CN111500763B

CN111500763B - 与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111500763B
Application number: CN202010456767.0A
Authority: CN
Inventors: 王开良; 林萍; 姚小华
Original assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN111500763A

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供2个与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记PB.10070.2‑202和PB.7527.1‑77。PB.10070.2‑202含有如SEQ ID NO.1所示序列第202位的多态性为G/A的核苷酸序列；PB.7527.1‑77含有如SEQ ID NO.2所示序列的第77位的多态性为G/A的核苷酸序列。利用这2个标记进行油茶棕榈油酸含量表型的鉴定，可实现苗期的鉴定和辅助筛选，有效提高油茶育种的选择效率，加快育种进程。

Description

与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

油茶(Camellia oleifera Abel.)隶属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L.)，是木本油料树种。油茶籽油含有丰富的营养物质，是一种优质的食用油，其不饱和脂肪酸含量达90％以上，以油酸和亚油酸为主。油茶籽油具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等功效，具有较高的营养保健价值。目前，以选择和杂交育种为主要手段、以产果量为主要育种目的的油茶育种已取得了重要进展，但以改良油茶籽油品质为目的育种研究仍较少。油茶的常规育种周期很长，新品种选育缓慢，因此良种选育速度还不能满足产业发展的需求，已成为限制油茶产业发展的重要因素之一。

相比于传统育种手段，分子标记辅助育种可从苗期开始选择，大幅缩短育种的进程，对以果实为主要目的的经济林育种优势尤其明显。分子标记辅助育种离不开有效的分子标记，因此，开发与油茶籽油品质表型相关的分子标记，对于油茶籽油品质的分子标记辅助育种以及油茶籽油品质的改良具有重要意义。

棕榈油酸(palmitoleic acid)是一种16碳的单不饱和脂肪酸，近年来研究发现，棕榈油酸对于一些慢性疾病如代谢综合症、糖尿病和炎症的治疗具有一定作用。目前，棕榈油酸主要来源于鱼油等海产品，来源受到限制，难以满足市场的需求。棕榈油酸在一般油料作物中含量较少，因此选育高棕榈油酸含量的油料作物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记，本发明的另一目的是提供该SNP分子标记在油茶棕榈油酸含量表型鉴定和育种中的应用。

本发明提供的与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记的开发方法是基于油茶是典型的异交物种，连锁不平衡(LD)通常在较小的范围内迅速消减，因此可以开展重要性状的LD作图。油茶的种仁全部转录本作为本发明分子标记开发的区域。在具备产生了大量明显的遗传变异的油茶自然群体的前提下，开展与油茶种子油脂中棕榈油酸含量变异显著相关的标记开发。SNP分子标记的开发过程基本如下：

(1)在油茶全分布区内广泛收集油茶种质资源，建立油脂中棕榈油酸含量发生广泛分离的油茶自然群体。

(2)采集自然群体500份油茶种质的完全成熟种子，用气象色谱法测定成熟种子油脂的7种脂肪酸成分含量，包括硬脂酸、软脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸，具体方法按照GB/T 17376《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》和GB/T 17377《动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析》执行。

(3)采集自然群体500个油茶单株的油脂高速合成期的种仁，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)提取总RNA，对各样本分别构建cDNA文库，利用Illumina HiSeqTM 4000平台进行二代转录组测序。

(4)采集油茶“长林4号”的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子，采用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取RNA，各组织RNA等比例混合，构建PacBio SMRTbell文库，在PacBio Sequel平台进行三代转录组测序。测序结果过滤掉低质量数据和冗余序列后，对所有转录本进行注释分析。过程中用到软件LoRDEC(http://www.atgc-montpellier.fr/lordec/)、CD-HIT v4.6(Fu L,NiuB,Zhu Z,Wu S,Li W,2012.CD-HIT:accelerated for clustering the next-generationsequencing data.Bioinformatics 28,3150-2.)、Coding Potential Calculator(CPC)(Kong L,Zhang Y,Ye Z-Q,et al.,2007.CPC:assess the protein-coding potential oftranscripts using sequence features and support vector machine.Nucleic AcidsResearch 35,W345.)和Coding-Non-Coding Index(CNCI)(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)等都是公众可获得的公开软件。

(5)以(4)中获得的全长转录组序列为参考序列，采用多序列比对法，分析(3)中获得的500个样本转录组序列的SNP位点。SNP数据根据以下原则严格过滤：每个位点只有2个等位基因；基因型缺失率≤20％；最小等位基因频率≥5％；SNP质量值≥100；纯合基因型样本数超过10个；杂合基因型率≤70％。过程中用到软件bcftools v1.9 software(http://www.htslib.org/doc/bcftools.html)是公众可获得的公开软件。

(6)将群体的基因型数据输入GCTA　v1.25.2(Jian Y,S Hong L,Goddard ME,Visscher PM,2011.GCTA:a tool for genome-wide complex trait analysis.AmericanJournal of Human Genetics 88,76-82.)软件，进行主成分分析(PCA)。

(7)将群体的基因型数据、前10个主成分(PC)数据、油脂中棕榈油酸含量的表型数据以及Kinship矩阵数据输入TASSEL5.0(http://www.maizegenetics.net/tassel)软件中，采用统一混合线性模型方法(MLM)分析SNPs标记和油茶油脂中棕榈油酸含量性状的连锁不平衡性，检测到2个位点与棕榈油酸含量极显著关联(P<10^-5)，分别命名为PB.10070.2-202和PB.7527.1-77(表1)。

表1 SNP分子标记信息

PB.10070.2-202中SNP位点对应于油茶PB.10070.2转录本(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)的第202位，多态性为G/A，基因型为GG、GA或AA；PB.7527.1-77中SNP位点对应于油茶PB.7527.1-77(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的第77位，多态性为G/A，基因型为GG、GA或AA；PB.10070.2-202和PB.7527.1-77中的SNP位点均位于转录本的非编码区，对表型变异的贡献率分别为14.38％和12.77％(表1)。

具体地，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记，包括PB.10070.2-202或PB.7527.1-77；其中，PB.10070.2-202含有如SEQ ID NO.1所示序列第202位的多态性为G/A的核苷酸序列；PB.7527.1-77含有如SEQ ID NO.2所示序列的第77位的多态性为G/A的核苷酸序列。

具体地，SNP分子标记PB.10070.2-202的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列的第202位，多态性为G/A。SNP分子标记PB.7527.1-77的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SNP位点位于SEQ ID NO.2所示序列的第77位，多态性为G/A。

SNP分子标记PB.10070.2-202可由SEQ ID NO.3-4所示的引物，以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得。SNP分子标记PB.7527.1-77可由SEQ ID NO.5-6所示的引物，以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得。

P1：SEQ ID NO.3：5’-GACATAATCTCACATCAGCA-3’；

P2：SEQ ID NO.4：5’-AATGACTATTCTATTCCCAT-3’；

P3：SEQ ID NO.5：5’-AGATTAGGTGTCGTTTTTGC-3’；

P4：SEQ ID NO.6：5’-CTTCACAGTATCTGCATTAGC-3’。

SNP分子标记PB.10070.2-202中，上述多态性位点的基因型为AA，对应于高棕榈油酸含量，多态性位点的基因型为GG，对应于低棕榈油酸含量。SNP分子标记PB.7527.1-77中，上述多态性位点的基因型为AA，对应于高棕榈油酸含量，多态性位点的基因型为GG或GA，对应于低棕榈油酸含量。

SNP分子标记PB.10070.2-202和PB.7527.1-77可分别单独用于或联合使用用于油茶种子油脂中棕榈油酸含量表型的鉴定，联合使用时鉴定的准确率更高。

本发明还提供与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记组合，其包括PB.10070.2-202和PB.7527.1-77。

第二方面，本发明提供用于扩增所述SNP分子标记或其组合的引物。

作为本发明的一种实施方式，所述引物包括SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6所示的引物。

其中，SEQ ID NO.3-4所示引物用于扩增SNP分子标记PB.10070.2-202，SEQ IDNO.5-6所示的引物用于扩增SNP分子标记PB.7527.1-77。

本发明还提供含有所述引物的试剂或试剂盒。

所述试剂或试剂盒包含SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6所示引物中的一对或两对。

第三方面，本发明提供所述SNP分子标记或所述SNP分子标记组合或所述引物或所述试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)在鉴定油茶种子油脂中油棕榈油酸含量表型中的应用；

(2)在以种子油中棕榈油酸含量为主要性状的油茶种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用，所述种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种的性状为种子油脂中的棕榈油酸含量；

(3)在油茶种子油脂中棕榈油酸含量早期预测中的应用；

(4)在筛选高棕榈油酸含量油茶中的应用。

在利用本发明提供的2个SNP分子标记PB.10070.2-202和PB.7527.1-77进行油茶种子油脂中棕榈油酸含量表型鉴定或分子标记辅助育种时，本领域技术人员根据需要可以选择PB.10070.2-202和PB.7527.1-77中任意一个分子标记或PB.10070.2-202和PB.7527.1-77两个分子标记的组合。PB.10070.2-202和PB.7527.1-77联合使用，鉴定的准确率更高。

第四方面，本发明提供鉴定油茶种子油脂中棕榈油酸含量表型的方法，包括：

(1)提取待鉴定油茶的总RNA，反转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6所示引物进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中所述SNP分子标记或所述SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定油茶种子油脂中的棕榈油酸含量表型。

上述方法的步骤(1)中，所述待鉴定油茶可以为任何育种材料，包括自然群体个体和有性群体个体。

提取油茶总RNA可采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)。反转录合成单链cDNA采用PrimeScript RT Master Mix试剂盒(TaKaRa,大连，中国)。

步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：94～95℃，3～5min；94～95℃，15～30s，65～69℃，40～60s，38～45个循环；67～70℃，3～6min。

步骤(3)中，分析SNP分子标记的基因型可采用本领域常规技术手段，例如测序等，可以SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6为测序引物进行测序。

步骤(3)中，判断油茶种子油脂中棕榈油酸含量表型的方法如下：

若SNP分子标记PB.10070.2-202具有所述多态性的位点(SEQ ID NO.1所示序列的第202位)的基因型为AA，则待鉴定油茶为高棕榈油酸含量，若基因型为GG，则待鉴定油茶为低棕榈油酸含量。若SNP分子标记PB.7527.1-77具有所述多态性的位点(SEQ ID NO.2所示序列的第77位)的基因型为AA，则待鉴定油茶为高棕榈油酸含量，若基因型为GG或GA，则待鉴定油茶为低棕榈油酸含量。

本发明提供鉴定高棕榈油酸含量油茶的方法，包括：

(1)提取待鉴定油茶的总RNA，反转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所示引物进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中所述SNP分子标记或所述SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定油茶是否为高棕榈油酸含量油茶。

上述方法的步骤(3)中，判断方法如下：

若SNP分子标记PB.10070.2-202具有所述多态性的位点(SEQ ID NO.1所示序列的第202位)的基因型为AA，则待鉴定油茶为高棕榈油酸含量。若SNP分子标记PB.7527.1-77具有所述多态性的位点(SEQ ID NO.2所示序列的第77位)的基因型为AA，则待鉴定油茶为高棕榈油酸含量。

本发明的有益效果在于：本发明开发了2个与油茶种子油脂中棕榈油酸含量高度关联的SNP位点，可以分别解释14.38％和12.77％的棕榈油酸含量表型方差。利用这两个标记对有性油茶群体进行了辅助选择，结果表明，PB.10070.2-202分子标记的多态性位点基因型为A/A的单株中，83.33％的个体的种子油脂中棕榈油酸含量高于群体棕榈油酸含量平均值，基因型为G/G的单株中，75.00％的个体其种子油脂中棕榈油酸含量低于群体棕榈油酸含量平均值，基因型为A/G的单株中，高棕榈油酸含量和低棕榈油酸含量的个体数量相当；PB.7527.1-77分子标记的多态性位点基因型为A/A的单株中，77.78％的个体其种子油脂中棕榈油酸含量高于群体棕榈油酸含量平均值，基因型为A/G和G/G的单株中，60.10％的个体其种子油脂中棕榈油酸含量低于群体棕榈油酸含量平均值。PB.10070.2-202和PB.7527.1-77两个分子标记的多态性位点的基因型均为A/A的单株，其棕榈油酸含量全部高于群体棕榈油酸含量平均值，可见，两个SNP分子标记联合选择对高棕榈油酸油茶的选择效率显著提高，因此，这两个标记用于辅助选择是切实有效的。

在油茶常规选择育种中，油脂中棕榈油酸含量性状的鉴定需要幼苗造林5-6年才能测定，费时费力。本发明提供的SNP分子标记中的SNP位点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响，目的性更强，工作量小，效率更高，成本低。因此，通过检测本发明的SNP分子标记的基因型，可实现在苗期进行鉴定和辅助筛选，大大节约生产成本和提高选择效率。在油茶育种中，可选择本发明的分子标记及检测的方法鉴定出高棕榈油酸含量油茶进行育种，有效提高油茶育种的选择效率，加快育种进程。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中所用的自然群体材料500份单株，均由中国林业科学研究院亚热带林业研究所木本油料育种与培育研究组收集、评价，并保存于浙江金华婺城区东方红林场种质资源圃。

实施例1油茶种子油脂中棕榈油酸含量分离群体的构建及性状测定

本实施例中使用普通油茶资源收集圃内500份种质资源的自然群体，其起源地涵盖中国油茶主产区的大部分，包括浙江省、湖南省、江西省、广西区、福建省、广东省等。待500个个体的果实完全成熟后(5％果实开裂)，分别采集种子，提取油脂测定脂肪酸成分及含量，其操作步骤如下：

(1)适量油茶种子用烤箱80℃烘烤过夜至恒重，剥去硬种皮。

(2)种仁用粉碎机粉碎后，用中速滤纸包好，加入适量石油醚浸泡抽提过夜。

(3)待石油醚完全挥发后，利用Agilent6890N气相色谱仪按照GB/T17376-2008、GB/T17377-2008方法测定脂肪酸成分及含量。

脂肪酸成分含量测定结果表明：自然群体种子油中棕榈油酸含量均呈正态分布，说明该性状具有数量性状特点。

实施例2油茶三代转录组测序及注释分析

1、三代测序样本RNA的提取：

采集油茶“长林4号”的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取RNA，具体步骤如下：

(1)首先在1.5ml离心管中加入500μl的裂解液SL(使用前检查是否已加入β-巯基乙醇)。取0.1g样本材料加入液氮充分研磨，迅速将研磨好的样本粉末加入到离心管中，立即旋涡剧烈震荡混匀。

(2)12000rpm离心2分钟。

(3)将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm离心2分钟，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

(4)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。注意，如果上清液体积有损失，需相应调整乙醇的加量。

(5)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(6)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free的离心管中，加入70μl RDD缓冲液，轻柔混匀。

(7)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15分钟。

(8)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(10)重复步骤9。

(11)12000rpm离心2分钟，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，得到RNA溶液。

2、三代转录组测序与注释分析：

将通过纯度和浓度检测的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子五个组织的样品总RNA等比例混合，利用Clontech

PCR cDNA合成试剂盒进行反转录合成单链cDNA。利用KAPA HiFi PCR试剂盒以单链cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，生成双链cDNA。生成的双链cDNA利用Blue Pippin分成0.5-2kb，2-3kb，3-6kb三个长度片段库。然后进行第二轮PCR扩增产生充足的cDNA，构建PacBio SMRTbell文库，在PacBio Sequel平台进行三代转录组测序。利用SMRTlink 5.0软件处理测序数据。测序结果过滤掉低质量数据和冗余序列后，生成CCS。根据序列是否含有5’primer，3’primer和polyA尾巴，将所有的CCS分为全长和非全长序列两大类。全长的CCS采用ICE算法在缺省参数条件下进行聚类分析产生CS。利用Arrow和LoRDEC(http://www.atgc-montpellier.fr/lordec/)软件进一步过滤CS，利用CD-HIT v4.6(Fu L,Niu B,Zhu Z,Wu S,Li W,2012.CD-HIT:accelerated for clusteringthe next-generation sequencing data.Bioinformatics 28,3150-2.)软件去除冗余序列。

利用Coding Potential Calculator(CPC)(Kong L,Zhang Y,Ye Z-Q,et al.,2007.CPC:assess the protein-coding potential of transcripts using sequencefeatures and support vector machine.Nucleic Acids Research 35,W345.)和Coding-Non-Coding Index(CNCI)(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)软件在参数缺省条件下进行转录本的蛋白编码潜能预测。未通过蛋白编码潜能检测的转录本进一步在Swiss-Prot数据库中比对，若在Swiss-Prot数据库中仍无注释，则认为该转录本为长链非编码RNA。其它的转录本进一步在NR、Swiss-Prot、COG、KEGG和GO等数据库中比对，注释转录本。

实施例3油脂高速合成期种仁转录组测序及多态位点识别

1、500个油茶无性系油脂高速合成期种仁总RNA提取：

利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取各无性系未成熟种仁的总RNA(见实施例2)。

2、二代转录组测序：

对通过纯度和浓度检测的种仁样品的总RNA，去除其中的核糖体RNA，以最大限度地保留所有coding RNA和ncRNA。得到的RNA随机打断成短片段，再以片断化后的RNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链；接着加入缓冲液、dNTPs(dUTP代替dTTP)、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱，经末端修复、加碱基A，加测序接头，然后通过UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二条链。用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增。最后建好的测序文库用Illumina HiSeq^TM4000平台进行二代转录组测序。

3、多态位点识别：

为了保证数据质量，对下机后经过初步过滤得到的clean reads进行进一步更严格的过滤，得到高质量的clean reads，用于后续的信息分析。过滤的步骤如下：

(1)去除含有接头的reads；

(2)去除全部都是A碱基的reads；

(3)去除含N比例大于10％的reads；

(4)去除低质量的reads(质量值Q≤20的碱基数占整条reads的50％以上)。

采用Tophat v2.1.1(Trapnell C,Roberts A,Goff L,et al.,2012.Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seqexperiments with TopHat and Cufflinks.Nature protocols 7,562-78.)软件将每个样本的高质量的reads比对到参考转录组序列上(见实施例2)。剔除没有比对上的序列，其余序列利用bcftools v1.9软件(http://www.htslib.org/doc/bcftools.html)识别SNP位点。识别的SNP位点经过严格过滤，获得高质量的SNPs数据。过滤标准如下：

(1)位点上只有2个等位基因；

(2)基因型缺失率≤20％；

(3)最小等位基因频率(MAF)≥5％；

(4)SNP质量值≥100；

(5)纯合子基因型的样本数大于10个；

(6)杂合基因型样本率≤70％。

实施例4与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP位点的筛选

(1)利用GCTA v1.25.2(Jian Y,S Hong L,Goddard ME,Visscher PM,2011.GCTA:a tool for genome-wide complex trait analysis.American Journal of HumanGenetics 88,76-82.)软件对油茶自然群体进行主成分分析(PCA)，利用前10个主成分(PC)作为固定效应用于后续的关联分析(表2)。

表2自然群体部分个体的前10个PC值

(2)将所有样本的SNPs位点数据、前10个PC值数据、表型数据(见实施例1)及Kinship矩阵数据导入TASSEL5.0软件中，采用MLM法分析SNPs与棕榈油酸含量性状的连锁不平衡性，筛选与油脂中棕榈油酸含量显著关联的分子标记，经多重检验校正，检测到了两个跟棕榈油酸含量存在极显著关联的位点PB.10070.2-202和PB.7527.1-77(P<10^-5，表1)，每个位点均有3种基因型，均为A/A、G/A、G/G，两个位点均位于转录本的非编码区，二者对棕榈油酸含量差异的贡献率分别为14.38％和12.77％(表1)。

实施例5显著关联的分子标记PB.10070.2-202和PB.7527.1-77在高棕榈油酸含量油茶育种中的应用

(1)选择一个油茶杂交F1代家系群体为材料(母本为‘长林53号’，父本为‘长林40号’，均为国家审定良种，良种号分别为“国S-SC-CO-012-2008”和“国S-SC-CO-011-2008”)，采集嫩叶提取总RNA(见实施例2)。以RNA为模板，采用Clontech cDNA合成试剂盒反转录生成单链cDNA，并稀释100倍，作为工作液。

(2)分别利用P1和P2、P3和P4引物对每个样本的单链cDNA工作液进行PCR扩增，引物序列如下：

P1：SEQ ID NO.3：5’-GACATAATCTCACATCAGCA-3’；

P2：SEQ ID NO.4：5’-AATGACTATTCTATTCCCAT-3’；

P3：SEQ ID NO.5：5’-AGATTAGGTGTCGTTTTTGC-3’；

P4：SEQ ID NO.6：5’-CTTCACAGTATCTGCATTAGC-3’。

PCR扩增的反应体系如表3所示：

表3 PCR反应体系

PCR扩增程序为：

(3)PCR扩增产物进行凝胶检测和纯化回收并进行测序和基因分型。凝胶检测和纯化回收按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AxyGEN,Code No.AP-GX-50)说明书进行，其流程如下：

①配制1.2％的琼脂糖凝胶，将50μl扩增产物全部上样，电泳电压为5V/cm，电泳约20分钟至上样缓冲液中二甲苯青达到距离凝胶前端1cm处时停止电泳。

②在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(例如100mg＝100μl体积)。

③加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，每2～3分钟间断混合，直至凝胶块完全熔化。

④加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

⑤将上述溶液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑥加入500μl Buffer W1，12000rpm离心30秒，弃滤液。

⑦加入700μl Buffer W2，12000rpm离心30秒，弃滤液。以同样的方法再用700μlBuffer W2洗涤一次，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑧将制备管放回离心管中，12000rpm离心1分钟。

⑨将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25～30μl去离子水，室温静置1分钟。12000rpm离心1分钟洗脱DNA。

⑩凝胶回收DNA，以对应的扩增引物为测序引物，采用一代测序测定扩增产物核苷酸序列，用Chromas软件判读测序峰图上每个SNP位点的基因型。

(4)分别鉴定所有个体的PB.10070.2-202和PB.7527.1-77位点的基因型。若PB.10070.2-202位点的基因型为A/A，则待鉴定油茶为高棕榈油酸含量，若基因型为G/G，则待鉴定油茶为低棕榈油酸含量，若基因型为A/G，则待鉴定油茶还需进一步评估其棕榈油酸含量。若PB.7527.1-77位点的基因型为A/A，则待鉴定油茶为高棕榈油酸含量，若基因型为A/G或G/G，则待鉴定油茶为低棕榈油酸含量。若PB.10070.2-202和PB.7527.1-77两个位点的基因型均为A/A，则待鉴定单株为确认高棕榈油酸含量。

(5)采集所有F1代个体完全成熟种子，测定其种子油脂中棕榈油酸含量(见实施例1)。结果表明(表4)，PB.10070.2-202位点的基因型为A/A的单株中，83.33％的个体其种子油脂中棕榈油酸含量高于群体棕榈油酸含量平均值(0.0478％)，基因型为G/G的单株中，75.00％的个体其种子油脂中棕榈油酸含量低于群体棕榈油酸含量平均值(0.0478％)，基因型为A/G的单株中，高棕榈油酸含量和低棕榈油酸含量的个体数量相当；PB.7527.1-77位点的基因型为A/A的单株中，77.78％的个体其种子油脂中棕榈油酸含量高于群体棕榈油酸含量平均值(0.0478％)，基因型为A/G和G/G的单株中，60.10％的个体其种子油脂中棕榈油酸含量低于群体棕榈油酸含量平均值(0.0478％)。PB.10070.2-202和PB.7527.1-77两个位点均为高棕榈油酸含量基因型(A/A)的单株中，全部个体棕榈油酸含量均高于平均值(0.0478％)，可见，两个位点联合选择对高棕榈油酸油茶的选择效率显著提高。这表明PB.10070.2-202和PB.7527.1-77这两个标记用于辅助选择，特别是筛选高棕榈油酸含量的油茶个体是切实有效的，可用于早期鉴别或辅助鉴别，可大大节约生产成本，提高选择效率，加快油茶高油育种进程。

表4 F1单株的种子油脂中棕榈油酸含量及两个位点基因型数据

注：表4中“NA”表示基因型缺失。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120> 与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP201112308.8

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacataatct cacatcagca atctaagcca gttaagcttg gttaatataa ttcaagggcc 60

tctccactca tagccaattg attttgagtt ggatgcttct ttcacaatca cccactactg 120

ttttagcctc atcactctaa cggacagctg gcctccatca actacttccc ctcatctacc 180

ttagttgcat cacaatcatt cgacttggcg ctattccttg gttatttact tttggttcaa 240

acagttgtta ctgtattctc tatgtgggta tatatattgc taagtaaatt gtattataga 300

agaccataat gggcacaagc tgcgcaattt gatttgcata atggtttgat gaatctgtgg 360

ctgatatttt ctagggtttt attggtatga gtgcagacaa gaaagctaat tacattgtta 420

aggttgatga tgtagagata tcaccttatc cagtggcaac tggcaatcct accaccttca 480

ccattaaggc ttctactgat caagtcttaa ctggagggaa attgtctctt gctgtttcgt 540

attttggggt gaaagtccac tcggaaactc ataatatttg tgagaagaca tcctgcccta 600

tatcagttgg caaatttgtg ctctcccaca cacaaacttt acctgcactc acgccgccag 660

gttcctacac tcttaagatg aagatgcaag atgagaagaa acatgagtta acttgcatta 720

gcttcaagtt cgacatcgag ctcggttcat tcatgtctat ttgaagtcct tgtaagaatg 780

catctacctt atatttactt gtgttggctt gtaagataac tcttccatga aagtacaaca 840

tcttgaacct acttcaagta tggccttgcc tgatgatctt ccatgttgca cttattccac 900

tgtagttgca cttattccac tgtagtaata atgtacatgt tgcctcgact ggtgtgtgtt 960

ctgtattgtg gatgtttgtc cagtttaagc aactccattc atgtttgtag aggctttaac 1020

catttacaat tttttttttt ttaaattcaa aatcaaagaa atagtgtaca aacgaacttt 1080

attctcaaac tactgtaaaa catgattagc aagtgaaaaa acttaattag caataacgtt 1140

ttattgagaa aaaaaatgat tgctaagtat gttttattgt agtttgggaa taatttgttc 1200

tttatcgaag aatcttgact agtaaatcaa gtcattcttt ccatccgtgc cttcttgtaa 1260

gctctaggaa gtcgcggata aaactcttag gaaatgtttg gttcactaga atggtagatg 1320

ggaatagaat agtcatt 1337

<210> 2

<211> 2472

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agattaggtg tcgtttttgc agagtgttga aggcatgagg caagacagag agagtgagag 60

tagaagagag agatgagaca gaaacaaacc ttttatatga gtgtttgagt gttttttatg 120

tttcttttcc tcctgattct ttctcttcct acaccacgga ctcgaagatt ttgtgggagc 180

gattagattt gaaatggatc cttttgaggc tttaagtatt gtgtttagtc gaattcggaa 240

gttagaacca gagaatgttt caaagaagat aatcggctat attcttgtac aagatggcag 300

tcatgaaatg attcggttgg cttttgggcc ggacaattta atccaaaact tgatacacat 360

aatcaaaatt caactaggat tagtaccaaa accagttgtt tcgcctccaa tttcaccttc 420

tatgaacttg gaccccttta ctccgttctc accattttca tcccgggcga cattgagggt 480

tccaactccc tactgggacc cacaggtcaa tcctgagcac caaacaatgc atgatcccca 540

tttcatacca gttggctact ccgattctgt cccggaagat ttcaggctcc aaaatcgggc 600

ccaaatcatg ggcttggagg atcagttaga actggttaat tcaggaattc ctgccttttc 660

gagtgattat tattacccag aagtgagaag ccaacggtct tcgaccctat ctgatttccc 720

aataaaaggt tgtcactatt ttaataaggg gttttgtaag catggaagta actgtaggta 780

ctgtcatgga caaccttttc ctaagagctt ctctccgatg tttagcccgg cttcgaatga 840

aattgctaat ggtgatcata tgtttttgcc cggttcactt gaaaagttgg aattggaaat 900

tactgagctc ttgaaattag gaagaggcag tccaatttca attgcctcgc tgcccatgtt 960

gtacttcgag acatacggga ggactcttca ggctgaaggg tacctcacag aaagccagag 1020

gcacggtaaa gtgggatata gtttgacaaa gctcattgcc cgattaaaga gcagtgtgcg 1080

gctgattgac aggtgtaatt atgatttttc atgtatatta attattgtta tatcaaaaaa 1140

ttaaaaatta tttttttaat ggttcggtta cagacctcac gggcagcatt cagttatact 1200

ggcagaagat gcaccgaagt atatggaaaa ccggggtgaa agaaatgacc cgggcccaat 1260

tgttagcgga tcatggcaaa tatatttgac ttttccggct gagagcactt ttactgagga 1320

agatgttgcc aactacttcg atacctttgg gccggttcaa gatgtaagaa ttccttgcca 1380

acagaaaagg atgtttgggt ttgttacttt tgctaatgca gatactgtga agatgatttt 1440

gtcgaaggga aatccacatt atgtttgtgg tgctcgtgtt cttgtgaaac cgtataaaga 1500

aaaatcaaag ctttttgaca ggaagtacct agagaaaatg gagcctctga tgcattacag 1560

ttcacacttt acagacatgg attctgacct tcactcaagt gtgtaatacc tttcagtaat 1620

tctagtgaag ctcagagaat taatttcaaa ctgtgataag ttctcataga ttgtttctta 1680

ttgcaattaa gtttcatata ttggtactca aaggccatgt ttgttcattg gactcgattg 1740

catggaaggc gcattaggag ggggattaga agaatataca gttagtcccc catgtgggga 1800

tatacagtct gaagggactg tcaattctga ggtctgcttt tgtatccaaa catgggattc 1860

ggaattgaac aggatacata gtccaatccg atgccttaat ccccctaaca aacacaactt 1920

atatgtttat gcgcttgagg tcatatcatg caagcatttc taacatgtga ggtgccttct 1980

atttaatcct agtatcatta ccatataacc tgatacattt cttaccatgc cgacgggatg 2040

ggagtcctcc tggatgctca ggaagcagtt tatggaagag ccggaaaacg ctctagaaat 2100

ccagacatgg cgtctctcag agatgcattt tgcacaaaaa actcccacca ataagtccta 2160

ttttggctac tccatggatg aggtcaaagc ttctgaagat cattccaagt tcccatcagc 2220

agaaagtttt acctatcttc tggatgttct gaatagcagg cccacaagtg acgataatcc 2280

caagcatgca gggatcaatc acggtgatca ggagagtggt caaggtctca atctcccgga 2340

gagaccattt gcatctccga tagcaagtaa catttctaca gtcacagatt aaagcaacaa 2400

tcagaagaaa tatagagttc acagagtact ggctttgaaa ctcaacacct ttactgccaa 2460

agaatacagc tc 2472

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacataatct cacatcagca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatgactatt ctattcccat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agattaggtg tcgtttttgc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttcacagta tctgcattag c 21

Claims

1.与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为PB.10070.2-202或PB.7527.1-77；

其中，SNP分子标记PB.10070.2-202的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第202位的多态性为G/A；SNP分子标记PB.7527.1-77的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中第77位的多态性为G/A。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记PB.10070.2-202中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高棕榈油酸含量，基因型为GG，对应于低棕榈油酸含量；

所述SNP分子标记PB.7527.1-77中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高棕榈油酸含量，基因型为GG或GA，对应于低棕榈油酸含量。

3.与油茶种子油脂中棕榈油酸含量相关的SNP分子标记组合，其特征在于，所述SNP分子标记组合为PB.10070.2-202和PB.7527.1-77；

其中，标记PB.10070.2-202和PB.7527.1-77同权利要求1或2中所述。

4.用于扩增权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合的引物。

5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所示的引物。

6.含有权利要求4或5所述的引物的试剂或试剂盒。

7.权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合或权利要求4或5所述的引物或权利要求6所述的试剂或试剂盒的以下任一应用：

（1）在鉴定油茶种子油脂中棕榈油酸含量表型中的应用；

（2）在油茶种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用，所述种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种的性状为种子油脂中的棕榈油酸含量；

（3）在油茶种子油脂中棕榈油酸含量早期预测中的应用；

（4）在筛选高棕榈油酸含量油茶中的应用。

8.鉴定油茶种子油脂中棕榈油酸含量表型的方法，其特征在于，包括：

（1）提取待鉴定油茶的总RNA，反转录合成cDNA；

（2）以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所示引物进行PCR扩增；

（3）分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定油茶种子油脂中棕榈油酸含量表型。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94~95℃，3~5min；94~95℃，15~30s，65~69℃，40~60s，38~45个循环；67~70℃，3~6min。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述判断待鉴定油茶种子油脂中棕榈油酸含量表型的方法如下：

若SNP分子标记PB.10070.2-202具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高棕榈油酸含量，若基因型为GG，则待鉴定油茶为低棕榈油酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.7527.1-77具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高棕榈油酸含量，若基因型为GG或GA，则待鉴定油茶为低棕榈油酸含量。