CN105519432A - 一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法 - Google Patents

一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，属于植物育种方法，（1）选择花生种子；（2）进行γ射线诱变处理，（3）将处理后的M0代种子种植于大田。（4）对诱变处理后代进行油酸含量的定向选择，连续5代正向选育，利用近红外无伤检测技术进行单粒检测，获得O/L高于3.0的株系进行鉴定。（5）提取M5代种子筛选出的油酸/亚油酸比值大于3.0的株系叶片DNA，以Ahfad2a基因特异引物进行PCR，对PCR产物进行测序分析，筛选Ahfad2a-1突变体。（6）用Ahfad2a-1突变体做父本，以高产、优质、抗逆性强、综合性状好的优良品种为母本进行杂交，获得高油酸高产优质花生品种。

Description

一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法
技术领域
本发明涉及到植物化学诱变育种技术领域，特别涉及一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，属于植物育种方法，具体涉及γ射线诱变处理、高油酸花生隐性突变体Ahfad2a-1的筛选、Ahfad2a-1突变体鉴定和Ahfad2a-1高油酸突变体创制高油酸花生新品种。
技术背景
花生是世界四大油料作物之一，是我国油、食兼用的重要农作物，我国是世界花生生产大国，花生总产量占全国油料作物总产的50%，总产量居各油料作物之首，占世界花生总产的43%，居世界第一位。花生产油量高，一亩花生的产油量，相当于1.5亩油菜、4亩大豆和8-10亩油茶的产油量。因此，花生生产关系国计民生。
花生油主要含有两种脂肪酸，即油酸和亚油酸。油酸的营养价值较高，能降低人体血液中的胆固醇含量，防止冠心病发生。人体动脉血管中的胆固醇含量与高密度脂蛋白和低密度脂蛋白密切相关，低密度脂蛋白的主要功能是贮集胆固醇，高密度脂蛋白的功能正好与其相反。亚油酸在降低低密度脂蛋白的同时也降低了高密度脂蛋白的含量，而油酸在降低低密度脂蛋白的同时不影响高密度脂蛋白含量，因此油酸对预防人体动脉血管硬化、防止冠心病的发生有其独特的功能。另外油酸仅有一个双键，化学结构相对比较稳定，抗氧化能力较强，在精炼、贮藏和煎炸时不易变质；亚油酸含有两个双键，易于氧化酸败，使花生产品容易产生异味，花生种子及加工产品货架寿命短。因此，提高花生种仁中油酸含量，降低亚油酸含量，是花生品质改良的重要目标。但目前我国推广的花生品种基本上油酸、亚油酸比值（O/L）均在1.0~1.5之间，南方大多数品种O/L值仅1.0~1.2左右。影响了花生产业的升级发展。
δ-12-脂肪酸脱饱和酶（油酰基PC脱饱和酶）是催化花生单不饱和键的油酸变成具双不饱和的亚油酸的关键酶，花生中有两个油酰基脱饱和酶基因（AhFAD2A和AhFAD2B）。美国最早从花生天然突变体中筛选出油酸、亚油酸比值（O/L）高达40的材料F435，比一般花生种质高20-40倍。研究其原因发现控制花生油酸含量的两个油酸脱饱和酶基因Ahfad2a在448bp位发生了G:C>A:T的置换，使氨基酸发生了D150N变化；另ahFAD2B在其442bp位上出现了一个A插入的无义突变，产生了终止密码子而使肽链提前结束，使这两个脱饱和酶完全丧失了活性。之后，又发现了两个突变体F485和M2-225，它们是在含有Ahfad2a的自发突变外基础上，通过化学诱变引起一个微型转座子元件分别插入在阅读框的第665bp和997bp，引起肽链在该区提前终止。这些突变体均属基因完全失活突变，成为花生高油酸育种的基因源。但这些突变体因经济性状差较难以利用，且受专利保护的限制。国内目前获得少数高油酸花生新材料都是在美国高油酸花生突变体的基础上杂交而来的，尚未获得具有自主知识产权的高油酸花生新种质。此外，已发现现有高油酸花生抗低温能力较弱，使得早春播种出苗慢、出苗率较低；这与O/L比值太高有关。因此，开发新型的高产优质高油酸新材料或两个基因不完全失活的突变体，以便创制油、亚比值在10~15左右的双隐性突变体，对促进高油酸花生产业的发展意义重大。
60Co-γ射线是目前我国花生育种中应用最多的一种射线，效果也比较好，目前利用该方法已选育多个花生品种。迄今为止，采用60Co-γ射线诱变创制高油酸花生突变体的技术体系尚未见报道。
发明内容
本发明针对控制油酸含量的关键酶基因FAD2A和FAD2B，通过60Co-γ射线辐照处理现有高产优质新品种，创制使这两个基因功能丧失和降低的新突变体，通过近红外无伤检测和气相色谱相结合，鉴定突变体的油酸含量，通过测序分析鉴定新突变位点，通过单株和改良混合选择法筛选出优良的高油酸（O/L大于3）突变新材料，并通过与高优新品种或本品种杂交筛选O/L值大于3的新品种。这填补了我国高油酸新材料的空白，将促进高油酸花生品种选育和产业的发展。
技术问题
本发明提供了一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法。目的在于提供60Co-γ射线诱变制备高油酸花生隐性突变体Ahfad2a-1的技术，以便高效利用γ射线辐射诱变技术开展花生优良高油酸突变体和新品系的选育工作。
一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，包括以下步骤：
（1）诱变材料选择：选择高产、优质、综合性状好、适应性强的花生品种；
（2）γ射线诱变处理：挑选饱满均匀的花生种子送往华南农业大学辐照技术开发中心进行γ射线诱变处理，诱变剂量为250Gray，剂量率为180伦琴/分，辐射处理后的种子即为M0代种子；
（3）种植与管理：将M0代种子种植于大田，精细管理。
（4）高油酸花生隐性突变体Ahfad2a-1的筛选：对M1代种子不进行选择，全部单株保留。M2代、M3代分别按单株混合种植，后代全部采用单株一株一果法留种种植，对M3代单株进行近红外无伤检测，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的单株种植，对M4代每个株系进行近红外无伤检测，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的株系，M5代各株系进行近红外无伤检测，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的优良株系进行鉴定。利用气相色谱法分析M5代株/品系种油分、蛋白、油酸和亚油酸含量，进一步确定O/L值。
（5）Ahfad2a-1突变体鉴定：将M5代种子中筛选出的油酸/亚油酸比值大于3.0的优良株系种子种植于大田，于苗期分别提取各株系叶片基因组DNA，以Ahfad2a基因特异引物从基因组中扩增Ahfad2a基因，将特异扩增条带切胶回收后进行序列测定，得到基因的序列。对所获得的序列进行翻译，比对分析，查找突变位点，筛选突变体，以此来判断各株系的油酸含量和油酸/亚油酸比值的高低。
（6）Ahfad2a-1基因杂交转育创制新品种：用Ahfad2a-1突变体做父本，以高产、优质、抗逆性强、综合性状好的优良品种或供体品种为母本进行杂交，创制高油酸高产优质花生新品种。
所述步骤（1）中，所述高产、优质、综合性状好、适应性强的花生品种种子为闽花8号花生品种的种子。
所述步骤（4）中，近红外无伤检测用波通DA7200型或DA7250型近红外分析仪，所用花生模型为波通公司提供的模型。
所述步骤（5）中，所筛选出来的M5代株系DNA提取采用苗期叶片用CTAB粗提法进行。
所述步骤（5）中，Ahfad2a基因特异引物为FAD2Af:5’CAGAATCATTAGATTACTGATTATTGAC3’，FAD2Ar1:5’GTAGTTAATGTTAAACTTGCTCTTATC3’。
所述步骤（5）中，Ahfad2a基因是通过PCR方法，扩增所用的聚合酶为LATaqTMDNApolymerase（TaKaRa），在25μL体系中加入以下成分：2.5μL10×PCRbuffer含15mM的MgCl2；2.5μL10mMdNTPs；1μLDNA模板；10μM0.5μLFAD2Af引物；10μM0.5μLFAD2Ar1；0.5μLLApolymerase和17.5μLddH2O；PCR反应条件为：94℃，5min；94℃30s，56℃1.5min，72℃90s，30cycles；72℃，10min，PCR产物送往华大基因公司进行测序。
所述步骤（5）中，测序引物为FAD2Seq-F：5’-GTATCATGGTATAACAAGTACATGAAC-3’和FAD2Seq-R：5’-CAGCAAAGACAGATGAATCTGAGAC-3’；通过比对诱变处理与否的花生AhFAD2a基因的核苷酸序列和氨基酸序列，查找突变位点，据此来判断各株系油酸含量和油酸/亚油酸比值的高低。
有益效果
本发明对花生种子经γ射线诱变处理后，获得了Ahfad2a-1隐性突变体，其油酸和亚油酸比值为3.31，为高油酸花生种质，该高油酸花生隐性突变体的获得对促进我国高油酸花生育种及利用具有重大意义。
附图说明
图1γ射线诱变处理获得的高油酸花生突变体Ahfad2a-1中A为Ahfad2a突变基因的测序峰图（仅列出含突变位点部分峰图）与B、C为Ahfad2a突变基因序列。
图2γ射线诱变处理获得的高油酸花生突变体Ahfad2a-1中Ahfad2a基因氨基酸序列与野生型Ahfad2a基因氨基酸序列比对结果。
图3利用Ahfad2a-1突变体杂交获得高油酸花生品种的方法。
具体实施方式
实施例1：
γ射线诱变处理材料为闽花8号。该品种是以泉花10号为母本，粤油193为父本有性杂交育成的花生新品种，丰产性、稳产性好。
实施例2：
挑选饱满均匀秋季收获的花生荚果18kg（约20000粒），手工剥壳后将种子寄至华南农业大学辐照技术开发中心进行γ射线诱变处理，诱变剂量为250Gray，剂量率为180伦琴/分，辐射处理后的种子即为M0代种子。处理后的种子于大田种植，精细管理。
实施例3：
将诱变处理后的M0代种子种植于大田，自交后得到M1代，M1代种子单株收获后种植于大田，密植，成株系，自交后得到M2代；每株收单果，混种，自交后得到M3代，对M3代收获的种子利用近红外无伤检测技术检测各单株的油酸和亚油酸含量，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的单株种子，种植于大田；M4代每个株系进行优良性状筛选，并进行近红外无伤检测，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的优良株系，M5代各株系进行近红外无伤检测，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的优良株系进行鉴定。
表1γ射线诱变处理获得的高油酸花生突变体Ahfad2a-1近红外检测结果
实施例4：
将M5代种子种植于大田，于苗期分别取各株新生叶片1片（约10mg），置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状，将研磨号的粉状加入到经65℃预热的700μL2%CTAB抽提缓冲液和2%和β-巯基乙醇提取液中，置于65℃水浴锅中温浴20-30min，期间每隔10min轻轻上下颠倒混匀，加入等体积的24:1氯仿/异戊醇，震荡混匀2-3min，静置10min后于10000rpm离心10min，吸取上清液至另一新的Eppendorf管中，加入等体积的24:1氯仿/异戊醇，震荡混匀2-3min，静置10min后于10000rpm离心10min，吸取上清液至另一新的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后于室温静置10min，于10000rpm离心10min，弃上清，用75%酒精洗涤沉淀2次，将离心管置于真空干燥箱内干燥10min，加入50ulddH2O（含Rnase），置于37℃恒温箱约1h，使RNA降解，即得到花生叶片基因组DNA粗提液。提取的基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见明显的基因组条带，表明DNA提取成功。采用Ahfad2a基因特异引物FAD2Af:5’CAGAATCATTAGATTACTGATTATTGAC3’，FAD2Ar1:5’GTAGTTAATGTTAAACTTGCTCTTATC3’通过PCR方法扩增Ahfad2a基因。扩增所用的聚合酶为LATaqTMDNApolymerase（TaKaRa），在25μL体系中加入以下成分：2.5μL10×PCRbuffer（含MgCl2）；2.5μL10mMdNTPs；1μLDNA模板；0.5μLFAD2Af引物；0.5μLFAD2Ar1；0.5μLLApolymerase和17.5μLddH2O；PCR反应条件为：94℃，5min→（94℃，30s；56℃，1min30s；72℃，90s）30cycles→72℃，10min。PCR产物送往华大基因公司进行测序。对测序结果的核苷酸序列和氨基酸序列进行比对，发现一个Ahfad2a基因发生突变的材料，命名为Ahfad2a-1。该突变体Ahfad2a-1基因开放阅读框长度为1140bp，编码379个氨基酸。Ahfad2a-1基因与Ahfad2a基因相比存在1个突变位点，即553bp处G:C→A:T突变。氨基酸相应序列存在1处变异，第185个氨基酸甘氨酸G突变为精氨酸R（G185R）。利用近红外无伤检测技术对该突变体油酸和亚油酸含量进行测定，结果表明该突变体籽仁油酸含量为62.86%，O/L为3.31。而对照品种闽花8号油酸含量为45.8%，亚油酸含量32.5%，油亚比为1.40。Ahfad2a-1突变体油酸含量相比对照品种提高了37.25%。
实施例5：
利用Ahfad2a-1突变体创制高油酸高产优质花生新品种的育种方法，该方法主要包括以下步骤：
（1）用Ahfad2a-1突变体做父本，以高产、优质、抗逆性强、综合性状好的优良品种为母本进行杂交，得到F1代；
（2）选择后代F1做父本，与普通油酸含量的高产、优质、抗逆性强、综合性状好的优良品种（基因型为AABB）为母本进行回交，得到后代BC1F1；以后再用优良品种做母本进行回交，选优良单株。选出的优良单株，每回交一次后要自交一次，近红外测定筛选高油酸材料再回交。直接选出高油酸且同时具有轮回亲本其他优良性状如产量、抗病性、株型等的株系，即得到高油酸花生新品种。由于Ahfad2a-1供体亲本为高产优质抗逆闽花8号品种，加快了高油酸花生品种育种进程。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCELISTING
<110>福建农林大学
<120>一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法
<130>4
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cagaatcattagattactgattattgac28
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gtatcatggtataacaagtacatgaac27
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cagcaaagacagatgaatctgagac25

Claims (7)

1.一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，包括以下步骤：
（1）诱变材料选择：选择高产、优质、综合性状好、适应性强的花生品种的种子；
（2）γ射线诱变处理：挑选饱满均匀的花生种子进行γ射线诱变处理，诱变剂量为250Gray，剂量率为180伦琴/分，辐射处理后的种子即为M0代种子；
（3）种植与管理：将处理M0代及以后各世代种子种植于大田，精细管理；
（4）高油酸花生隐性突变体Ahfad2a-1的筛选：对M1代种子不进行选择，全部单株留种；M2代以后分别按株系全部采用单株一株一果法留种种植，对M3代单株进行近红外无伤检测，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的单株种植，M4代对每个株系进行比较，同时进行近红外无伤检测，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的优良株系，M5代各株系进行近红外无伤检测，筛选油酸/亚油酸比值大于3.0的优良株系进行鉴定；利用气相色谱法分析M5代株/品系种油分、蛋白、油酸和亚油酸含量，进一步确定油酸/亚油酸值；
（5）Ahfad2a-1突变体鉴定：将M5代种子中筛选出的油酸/亚油酸比值大于3.0的株系种子种植于大田，于苗期分别提取各株系叶片基因组DNA，以Ahfad2a基因特异引物从基因组中扩增Ahfad2a基因，将特异扩增条带切胶回收后进行序列测定，得到基因的序列；对所获得的序列进行翻译，比对分析，查找突变位点，筛选突变体，以此来判断各株系的油酸含量和油酸/亚油酸比值的高低；从中选出Ahfad2a-1突变体；
（6）Ahfad2a-1基因杂交转育品种：用Ahfad2a-1突变体做父本，以高产、优质、抗逆性强、综合性状好的优良品种为母本进行杂交，获得高油酸高产优质花生品种。
2.根据权利要求1所述的一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述高产、优质、综合性状好、适应性强的花生品种种子为闽花8号花生品种的种子。
3.根据权利要求1所述的一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，其特征在于，所述步骤（4）中，近红外无伤检测用波通DA7200型或DA7250型近红外分析仪，所用花生模型为波通公司提供的模型。
4.根据权利要求1所述的一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，其特征在于，所述步骤（5）中，所筛选出来的M5代株系DNA提取采用苗期叶片用CTAB粗提法进行。
5.根据权利要求1所述的一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，其特征在于，所述步骤（5）中，Ahfad2a基因特异引物为FAD2Af:5’CAGAATCATTAGATTACTGATTATTGAC3’，FAD2Ar1:5’GTAGTTAATGTTAAACTTGCTCTTATC3’。
6.根据权利要求1所述的一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，其特征在于，所述步骤（5）中，Ahfad2a基因是通过PCR方法，扩增所用的聚合酶为LATaqTMDNApolymerase（TaKaRa），在25μL体系中加入以下成分：2.5μL10×PCRbuffer含15mM的MgCl2；2.5μL10mMdNTPs；1μLDNA模板；10μM0.5μLFAD2Af引物；10μM0.5μLFAD2Ar1；0.5μLLApolymerase和17.5μLddH2O；PCR反应条件为：94℃，5min；94℃30s，56℃1.5min，72℃90s，30cycles；72℃，10min，PCR产物送往华大基因公司进行测序。
7.根据权利要求1所述的一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，其特征在于，所述步骤（5）中，测序引物为FAD2Seq-F：5’-GTATCATGGTATAACAAGTACATGAAC-3’和FAD2Seq-R：5’-CAGCAAAGACAGATGAATCTGAGAC-3’；通过比对诱变处理与否的花生AhFAD2a基因的核苷酸序列和氨基酸序列，查找突变位点，据此来判断各株系油酸含量和油酸/亚油酸比值的高低。
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