNA利用Blue Pippin分成0.5-2kb，2-3kb，3-6kb三个长度片段库。然后进行第二轮PCR扩增产生充足的cDNA，构建PacBio SMRTbell文库，在PacBio Sequel平台进行三代转录组测序。利用SMRTlink 5.0软件处理测序数据。测序结果过滤掉低质量数据和冗余序列后，生成CCS。根据序列是否含有5’primer，3’primer和polyA尾巴，将所有的CCS分为全长和非全长序列两大类。全长的CCS采用ICE算法在缺省参数条件下进行聚类分析产生CS。利用Arrow和LoRDEC(http://www.atgc-montpellier.fr/lordec/)软件进一步过滤CS，利用CD-HIT v4.6(Fu L,Niu B,Zhu Z,Wu S,Li W,2012.CD-HIT:accelerated for clustering the next-generationsequencing data.Bioinformatics 28,3150-2.)软件去除冗余序列。

利用Coding Potential Calculator(CPC)(Kong L,Zhang Y,Ye Z-Q,et al.,2007.CPC:assess the protein-coding potential of transcripts using sequencefeatures and support vector machine.Nucleic Acids Research 35,W345)和Coding-Non-Coding Index(CNCI)(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)软件在参数缺省条件下进行转录本的蛋白编码潜能预测。未通过蛋白编码潜能检测的转录本进一步在Swiss-Prot数据库中比对，若在Swiss-Prot数据库中仍无注释，则认为该转录本为长链非编码RNA。其它的转录本进一步在NR、Swiss-Prot、COG、KEGG和GO等数据库中比对，注释转录本。

实施例3油脂高速合成期种仁转录组测序及多态位点识别

1、500个油茶无性系油脂高速合成期种仁总RNA提取

利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取各无性系未成熟种仁的总RNA(参见实施例2)。

2、二代转录组测序

通过纯度和浓度检测的各样品总RNA，去除其中的核糖体RNA，以最大限度地保留所有coding RNA和ncRNA。得到的RNA随机打断成短片段，再以片断化后的RNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链；接着加入缓冲液、dNTPs(dUTP代替dTTP)、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱，经末端修复、加碱基A，加测序接头，然后通过UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二条链。用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增。最后建好的测序文库用Illumina HiSeq^TM 4000平台进行二代转录组测序。

3、多态位点识别

为了保证数据质量，对下机后经过初步过滤得到的clean reads进行进一步更严格的过滤，得到高质量的clean reads，用于后续的信息分析。过滤的步骤如下：

(1)去除含有接头的reads；

(2)去除全部都是A碱基的reads；

(3)去除含N比例大于10％的reads；

(4)去除低质量的reads(质量值Q≤20的碱基数占整条reads的50％以上)。

采用Tophat v2.1.1(Trapnell C,Roberts A,Goff L,et al.,2012.Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seqexperiments with TopHat and Cufflinks.Nature protocols 7,562-78.)软件将每个样本的高质量的reads比对到参考转录组序列上(参见实施例2)。剔除没有比对上的序列，其余序列利用bcftools v1.9软件(http://www.htslib.org/doc/bcftools.html)识别SNP位点。识别的SNP位点经过严格过滤，获得高质量的SNPs数据。过滤标准如下：

(1)位点上只有2个等位基因；

(2)基因型缺失率≤20％；

(3)最小等位基因频率(MAF)≥5％；

(4)SNP质量值≥100；

(5)纯合子基因型的样本数大于10个；

(6)杂合基因型样本率≤70％。

实施例4与油茶油脂中亚麻酸含量相关的SNP位点的筛选

1、利用GCTA v1.25.2(Jian Y,S Hong L,Goddard ME,Visscher PM,2011.GCTA:atool for genome-wide complex trait analysis.American Journal of HumanGenetics 88,76-82.)软件对油茶自然群体进行主成分分析(PCA)，利用前10个主成分(PC)作为固定效应用于后续的关联分析(表2)。

表2自然群体部分个体的前10个PC值

2、将所有样本的SNPs位点数据、前10个PC值数据、表型数据(参见实施例1)及Kinship矩阵数据导入TASSEL5.0软件中，采用MLM法分析SNPs与亚麻酸含量性状的关联性，筛选与油脂中亚麻酸含量显著关联的分子标记，经多重检验校正，检测到4个与亚麻酸含量存在极显著关联的位点，这些位点位于转录本PB.70158.1内，1个位于非编码区，3个位于编码区，引起2个非同义突变和1个同义突变，对亚麻酸含量差异的贡献率为19.25％～28.62％(表1)。

实施例5 4个分子标记在高亚麻酸油茶育种中的应用

1、选择一个油茶杂交F1代家系群体(母本为长林53号，父本为长林40号，均为国家审定良种，良种号分别为“国S-SC-CO-012-2008”和“国S-SC-CO-011-2008”)为材料，采集嫩叶提取总RNA(参见实施例2)。以RNA为模板，采用Clontech cDNA合成试剂盒反转录生成单链cDNA，并稀释100倍，作为工作液。

2、利用SEQ ID NO:1-2所示的引物对对单链cDNA工作液分别进行PCR扩增，反应体系如下：

PCR反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性15s，68℃退火及延伸45s，40个循环；68℃5min，1个循环彻底延伸。

3、PCR扩增产物进行凝胶检测和纯化回收并测序、基因分型。凝胶检测和纯化回收按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AxyGEN,Code No.AP-GX-50)说明书进行，其流程如下：

①配制1.2％的琼脂糖凝胶，将50μl扩增产物全部上样，电泳电压为5V/cm，电泳约20分钟至上样缓冲液中二甲苯青达到距离凝胶前端1cm处时停止电泳。

②在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(例如100mg＝100μl体积)。

③加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，每2～3分钟间断混合，直至凝胶块完全熔化。

④加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

⑤将上述溶液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑥加入500μl Buffer W1，12000rpm离心30秒，弃滤液。

⑦加入700μl Buffer W2，12000rpm离心30秒，弃滤液。以同样的方法再用700μlBuffer W2洗涤一次，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑧将制备管放回离心管中，12000rpm离心1分钟。

⑨将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25～30μl去离子水，室温静置1分钟。12000rpm离心1分钟洗脱DNA。

⑩凝胶回收DNA，以对应的扩增引物为测序引物，采用一代测序测定扩增产物核苷酸序列，用Chromas软件判读测序峰图上每个SNP位点的基因型。

4、分别鉴定所有个体的4个位点的基因型。对照各位点的基因型与亚麻酸含量高低的关系，若PB.70158.1-473位点的基因型为GG时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为CG或CC时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-649位点的基因型为GG时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AG或AA时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-704位点的基因型为AA时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AG或GG时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。若PB.70158.1-707位点的基因型为CC时，待鉴定油茶为高亚麻酸含量，若基因型为AC或AA时，待鉴定油茶为低亚麻酸含量。

5、采集所有F1代个体完全成熟种子，测定其种子油脂中亚麻酸含量(参见实施例1)。结果表明，PB.70158.1-473位点的基因型为GG的单株中，91.67％的个体其种子油脂中亚麻酸含量高于群体亚麻酸含量平均值(0.2858％)；PB.70158.1-649位点的基因型为GG的个体中，85.19％的个体其种子油脂中亚麻酸含量高于群体平均值(0.2858％)；PB.70158.1-704位点的基因型为AA的单株中，94.44％的个体其种子油脂中亚麻酸含量高于群体平均值(0.2858％)；PB.70158.1-707位点的基因型为CC的单株中，90.00％的个体其种子油脂中亚麻酸含量高于群体平均值(0.2858％)(表3)。这表明该4个标记用于辅助选择是切实有效的，可用于早期鉴别或辅助鉴别，可大大节约生产成本，提高选择效率，加快油茶高油育种进程。

表3 F1单株的种子油脂中亚麻酸含量及基因型数据

注：表中“..”表示基因型缺失。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120> 与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记及其应用

<130> KHP201112318.9

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acacacacac acagcagagg a 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcagcacca accaagcaat gac 23

<210> 3

<211> 1193

<212> DNA

<213> 油茶(Camellia oleifera)

<400> 3

acacacacac acagcagagg aaaaatgaaa agcattccag agatgttact gtgttgtagt 60

tctgatcata agccaattcc tcttgtgggg tttggaacag ctgtttatcc tctttcatcc 120

tctgaaacca tgaaacaatc catcctccat gcaatcaaac ttggttacag acacttcgac 180

tctgcaactt tataccagtc agagcagcct cttggagaat caattgttga tgccatacgc 240

ctaggcttca ttcaatctcg ccaagacctc ttcatcacct ctaagctttg gtgttctgat 300

gctcaccctc atcatgtcct ccctgctctt caaaattcac tcaagaatct tggattggaa 360

taccttgatc tgtatctcat tcactggcca gtgagctcaa agccaggtaa atttgagtat 420

ccggtgaaca agcaagagct tcttcccatg gatttcaagt ctgtttggga agncatggag 480

gagtgtcaga atcttggcct cacaaaattt attggagtca gtaacttctc atgcaagaag 540

ctccaattat tactagcaac cgcaaagatc cctccagctg tcaaccaggt cgagatgaac 600

ccactttggc aacagaagaa gctaagagag ttttgtgaga aaaatggtnt tcatatcaca 660

gcttactctc ctttgggcgc caaaggaaca atttggggga agtnacnaag tcatggaatg 720

tgaggtgctc aaacagattg ccaaagctag aggaaaatct gttgcccagg tttgtctcag 780

atagggttta tgagcaaggg gtgagtgttc tggtgaagag cttcagtgag gagaggatga 840

aagagaacct tcaaatattt gattgggagc taagcgcaca agactccgag atgataaatc 900

aaatttcaca gtataaagga tgtgctggac ttgatttcat atcagatgaa ggcccttaca 960

aatctctcca ggatttatgg gatggtgaaa ttgtttgatc ctgtaaacgt gtagccaaaa 1020

accacttaga taccgtttga taacatttta tgcttacaac acaaattaat gtgtgtttta 1080

tgtttacaaa aactttggaa actgtttggt tttttatttt catttatggt ttgatcattg 1140

atttcacagt tacatttcac tttattgaat gtcattgctt ggttggtgct gct 1193

Claims

1.与油茶种仁油中亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记选自PB.70158.1-473、PB.70158.1-649、PB.70158.1-704和PB.70158.1-707中的任一个；

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，标记PB.70158.1-473所含多态性位点的基因型为GG，对应于高亚麻酸含量，若基因型为CG或CC，对应于低亚麻酸含量；

3.与油茶种子亚麻酸含量相关的关键SNP分子标记组合，其特征在于，所述分子标记组合选自PB.70158.1-473、PB.70158.1-649、PB.70158.1-704和PB.70158.1-707中的至少两个；

其中，标记PB.70158.1-473、PB.70158.1-649、PB.70158.1-704和PB.70158.1-707同权利要求1或2中所述。

4.用于扩增权利要求1或2所述分子标记的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。

5.含有权利要求4所述的引物的检测试剂或试剂盒。

6.高亚麻酸含量油茶品种的鉴定及选育方法，其特征在于，包括：

1)提取待测油茶总RNA，反转录合成cDNA；

2)以cDNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：95℃3min；95℃15s，68℃45s，共40个循环；68℃5min。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：

9.权利要求1或2所述分子标记、权利要求3所述分子标记组合、权利要求4所述引物或权利要求5所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)用于油茶种质资源亚麻酸含量的鉴定及改良；

(2)用于油茶亚麻酸含量早期预测；

(3)用于油茶亚麻酸含量性状的分子标记辅助育种。