CN111518943B

CN111518943B - 与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的snp分子标记及其应用

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Publication number: CN111518943B
Application number: CN202010457658.0A
Authority: CN
Inventors: 林萍; 龙伟; 王开良
Original assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN111518943A

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供11个与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.12067.3‑268、PB.12683.1‑1828、PB.24814.1‑110、PB.26042.1‑50、PB.38187.1‑147、PB.43088.1‑179、PB.44396.1‑122、PB.70894.1‑2810、PB.81782.1‑306、PB.98296.1‑148和PB.98486.6‑1148中的任一种。利用这11个标记进行油茶二十碳烯酸含量表型的鉴定，可实现苗期的鉴定和辅助筛选，有效提高油茶育种的选择效率，加快育种进程。

Description

与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

油茶(Camellia oleifera Abel.)隶属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L.)，是木本油料树种。油茶籽油含有丰富的营养物质，是一种优质的食用油，其不饱和脂肪酸含量达90％以上，以油酸和亚油酸为主。油茶籽油具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等功效，具有较高的营养保健价值。目前，以选择和杂交育种为主要手段、以产果量为主要育种目的的油茶育种已取得了重要进展，但以改良油茶籽油品质为目的育种研究仍较少。油茶的常规育种周期很长，新品种选育缓慢，因此良种选育速度还不能满足产业发展的需求，已成为限制油茶产业发展的重要因素之一。

相比于传统育种手段，分子标记辅助育种手段可从苗期开始选择，大幅缩短育种的进程，对以果实为主要目的的经济林育种优势尤其明显。分子标记辅助育种离不开有效的分子标记，因此，开发与油茶籽油品质表型相关的分子标记，对于油茶籽油品质的分子标记辅助育种以及油茶籽油品质的改良具有重要意义。

二十碳烯酸，又称花生油酸，是一种ω-7不饱和脂肪酸。油茶油脂中的花生油酸以顺-11-二十碳烯酸(C20：1)为主要成分。二十碳烯酸是生产洗涤剂、化妆品和高级润滑油的重要原料。开展二十碳烯酸生物合成的机制研究，选育高二十碳烯酸含量的油料作物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供与油茶种子油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记，本发明的另一目的是提供该SNP分子标记在油茶二十碳烯酸含量表型鉴定和育种中的应用。

本发明提供的与油茶种子油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记的开发方法是基于油茶是典型的异交物种，连锁不平衡(LD)通常在较小的范围内迅速消减，因此可以开展重要性状的LD作图。油茶的种仁全部转录本作为本发明分子标记开发的区域。在具备产生了大量明显的遗传变异的油茶自然群体的前提下，可有效开展与油茶二十碳烯酸含量变异显著相关的标记开发。

SNP分子标记的开发过程基本如下：

(1)在油茶全分布区内广泛收集油茶种质资源，建立油脂中二十碳烯酸含量发生广泛分离的油茶自然群体。

(2)采集自然群体500份油茶种质的完全成熟种子，用气象色谱法测定成熟种子油脂的6种脂肪酸成分含量，包括硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸，具体方法按照GB/T 17376《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》和GB/T 17377《动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析》执行。

(3)采集自然群体500个油茶单株的油脂高速合成期的种仁，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)提取总RNA，每样本分别构建cDNA文库，利用Illumina HiSeq^TM4000平台进行二代转录组测序。

(4)采集油茶“长林4号”的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子，采用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取RNA，各组织RNA等比例混合，构建PacBio SMRTbell文库，在PacBio Sequel平台进行三代转录组测序。测序结果过滤掉低质量数据和冗余序列后，对所有转录本进行注释分析。过程中用到软件LoRDEC(http://www.atgc-montpellier.fr/lordec/)、CD-HIT v4.6(Fu L,NiuB,Zhu Z,Wu S,Li W,2012.CD-HIT:accelerated for clustering the next-generationsequencing data.Bioinformatics 28,3150-2.)、Coding Potential Calculator(CPC)(Kong L,Zhang Y,Ye Z-Q,et al.,2007.CPC:assess the protein-coding potential oftranscripts using sequence features and support vector machine.Nucleic AcidsResearch 35,W345.)和Coding-Non-Coding Index(CNCI)(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)等是公众可获得的公开软件。

(5)以(4)中获得的全长转录组序列为参考序列，采用多序列比对法，分析(3)中获得的500个样本转录组序列的SNP位点。SNP数据根据以下原则严格过滤：每个位点只有2个等位基因；基因型缺失率≤20％；最小等位基因频率≥5％；SNP质量值≥100；纯合基因型样本数超过10个；杂合基因型率≤70％。过程中用到软件bcftools v1.9软件(http://www.htslib.org/doc/bcftools.html)是公众可获得的公开软件。

(6)将群体的基因型数据输入GCTA v1.25.2(Jian Y,S Hong L,Goddard ME,Visscher PM,2011.GCTA:a tool for genome-wide complex trait analysis.AmericanJournal of Human Genetics 88,76-82.)软件，进行主成分分析(PCA)。

(7)将群体的基因型数据、前10个主成分(PC)数据、油脂中二十碳烯酸含量的表型数据以及Kinship矩阵数据输入TASSEL5.0(http://www.maizegenetics.net/tassel)软件中，采用统一混合线性模型方法(MLM)分析SNPs标记和油茶油脂中二十碳烯酸含量性状的连锁不平衡性，检测到11个位点与二十碳烯酸含量极显著关联(P<10^-5)，分别命名为PB.12067.3-268、PB.12683.1-1828、PB.24814.1-110、PB.26042.1-50、PB.38187.1-147、PB.43088.1-179、PB.44396.1-122、PB.70894.1-2810、PB.81782.1-306、PB.98296.1-148和PB.98486.6-1148。它们对表型变异的贡献率为10.19％～32.14％(R²，表1)。

本发明最终获得的与油茶油脂中二十碳烯酸含量极显著关联的11个SNP标记，这些标记位于油茶的11个转录本内，具体参见表1。

表1

具体地，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记，其包括PB.12067.3-268、PB.12683.1-1828、PB.24814.1-110、PB.26042.1-50、PB.38187.1-147、PB.43088.1-179、PB.44396.1-122、PB.70894.1-2810、PB.81782.1-306、PB.98296.1-148和PB.98486.6-1148中的任一个。

具体地，SNP分子标记PB.12067.3-268含有如SEQ ID NO.1所示序列第268位的多态性为C/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.12683.1-1828含有如SEQ ID NO.2所示序列的第1828位的多态性为C/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.24814.1-110含有如SEQ ID NO.3所示序列第110位的多态性为A/C的核苷酸序列；SNP分子标记PB.26042.1-50含有如SEQ IDNO.4所示序列的第50位的多态性为A/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.38187.1-147含有如SEQ ID NO.5所示序列第147位的多态性为G/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.43088.1-179含有如SEQ ID NO.6所示序列的第179位的多态性为T/G的核苷酸序列；SNP分子标记PB.44396.1-122含有如SEQ ID NO.7所示序列第122位的多态性为A/G的核苷酸序列；SNP分子标记PB.70894.1-2810含有如SEQ ID NO.8所示序列的第2810位的多态性为C/A的核苷酸序列；SNP分子标记PB.81782.1-306含有如SEQ ID NO.9所示序列第306位的多态性为G/C的核苷酸序列；SNP分子标记PB.98296.1-148含有如SEQ ID NO.10所示序列的第148位的多态性为T/C的核苷酸序列；SNP分子标记PB.98486.6-1148含有如SEQ ID NO.11所示序列第1148位的多态性为G/T的核苷酸序列。

各SNP分子标记可分别由核苷酸序列如SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15、SEQID NO.16-17、SEQ ID NO.18-19、SEQ ID NO.20-21、SEQ ID NO.22-23、SEQ ID NO.24-25、SEQ ID NO.26-27、SEQ ID NO.28-29、SEQ ID NO.30-31、SEQ ID NO.32-33所示的引物对，以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.12067.3-268通过核苷酸序列如SEQ ID NO.12-13所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.12067.3转录本的268bp处的碱基，其多态性为C/T。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.12683.1-1828通过核苷酸序列如SEQ ID NO.14-15所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.12683.1转录本的1828bp处的碱基，其多态性为C/T。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.24814.1-110通过核苷酸序列如SEQ ID NO.16-17所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.24814.1转录本的110bp处的碱基，其多态性为A/C。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.26042.1-50通过核苷酸序列如SEQ ID NO.18-19所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.26042.1转录本的50bp处的碱基，其多态性为A/T。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.38187.1-147通过核苷酸序列如SEQ ID NO.20-21所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.38187.1转录本的147bp处的碱基，其多态性为G/T。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.43088.1-179通过核苷酸序列如SEQ ID NO.22-23所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.43088.1转录本的179bp处的碱基，其多态性为T/G。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.44396.1-122通过核苷酸序列如SEQ ID NO.24-25所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.44396.1转录本的122bp处的碱基，其多态性为A/G。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.70894.1-2810通过核苷酸序列如SEQ ID NO.26-27所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.70894.1转录本的2810bp处的碱基，其多态性为C/A。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.81782.1-306通过核苷酸序列如SEQ ID NO.28-29所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.81782.1转录本的306bp处的碱基，其多态性为G/C。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.98296.1-148通过核苷酸序列如SEQ ID NO.30-31所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.98296.1转录本的148bp处的碱基，其多态性为T/C。

本发明的与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记PB.98486.6-1148通过核苷酸序列如SEQ ID NO.32-33所示的引物对以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得，扩增产物含有位于油茶PB.98486.6转录本的1148bp处的碱基，其多态性为G/T。

本发明提供了上述11个SNP分子标记在鉴定油茶油脂二十碳烯酸含量表型中的应用，各位点的基因型及其对应的二十碳烯酸含量表型如表2所示。

表2

具体地，所述SNP分子标记PB.12067.3-268中，具有所述多态性的位点的基因型为TT，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为CC或CT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.12683.1-1828中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为CT或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.24814.1-110中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为AC或CC，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.26042.1-50中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为AT或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.38187.1-147中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为GT或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.43088.1-179中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为TG或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.44396.1-122中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为AG或GG，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.70894.1-2810中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为CA或CC，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.81782.1-306中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为GC或GG，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.98296.1-148中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为TC或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.98486.6-1148中，具有所述多态性的位点的基因型为TT，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为GG或GT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量。

本发明所述的二十碳烯酸含量为油茶种子油脂中的二十碳烯酸含量。

各SNP分子标记可分别单独用于或联合使用用于油茶种子油中二十碳烯酸含量表型的鉴定，联合使用时鉴定的准确率更高。

本发明还提供与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记组合，其包括PB.12067.3-268、PB.12683.1-1828、PB.24814.1-110、PB.26042.1-50、PB.38187.1-147、PB.43088.1-179、PB.44396.1-122、PB.70894.1-2810、PB.81782.1-306、PB.98296.1-148和PB.98486.6-1148中的至少两个。

第二方面，本发明提供用于扩增所述SNP分子标记或其组合的引物。

作为本发明的一种实施方式，所述引物包括如SEQ ID NO.12-13所示的PB.12067.3-268的引物、如SEQ ID NO.14-15所示的PB.12683.1-1828的引物、如SEQ IDNO.16-17所示的PB.24814.1-110的引物、如SEQ ID NO.18-19所示的PB.26042.1-50的引物、如SEQ ID NO.20-21所示的PB.38187.1-147的引物、如SEQ ID NO.22-23所示的PB.43088.1-179的引物、如SEQ ID NO.24-25所示的PB.44396.1-122的引物、如SEQ IDNO.26-27所示的PB.70894.1-2810的引物、如SEQ ID NO.28-29所示的PB.81782.1-306的引物、如SEQ ID NO.30-31所示的PB.98296.1-148的引物和/或如SEQ ID NO.32-33所示的PB.98486.6-1148的引物。

本发明还提供含有所述引物的试剂或试剂盒。

所述试剂或试剂盒包含如SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15、SEQ ID NO.16-17、SEQ ID NO.18-19、SEQ ID NO.20-21、SEQ ID NO.22-23、SEQ ID NO.24-25、SEQ IDNO.26-27、SEQ ID NO.28-29、SEQ ID NO.30-31、SEQ ID NO.32-33所示引物中的一对或多对。

第三方面，本发明提供所述SNP分子标记或所述SNP分子标记组合或所述引物或所述试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)在鉴定油茶种子油中二十碳烯酸含量表型中的应用；

(2)在油茶种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用，所述油茶种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种的性状为种子油中的二十碳烯酸含量；

(3)在油茶种子油中二十碳烯酸含量早期预测中的应用；

(4)在筛选高二十碳烯酸含量油茶中的应用。

在利用本发明提供的11个SNP分子标记进行油茶种子油中二十碳烯酸含量表型鉴定或分子标记辅助育种时，本领域技术人员根据需要可以选择其中任意一个分子标记或多个分子标记的组合。多个联合使用，鉴定的准确率更高。

第四方面，本发明提供鉴定油茶中二十碳烯酸含量表型的方法，包括：

(1)提取待鉴定油茶的总RNA，反转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15、SEQ ID NO.16-17、SEQ ID NO.18-19、SEQ ID NO.20-21、SEQ ID NO.22-23、SEQ ID NO.24-25、SEQ ID NO.26-27、SEQ ID NO.28-29、SEQ ID NO.30-31、SEQ ID NO.32-33所示引物对中的一对或多对进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中上述SNP分子标记或SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定油茶的二十碳烯酸含量表型。

上述方法的步骤(1)中，所述待鉴定油茶可以为任何育种材料，包括自然群体个体和有性群体个体。

提取油茶总RNA采用RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)。反转录合成单链cDNA采用Prime Script RT Master Mix试剂盒(TaKaRa,大连，中国)。

步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：94～95℃，3～5min；94～95℃，15～30s，65～69℃，40～60s，38～45个循环；67～70℃，3～6min。优选为，95℃，3min，1个循环预变性；95℃，15s变性，68℃，45s延伸，40个循环；68℃，5min，1个循环彻底延伸。

步骤(3)中，分析SNP分子标记的基因型可采用本领域常规技术手段，例如测序等，可以SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15、SEQ ID NO.16-17、SEQ ID NO.18-19、SEQ IDNO.20-21、SEQ ID NO.22-23、SEQ ID NO.24-25、SEQ ID NO.26-27、SEQ ID NO.28-29、SEQID NO.30-31、SEQ ID NO.32-33为测序引物进行测序。

步骤(3)中所述判断待鉴定油茶的二十碳烯酸含量表型的方法如下：

若SNP分子标记PB.12067.3-268具有所述多态性的位点的基因型为TT，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为CC或CT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.12683.1-1828具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为CT或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.24814.1-110具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为AC或CC，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.26042.1-50具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为AT或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.38187.1-147具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为GT或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.43088.1-179具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为TG或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.44396.1-122具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为AG或GG，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.70894.1-2810具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为CA或CC，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.81782.1-306具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为GC或GG，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.98296.1-148具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为TC或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.98486.6-1148具有所述多态性的位点的基因型为TT，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为GG或GT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量。

具体鉴定油茶中二十碳烯酸含量表型的方法可为：(1)将待鉴定油茶材料嫩叶提取总RNA，反转录生成单链cDNA后，分别采用11组引物对(SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15、SEQ ID NO.16-17、SEQ ID NO.18-19、SEQ ID NO.20-21、SEQ ID NO.22-23、SEQ IDNO.24-25、SEQ ID NO.26-27、SEQ ID NO.28-29、SEQ ID NO.30-31、SEQ ID NO.32-33)进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测并回收所得到的PCR产物；

(2)测定PCR产物的碱基序列，并鉴定11个位点的基因型，对照表2中各位点的基因型与二十碳烯酸含量高低的关系，确定待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量油茶或低二十碳烯酸含量油茶。

所述琼脂糖凝胶电泳中，琼脂糖凝胶的浓度为1.2％。胶回收使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AxyGEN,Code No.AP-GX-50)。上述方法测定PCR产物的碱基序列，分别采用对应的扩增引物为测序引物，采用一代测序技术。

本发明提供鉴定高/低二十碳烯酸含量油茶的方法，包括：

(1)提取待鉴定油茶的总RNA，反转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15、SEQ ID NO.16-17、SEQID NO.18-19、SEQ ID NO.20-21、SEQ ID NO.22-23、SEQ ID NO.24-25、SEQ ID NO.26-27、SEQ ID NO.28-29、SEQ ID NO.30-31、SEQ ID NO.32-33所示引物对中的一对或多对进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中上述SNP分子标记或SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定油茶是否为高/低二十碳烯酸含量油茶。

上述方法的步骤(3)中，判断方法如下：

若待鉴定油茶单株在11个位点中有大于等于2个位点为高二十碳烯酸含量基因型，则该油茶个体为高二十碳烯酸含量候选油茶；若待鉴定油茶单株在11个位点中无高二十碳烯酸含量基因型的位点时，则该油茶个体为低二十碳烯酸含量油茶；若高含油率基因型位点数大于等于3个时，则该油茶个体基本可认定为高二十碳烯酸含量油茶。

本发明的有益效果在于：

本发明开发了11个与油茶二十碳烯酸含量高度关联的SNP位点，可以解释10.19％～32.14％的二十碳烯酸含量表型方差。利用这11个标记对有性油茶群体进行了辅助选择，结果表明，若在11个位点中超过2个位点(包括2个)为高二十碳烯酸含量基因型的单株中，81.48％的个体其种子油脂中二十碳烯酸含量高于群体二十碳烯酸含量平均值；若在11个位点中高二十碳烯酸含量基因型大于等于1个位点的个体中，70.45％的个体其种子油脂中二十碳烯酸含量高于群体平均值；当高二十碳烯酸含量基因型数量大于等于3个时，100％的个体其种子油脂中二十碳烯酸含量高于群体平均值。11个位点中无高二十碳烯酸含量基因型的所有个体中，67.42％的个体其油脂中二十碳烯酸含量低于群体平均值。这表明该标记用于辅助选择是切实有效的。

在油茶常规选择育种中，油脂中二十碳烯酸含量性状的鉴定需要幼苗造林5-6年才能测定，费时费力。本发明提供的SNP分子标记中的SNP位点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响，目的性更强，工作量小，效率更高，成本低。因此，通过检测本发明的SNP分子标记的基因型，可实现在苗期进行鉴定和辅助筛选，大大节约生产成本和提高选择效率。在油茶育种中，可选择本发明的分子标记及检测的方法鉴定出高二十碳烯酸含量油茶进行育种，有效提高油茶育种的选择效率，加快育种进程。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中所用的自然群体材料500份单株，均由中国林业科学研究院亚热带林业研究所木本油料育种与培育研究组收集、评价，并保存于浙江金华婺城区东方红林场种质资源圃。

实施例1油茶油脂中二十碳烯酸含量分离群体的构建及性状测定

本实施例中使用普通油茶资源收集圃内500份种质资源的自然群体，其起源地涵盖中国油茶主产区的大部分，包括浙江省、湖南省、江西省、广西区、福建省、广东省等。待500个个体果实完全成熟后(5％果实开裂)，分别采集种子，提取油脂测定脂肪酸成分及含量。其操作步骤如下：

(1)适量油茶种子用烤箱80℃烘烤过夜至恒重，剥去硬种皮。

(2)种仁用粉碎机粉碎后，用中速滤纸包好，加入适量石油醚浸泡抽提过夜。

(3)待石油醚完全挥发后，利用Agilent6890N气相色谱仪按照GB/T17376-2008、GB/T17377-2008方法测定脂肪酸成分及含量。

脂肪酸成分含量测定结果表明：自然群体种子油中二十碳烯酸含量均呈正态分布，说明该性状具有数量性状特点。

实施例2油茶三代转录组测序及注释分析

1、三代测序样本RNA的提取：

采集油茶“长林4号”的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取RNA，具体步骤如下：

(1)首先在1.5ml离心管中加入500μl的裂解液SL(使用前检查是否已加入β-巯基乙醇)。取0.1g样本材料加入液氮充分研磨，迅速将研磨好的样本粉末加入到离心管中，立即旋涡剧烈震荡混匀。

(2)12000rpm离心2分钟。

(3)将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm离心2分钟，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

(4)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

注意，如果上清液体积有损失，需相应调整乙醇的加量。

(5)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(6)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free的离心管中，加入70μl RDD缓冲液，轻柔混匀。

(7)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15分钟。

(8)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(10)重复步骤9。

(11)12000rpm离心2分钟，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，得到RNA溶液。

2、三代转录组测序与注释分析：

将通过纯度和浓度检测的五个组织(根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子)样品总RNA等比例混合，利用ClontechPCR cDNA合成试剂盒进行反转录合成单链cDNA。利用KAPA HiFi PCR试剂盒以单链cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，生成双链cDNA。生成的双链cDNA利用Blue Pippin分成0.5-2kb，2-3kb，3-6kb三个长度片段库。然后进行第二轮PCR扩增产生充足的cDNA，构建PacBio SMRTbell文库，在PacBio Sequel平台进行三代转录组测序。利用SMRTlink 5.0软件处理测序数据。测序结果过滤掉低质量数据和冗余序列后，生成CCS。根据序列是否含有5’引物，3’引物和polyA尾巴，将所有的CCS分为全长和非全长序列两大类。全长的CCS采用ICE算法在缺省参数条件下进行聚类分析产生CS。利用Arrow和LoRDEC(http://www.atgc-montpellier.fr/lordec/)软件进一步过滤CS，利用CD-HITv4.6(Fu L,Niu B,Zhu Z,Wu S,Li W,2012.CD-HIT:accelerated for clustering thenext-generation sequencing data.Bioinformatics 28,3150-2.)软件去除冗余序列。

利用Coding Potential Calculator(CPC)(Kong L,Zhang Y,Ye Z-Q,et al.,2007.CPC:assess the protein-coding potential of transcripts using sequencefeatures and support vector machine.Nucleic Acids Research 35,W345.)和Coding-Non-Coding Index(CNCI)(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)软件在参数缺省条件下进行转录本的蛋白编码潜能预测。未通过蛋白编码潜能检测的转录本进一步在Swiss-Prot数据库中比对，若在Swiss-Prot数据库中仍无注释，则认为该转录本为长链非编码RNA。其它的转录本进一步在NR、Swiss-Prot、COG、KEGG和GO等数据库中比对，注释转录本。

实施例3油脂高速合成期种仁转录组测序及多态位点识别

1、500个油茶无性系油脂高速合成期种仁总RNA提取：

利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取各无性系未成熟种仁的总RNA(见实施例2)。

2、二代转录组测序：

将通过纯度和浓度检测的各样品总RNA，去除其中的核糖体RNA，以最大限度地保留所有coding RNA和ncRNA。得到的RNA随机打断成短片段，再以片断化后的RNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链；接着加入缓冲液、dNTPs(dUTP代替dTTP)、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱，经末端修复、加碱基A，加测序接头，然后通过UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二条链。用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增。最后建好的测序文库用Illumina HiSeq^TM 4000平台进行二代转录组测序。

3、多态位点识别：

为了保证数据质量，对下机后经过初步过滤得到的clean reads进行进一步更严格的过滤，得到高质量的clean reads，用于后续的信息分析。过滤的步骤如下：

(1)去除含有接头的reads；

(2)去除全部都是A碱基的reads；

(3)去除含N比例大于10％的reads；

(4)去除低质量的reads(质量值Q≤20的碱基数占整条reads的50％以上)。

采用Tophat v2.1.1(Trapnell C,Roberts A,Goff L,et al.,2012.Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seqexperiments with TopHat and Cufflinks.Nature protocols 7,562-78.)软件将每个样本的高质量的reads比对到参考转录组序列上(见实施例2)。剔除没有比对上的序列，其余序列利用bcftools v1.9软件(http://www.htslib.org/doc/bcftools.html)识别SNP位点。识别的SNP位点经过严格过滤，获得高质量的SNPs数据。

过滤标准如下：

(1)位点上只有2个等位基因；

(2)基因型缺失率≤20％；

(3)最小等位基因频率(MAF)≥5％；

(4)SNP质量值≥100；

(5)纯合子基因型的样本数大于10个；

(6)杂合基因型样本率≤70％。

实施例4与油茶油脂中二十碳烯酸含量相关的SNP位点的筛选

(1)利用GCTA v1.25.2(Jian Y,S Hong L,Goddard ME,Visscher PM,2011.GCTA:a tool for genome-wide complex trait analysis.American Journal of HumanGenetics 88,76-82.)软件对油茶自然群体进行主成分分析(PCA)，利用前10个主成分(PC)作为固定效应用于后续的关联分析(表3)。

表3自然群体部分个体的前10个PC值

(2)将所有样本的SNPs位点数据、前10个PC值数据、表型数据(见实施例1)及Kinship矩阵数据导入TASSEL5.0软件中，采用MLM法分析SNPs与二十碳烯酸含量性状的连锁不平衡性，筛选与油脂中二十碳烯酸含量显著关联的分子标记，经多重检验校正，检测到了11个跟二十碳烯酸含量存在极显著关联的位点(P<10^-5，表1)，这些位点位于11个转录本内，6个位于非编码区，5个位于编码区，引起2个非同义突变和3个同义突变，对二十碳烯酸含量差异的贡献率为10.19％-32.14％(见表1)。

实施例5本发明的11个分子标记在高二十碳烯酸油茶育种中的应用

(1)选择一个油茶杂交F1代家系群体为材料(母本为‘长林53号’，父本为‘长林40号’，均为国家审定良种，良种号分别为“国S-SC-CO-012-2008”和“国S-SC-CO-011-2008”)，采集嫩叶提取总RNA(见实施例2)。以RNA为模板，采用Clontech cDNA合成试剂盒反转录生成单链cDNA，并稀释100倍，作为工作液。

(2)利用SEQ ID NO.12-33所示的引物对对单链cDNA工作液分别进行PCR扩增，反应体系如表4所示：

表4

PCR扩增程序为：

(3)PCR扩增产物进行凝胶检测和纯化回收并进行测序和基因分型。凝胶检测和纯化回收按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AxyGEN,Code No.AP-GX-50)说明书进行，其流程如下：

①配制1.2％的琼脂糖凝胶，将50μl扩增产物全部上样，电泳电压为5V/cm，电泳约20分钟至上样缓冲液中二甲苯青达到距离凝胶前端1cm处时停止电泳。

②在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(例如100mg＝100μl体积)。

③加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，每2～3分钟间断混合，直至凝胶块完全熔化。

④加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

⑤将上述溶液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑥加入500μl Buffer W1，12000rpm离心30秒，弃滤液。

⑦加入700μl Buffer W2，12000rpm离心30秒，弃滤液。以同样的方法再用700μlBuffer W2洗涤一次，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑧将制备管放回离心管中，12000rpm离心1分钟。

⑨将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25～30μl去离子水，室温静置1分钟。12000rpm离心1分钟洗脱DNA。

⑩凝胶回收DNA，以对应的扩增引物为测序引物，采用一代测序测定扩增产物核苷酸序列，用Chromas软件判读测序峰图上每个SNP位点的基因型。

(4)分别鉴定所有个体的11个位点的基因型。对照表2中各位点的基因型与二十碳烯酸含量高低的关系，若某油茶单株在11个位点中有大于等于2个位点为高二十碳烯酸含量基因型，则该油茶个体为高二十碳烯酸含量候选油茶；若某油茶单株在11个位点中无高二十碳烯酸含量基因型的位点时，则该油茶个体为低二十碳烯酸含量油茶；若高含油率基因型位点数大于等于3个时，则该油茶个体基本可认定为高二十碳烯酸含量油茶。

(5)采集所有F1代个体完全成熟种子，测定其种子油脂中二十碳烯酸含量(见实施例1)。结果表明(表5)，在11个位点中超过2个位点(包括2个)为高二十碳烯酸含量基因型的单株中，81.48％的个体其种子油脂中二十碳烯酸含量高于群体二十碳烯酸含量平均值(0.5163％)；在11个位点中高二十碳烯酸含量基因型大于等于1个位点的个体中，70.45％的个体其种子油脂中二十碳烯酸含量高于群体平均值(0.5163％)；11个位点中高二十碳烯酸含量基因型大于等于3个位点的所有个体，其种子油脂中二十碳烯酸含量均高于群体平均值(0.5163％)；11个位点中无高二十碳烯酸含量基因型的所有个体中，67.42％的个体其种子油脂中二十碳烯酸含量低于群体平均值(0.5163％)。这表明该标记用于辅助选择是切实有效的，可用于早期鉴别或辅助鉴别，可大大节约生产成本，提高选择效率，加快油茶高油育种进程。

表5F1单株的种子油脂中二十碳烯酸含量及基因型数据

注：表中“..”表示基因型缺失。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120> 与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP201112310.1

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttccatacta agggaacatg atatttgtga cataatacag caatgtcagg gttgtgctga 60

aaacaaaggc tttgaggttt atccgtgggc ctttcctttt gaccctgata agtgggatga 120

tattagccag tctgacataa gtgcaatgag ggaggtgttg aagtatgtgc ctttaaagga 180

agactgtaaa atgcagctta ccttggagtt gtctcgtcca aaatgttatc atattcttga 240

taatttgact ttagaggctg tgaaggacgt caagattcaa gagttacata gatttgttga 300

tgacgtatca tctgatgagt caatagctga ggatgcaaaa accatgctct atgattttgc 360

taatggcata atcgacgggc tctatgtctt gtctggtttc aaagcagaag cgttgatcta 420

ttttcaggaa gctatcatat ttcctatatc acgtgggagc ttcggacctt gtacagacga 480

gcttcgtgga gtgattaaca ttgctgataa tgagagaaga atgcaatgtc aacgtttcat 540

cagcgtacaa cacattttgt ttggcctctc tttttcaaga gttggtgaca atgtgaggat 600

gctcaataac aggccaagat gttcgggtgg attacgttta aaactgtcta tgtttagcat 660

ttacaagtta tcacacatag cagccgacag acttggtgat aaggaggttg gacttgagca 720

cttgattctg gcaattttct ttggaaagca agaggacgat cctattaagc gggtggaact 780

ggagtacggc agttctctgt tcttcgacga taatgcattt gatcctgagc ttgtggactg 840

tgagaagcaa cgacttcttt tgttctttgg tgaaagtatc ttacataacg ggtatatcac 900

agtagtgtat acctctccca cacaaacata tggagaaggg tttcacatgc ttgtgattta 960

gaagaataca ccacagtggt atacctgtta cataaaaata ctacctctgt tttttaaccc 1020

ttgtgcgttt atattacacc aagctattat atattaaatt tacaatctac atgtagaatt 1080

ttatacaatt aacttaattt tctcattttt gtttctttta ttcttccctt tctctaggtt 1140

tgaaaagtag ttgcactgag tgtgatgcaa aaagcttgga gtactctgct gttttcaaag 1200

aattcttacc agaaaattgt tttgatgggg cactagtgaa atgttgtggc cttgtggtca 1260

tggaaaaatt gcacgaggct ctcaagtgtg gtggcttgag gttgagtcca attcgtgagg 1320

agagttaata tcacccttcc ttgtgtgggc aggcttaaga cattatattc aagtctctca 1380

cttttattat tgttagatac ataattttga atgctcttga gaacatggat ggatggttag 1440

gcttaatatt ctaagacatt ataggcaagt ctctcacctt tattattgtt agatgccatc 1500

atttttgaat acactaatac tgtaaaatca tattcaacta tttcgaaatt atttagaatt 1560

atcatc 1566

<210> 2

<211> 2750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcttcccat cgccgtcgtt catccactcc tctcaccacc accacctccc cagaaccccc 60

acccggcgct tctccacaaa ccccagggct cgaagaccct acgactccga ccccaaacac 120

tcctcctctc agaccctatc acctccaact gaccccaagt atgccggaat ccgccgtcgc 180

gtcgacttcg ctcggcggac ccagaggtcc gaccatctcc atgccgtttc gccttccaat 240

ccacagaaat tcgaagtcac atcatccccc gggaacaagt tttccggcat cggagctttc 300

cggctcaaca aggttcgctg gcagatggct ttttcactac ccattttgat aactgtattt 360

tcgtctctac tacacaagat tttttcttat caaaatcaga tcattgatct acaggatcac 420

atttccaagc tcaatgttag attacgagct tgcactttgg tggattctgt ggatattatc 480

aattcaatac cgcaggagag tgatcatctt cctaacaaaa gcttgaaaat ttctgttcta 540

attgtcttac ttacaatttt atctatccct tttcttttct tcaagtatgt tgagcatgtc 600

tcaaaatcaa gaagatcgtc atcagacaac attgcagaag aagtgtcttt aaacaagcag 660

ttagcatata gggtagatgt gtttttatca gtccacccat acgctaagcc tttggcattg 720

ttaatagcaa ccctactact aatttgtctt ggtgggctgg cactctttgg tgtgacagat 780

gatagcttag ccgacagcct ttggttatct tggacatatg tagcagactc aggcaatcac 840

gctaattctg aaggtgttgg tccaaggcta gtttcagtat ccattagctt tggtgggatg 900

cttatatttg ctatgatgct tggacttgtc tctgatgcaa tttccgagaa gcttgactca 960

ttgaggaaag gaagaagtga ggtggttgag caaaaccata ctctaattct tggttggagt 1020

gataaattgg gatcactatt aaatcaactt gccatagcca atgaaagttt gggtggaggg 1080

attgttgtag tgatggctga gcgagacaaa gaagagatgg aaagtgacat tgctaaaatg 1140

gagtttgatt tcagaggaac atccgtcata tccagaagtg gaagccctct gattttagct 1200

gacctaaaaa aggtatctgt ctccaaggcc cgtgcaataa tcgtccttgc tgaagatgga 1260

aatgctgacc agagtgatgc tcgtgcactt aggacagttt taagcctaac tggagtgaaa 1320

gaaggactac ggggacacat agtggtggaa ctaagcgatc ttgacaatga ggtccttgtt 1380

aaactcgttg gtggagatct tgttgaaact gttgtagcac atgatgtaat tggtcgcctg 1440

atgattcaat gtgctcgtca gccaggcctt gcgcagatct gggaagatat ccttgggttt 1500

gaaaattgtg agttctatat caaaagatgg ccacagttgg atggcatgca atttgaggat 1560

gcattgatca gcttccctga tgctattcct tgtggaatca aggctgcatc ctatggtgga 1620

aaaattattc tgaatcctga tgactcctat gttctacaag aaggcgatga agttcttgtt 1680

atagcagaag acgatgatac ttattgccca acgacattgc caacggtttg gagaggaaat 1740

ctacccaaag acttcattgt tccaaagtct gcagaaagga tacttttttg tggttggcgg 1800

cgtgatatgg aagatatgat tatggtactg gaggcctttt tagcacctgg ttctgagttg 1860

tggatgttca atgatgttcc tgaaaaggag agggaaaaga agcttattga tggtggtctc 1920

gacatcaacc atttggtgaa tatatcactt attaaccggg aaggaaatgc tgttatacga 1980

cggcacctgg aaagtcttcc attagaatct tttgattcaa tcttaatttt ggctgatgaa 2040

tcagtggaag attcagccat tcaagctgat tccagatctc ttgccacatt gctactgatt 2100

cgtgatattc aggctaagcg tctcccatac agagaagcca agattttcca aggacacaga 2160

ggtagcgtct cacaaggctc ttggataggg gaaatgcagc aggcttcaga taaatcagtt 2220

ataatcagtg agattttgga cccacggact aaaaatctat tatccatgtc aaagataagt 2280

gattatgttc tatcaaatga actggtcagc atggcattgg ccatggttgc tgaagaccgc 2340

caaataaatg acgtactgga agagctgttt gcagaagagg gcaatgagat gcatataagg 2400

cgagcagatc tctaccttcg ggatggtgag gaactgagtt tttatgaagt actcctacgt 2460

gcacgacaga ggagagagat tgtgatcggg taccgtctag ctattgcaga gaaagctgtt 2520

atcaatcccc caggcaaaaa tgagaagcag aggtggtcac tagaggatgt ttttgtagta 2580

attgctgaga aggaatgaag ctttttcatt ctgttacaca ctaagaagga gatcattagc 2640

aagtggattt ttcactatat aggttatccc ctttagcttt acatgctctt cttgggaaaa 2700

aaagaagaag aagacgataa gaaatttaaa aaagagaaag gttacataca 2750

<210> 3

<211> 643

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaggcccat attcactcag ctgcacccta gggtttcaaa aaccagcgta tatagcttcg 60

atcgtcttct ccaaatcacc caaaaaccag ccgtcgaaac cagacgctca ggaactttct 120

ctctctagag ttaaggggtg tggaaatggc gacagtacca gggcctctga tctgggagat 180

tgtgaagaag aacaactctt tcctcgtgaa ggagtttggt aacggaactg ctagcgtgcg 240

cttcagcaaa gagagcaaca atctctacaa cctcaactcc tacaagcact ctgggttagc 300

gaacaagaaa actgtaacca ttcaaccagg gggtaaagat caatctgtgt tgcttgcaac 360

aacgaagacc aagaagcagg ccaaaccatc cactttactt cacaagtctg ttatgaagaa 420

ggagttccgt cgcatggcaa ggcagtgaca aaccaggtgg gaaataacta ttacaggcca 480

gatctgaaga atgcagccct tgcaaggttg agcgccgtgc acaggagcct taaggtcacc 540

aaatctggtg tcaagaagag gaacaggcag gctcttaaga agtgaattta ggatgagagt 600

gattcttgtt tccatcattt ctagacttcg gaagtttgtg ttg 643

<210> 4

<211> 1918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcgccggt ttctctgtct ctgtctctct ctctgggagt gaaaaatgca aaccctaggc 60

acctctcagt gtttgtctgt ctcaagccac cgtcagtttc tgtcgccggt ggccgccatt 120

tccggcagaa gttcaagttc atgctccctt ccgttcttcc caactttgca atgccactct 180

ctccattctc catctccagt tatggatgag accaagtttg aagaggcttc aagaaaggga 240

aacttgattc cgcttcacaa ttgcattttc tctgatcact tgactccggt gctcgcttat 300

agatgcttgg ttaaagaaga cgatcgagag gctccgagct ttctgtttga gtcagttgac 360

cctggtttct gtgcttccag tgttggtcgt tatagcgtgg ttggagctca gcctgcaatg 420

gaaattgttg caaaagaaaa taaagttaca attttggacc atgagaaggg gtgcttgaca 480

gaaaaggttg ttgatgatcc aatgtcgatc ccaaggacta tttcagagag ttggaggccc 540

cactttatta ctgaacttcc cgatacattt tgtggtgggt gggttggtta tttctcatat 600

gacacagttc gttatgtaaa gaagatgaaa ctaccattcc caagggcacc acaggatgac 660

atgaatcttg ctgatatcca tctaggtctc tatgatgatg taattgtttt tgatcatgta 720

gagaagaaag catatgcgat tcattgggtt cagttagatc agtactcttc cattgagaag 780

gcttatgatg gcggaataaa acgcttggaa attctggtgt ccaaagtatt ggatattgat 840

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aaaaagtcga acatgacaag tgaggaatac aagaacacag tcctacaagc gaaagagcat 960

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<210> 5

<211> 1767

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcttcaacct ctggagagtt gatcagatcg accgccggcc aaccaaatcg aaaaactttt 60

acagggaaca tctctcgctc tctctaggaa aataccaaat cgacgattct gcgaagacaa 120

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<210> 6

<211> 1487

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acccggtctc cgtctctcat ctctctctac ctcactgact tctctctctc tctctcagat 60

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttccatacta agggaacatg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttaagcctaa ccatccatcc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttcttcccat cgccgtcgtt 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgtatgtaac ctttctctt 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtaggcccat attcactcag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caacacaaac ttccgaagtc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctcgccggt ttctctgtct 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tccaaatcga cataaaagca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcttcaacct ctggagagtt 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccatcagata ttcccttagt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atggaatcaa tttctattca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tggatgcagg gttccttcag 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcagaaggaa cagagatttt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cggacggttc acaaatgaaa 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttcagaccag caagaaagtc 20

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcgtggtgca agaaaccaca tg 22

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

acccggtctc cgtctctcat 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gcatcaatac cgtttgagaa 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agtgtcccaa gtgctctgcg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gatcataaat ttgcaggctg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tctatgtgat tttagtactg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acactattac caaaagtcac 20

Claims

1.与油茶种子油中二十碳烯酸含量相关的SNP分子标记组合，其特征在于，所述SNP分子标记组合由PB.12067.3-268、PB.12683.1-1828、PB.24814.1-110、PB.26042.1-50、PB.38187.1-147、PB.43088.1-179、PB.44396.1-122、PB.70894.1-2810、PB.81782.1-306、PB.98296.1-148和PB.98486.6-1148组成；

其中，SNP分子标记PB.12067.3-268为如SEQ ID NO.1所示序列第268位的多态性为C/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.12683.1-1828为如SEQ ID NO.2所示序列的第1828位的多态性为C/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.24814.1-110为如SEQ ID NO.3所示序列第110位的多态性为A/C的核苷酸序列；SNP分子标记PB.26042.1-50为如SEQ ID NO.4所示序列的第50位的多态性为A/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.38187.1-147为如SEQ ID NO.5所示序列第147位的多态性为G/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.43088.1-179为如SEQ ID NO.6所示序列的第179位的多态性为T/G的核苷酸序列；SNP分子标记PB.44396.1-122为如SEQ IDNO.7所示序列第122位的多态性为A/G的核苷酸序列；SNP分子标记PB.70894.1-2810为如SEQ ID NO.8所示序列的第2810位的多态性为C/A的核苷酸序列；SNP分子标记PB.81782.1-306为如SEQ ID NO.9所示序列第306位的多态性为G/C的核苷酸序列；SNP分子标记PB.98296.1-148为如SEQ ID NO.10所示序列的第148位的多态性为T/C的核苷酸序列；SNP分子标记PB.98486.6-1148为如SEQ ID NO.11所示序列第1148位的多态性为G/T的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记组合，其特征在于，所述SNP分子标记PB.12067.3-268中，具有所述多态性的位点的基因型为TT，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为CC或CT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.12683.1-1828中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为CT或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.24814.1-110中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为AC或CC，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.26042.1-50中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为AT或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.38187.1-147中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为GT或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.43088.1-179中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为TG或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.44396.1-122中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为AG或GG，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.70894.1-2810中，具有所述多态性的位点的基因型为AA，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为CA或CC，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.81782.1-306中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为GC或GG，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.98296.1-148中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为TC或TT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；所述SNP分子标记PB.98486.6-1148中，具有所述多态性的位点的基因型为TT，对应于高二十碳烯酸含量，基因型为GG或GT，对应于低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量。

3.用于扩增权利要求1或2所述的SNP分子标记组合的引物组合。

4.根据权利要求3所述的引物组合，其特征在于，为如SEQ ID NO.12-13所示的PB.12067.3-268的引物、如SEQ ID NO.14-15所示的PB.12683.1-1828的引物、如SEQ IDNO.16-17所示的PB.24814.1-110的引物、如SEQ ID NO.18-19所示的PB.26042.1-50的引物、如SEQ ID NO.20-21所示的PB.38187.1-147的引物、如SEQ ID NO.22-23所示的PB.43088.1-179的引物、如SEQ ID NO.24-25所示的PB.44396.1-122的引物、如SEQ IDNO.26-27所示的PB.70894.1-2810的引物、如SEQ ID NO.28-29所示的PB.81782.1-306的引物、如SEQ ID NO.30-31所示的PB.98296.1-148的引物和如SEQ ID NO.32-33所示的PB.98486.6-1148的引物。

5.含有权利要求3或4所述的引物组合的试剂或试剂盒。

6.权利要求1或2所述的SNP分子标记组合或权利要求3或4所述的引物组合或权利要求5所述的试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)在鉴定油茶种子油中二十碳烯酸含量表型中的应用；

(3)在油茶种子油中二十碳烯酸含量早期预测中的应用；

(4)在筛选高二十碳烯酸含量油茶中的应用。

7.鉴定油茶中二十碳烯酸含量表型的方法，其特征在于，包括：

(1)提取待鉴定油茶的总RNA，反转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15、SEQ ID NO.16-17、SEQID NO.18-19、SEQ ID NO.20-21、SEQ ID NO.22-23、SEQ ID NO.24-25、SEQ ID NO.26-27、SEQ ID NO.28-29、SEQ ID NO.30-31和SEQ ID NO.32-33所示引物对进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定油茶的二十碳烯酸含量表型。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94～95℃，3～5min；94～95℃，15～30s，65～69℃，40～60s，38～45个循环；67～70℃，3～6min。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述判断待鉴定油茶的二十碳烯酸含量表型的方法如下：

若SNP分子标记PB.12067.3-268具有所述多态性的位点的基因型为TT，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为CC或CT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.12683.1-1828具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为CT或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.24814.1-110具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为AC或CC，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.26042.1-50具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为AT或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.38187.1-147具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为GT或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.43088.1-179具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为TG或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.44396.1-122具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为AG或GG，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.70894.1-2810具有所述多态性的位点的基因型为AA，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为CA或CC，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.81782.1-306具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为GC或GG，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；

若SNP分子标记PB.98296.1-148具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高二十碳烯酸含量，若基因型为TC或TT，则待鉴定油茶为低二十碳烯酸含量或候选低二十碳烯酸含量；