CN111500764B

CN111500764B - 与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的snp分子标记及其应用

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Publication number: CN111500764B
Application number: CN202010456770.2A
Authority: CN
Inventors: 林萍; 姚小华; 王开良
Original assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN111500764A

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供3个与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记PB.34365.1‑621、PB.8541.2‑812和PB.35271.1‑555，分别含有如SEQ ID NO.1‑3所示序列的第621、812和555位的多态性为C/T、T/C和G/A的核苷酸序列。利用这3个分子标记进行油茶油酸和亚油酸含量表型的鉴定，可实现苗期的鉴定和辅助筛选，有效提高油茶育种的选择效率，加快育种进程。

Description

与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域。具体涉及与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

油茶(Camellia oleifera Abel.)隶属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L.)，是木本油料树种。油茶籽油含有丰富的营养物质，是一种优质的食用油，其不饱和脂肪酸含量达90％以上，以油酸和亚油酸为主。油茶籽油具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等功效，具有较高的营养保健价值。目前，以选择和杂交育种为主要手段、以产果量为主要育种目的的油茶育种已取得了重要进展，但以改良油茶籽油品质为目的育种研究仍较少。油茶的常规育种周期很长，新品种选育缓慢，因此良种选育速度还不能满足产业发展的需求，已成为限制油茶产业发展的重要因素之一。

相比于传统育种手段，分子标记辅助育种手段可从苗期开始选择，大幅缩短育种的进程，对以果实为主要目的的经济林育种优势尤其明显。分子标记辅助育种离不开有效的分子标记，因此，开发与油茶籽油品质表型相关的分子标记，对于油茶籽油品质的分子标记辅助育种以及油茶籽油品质的改良具有重要意义。

油酸(Oleic acid)是一种单不饱和Omega-9脂肪酸，存在于动植物体内，亚油酸(linoleic acid)是一种Omega-6多不饱和脂肪酸。油酸作为单不饱和脂肪酸比亚油酸具有更好的氧化稳定性。对于植物油而言，增加油酸含量的同时降低亚油酸含量，有利于油品质的提升，因此选育高油酸低亚油酸含量的油茶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记，本发明的另一目的是提供该SNP分子标记在油茶油酸和亚油酸含量表型鉴定和育种中的应用。

本发明提供的与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记的开发方法是基于油茶是典型的异交物种，连锁不平衡(LD)通常在较小的范围内迅速消减，因此可以开展重要性状的LD作图。油茶的种仁全部转录本作为本发明分子标记开发的区域。在具备产生了大量明显的遗传变异的油茶自然群体的前提下，开展与油茶种子油脂中油酸、亚油酸含量变异显著相关的标记开发。SNP分子标记的开发过程基本如下：

(1)在油茶全分布区内广泛收集油茶种质资源，建立油脂中油酸、亚油酸含量发生广泛分离的油茶自然群体。

(2)采集自然群体500份油茶种质的完全成熟种子，用气象色谱法测定成熟种子油脂的6种脂肪酸成分含量，包括硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸，具体方法按照GB/T 17376《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》和GB/T 17377《动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析》执行。

(3)采集自然群体500个油茶单株的油脂高速合成期的种仁，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)提取总RNA，每样本分别构建cDNA文库，利用Illumina HiSeqTM 4000平台进行二代转录组测序。

(4)采集油茶“长林4号”的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子，采用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取RNA，各组织RNA等比例混合，构建PacBio SMRTbell文库，在PacBio Sequel平台进行三代转录组测序。测序结果过滤掉低质量数据和冗余序列后，对所有转录本进行注释分析。过程中用到软件LoRDEC(http://www.atgc-montpellier.fr/lordec/)、CD-HIT v4.6(Fu L,NiuB,Zhu Z,Wu S,Li W,2012.CD-HIT:accelerated for clustering the next-generationsequencing data.Bioinformatics 28,3150-2.)、Coding Potential Calculator(CPC)(Kong L,Zhang Y,Ye Z-Q,et al.,2007.CPC:assess the protein-coding potential oftranscripts using sequence features and support vector machine.Nucleic AcidsResearch 35,W345.)和Coding-Non-Coding Index(CNCI)(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)等都是公众可获得的公开软件。

(5)以(4)中获得的全长转录组序列为参考序列，采用多序列比对法，分析(3)中获得的500个样本转录组序列的SNP位点。SNP数据根据以下原则严格过滤：每个位点只有2个等位基因；基因型缺失率≤20％；最小等位基因频率≥5％；SNP质量值≥100；纯合基因型样本数超过10个；杂合基因型率≤70％。过程中用到软件bcftools v1.9software(http://www.htslib.org/doc/bcftools.html)是公众可获得的公开软件。

(6)将群体的基因型数据输入GCTA v1.25.2(Jian Y,S Hong L,Goddard ME,Visscher PM,2011.GCTA:a tool for genome-wide complex trait analysis.AmericanJournal of Human Genetics 88,76-82.)软件，进行主成分分析(PCA)。

(7)将群体的基因型数据、前10个主成分数据、油脂中油酸、亚油酸含量的表型数据以及Kinship矩阵数据输入TASSEL5.0(http://www.maizegenetics.net/tassel)软件中，采用统一混合线性模型方法(MLM)分析SNPs标记和油茶油脂中油酸、亚油酸含量性状的连锁不平衡性，检测到3个位点同时与油酸、亚油酸含量极显著关联(P<10^-5)，分别命名为PB.34365.1-621、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555(表1)。

表1 SNP分子标记信息

PB.34365.1-621中SNP位点对应于油茶PB.34365.1转录本(SEQ ID NO.1)的第621位，多态性为C/T，基因型为C/C、C/T或T/T，该位点突变形成了编码蛋白的第177位氨基酸的错义突变；PB.8541.2-812中SNP位点对应于油茶PB.8541.2转录本(SEQ ID NO.2)的第812位，多态性为T/C，基因型为C/C、C/T或T/T，该位点突变形成了编码蛋白的第245位氨基酸的错义突变；PB.35271.1-555中SNP位点对应于油茶PB.35271.1转录本(SEQ ID NO.3)的第555位，多态性为G/A，基因型为G/G、G/A或A/A，该位点突变形成了编码蛋白的第52位氨基酸的错义突变。PB.34365.1-621位点对油酸含量和亚油酸含量变异的贡献率(R²)分别为12.94％和12.69％；PB.8541.2-812位点对油酸含量和亚油酸含量变异的贡献率分别为12.56％和10.73％；PB.35271.1-555位点对油酸含量和亚油酸含量变异的贡献率分别为12.73％和14.80％(表1)。

具体地，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记，包括PB.34365.1-621、PB.8541.2-812或PB.35271.1-555；其中，SNP分子标记PB.34365.1-621含有如SEQ ID NO.1所示序列第621位的多态性为C/T的核苷酸序列；SNP分子标记PB.8541.2-812含有如SEQ ID NO.2所示序列的第812位的多态性为T/C的核苷酸序列；SNP分子标记PB.35271.1-555含有如SEQ ID NO.3所示序列的第555位的多态性为G/A的核苷酸序列。

具体地，SNP分子标记PB.34365.1-621的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列的第621位，多态性为C/T；SNP分子标记PB.8541.2-812的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SNP位点位于SEQ ID NO.2所示序列的第812位，多态性为T/C；SNP分子标记PB.35271.1-555的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，SNP位点位于SEQ ID NO.3所示序列的第555位，多态性为G/A。

SNP分子标记PB.34365.1-621可由SEQ ID NO.4-5所示的引物，以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得。SNP分子标记PB.8541.2-812可由SEQ ID NO.6-7所示的引物，以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得。SNP分子标记PB.35271.1-555可由SEQ ID NO.8-9所示的引物，以油茶cDNA为模板经PCR扩增获得。

P1：SEQ ID NO.4：5’-GACATAGACACAAATCTAGA-3’；

P2：SEQ ID NO.5：5’-CCAAACGGGGCCTTACATCAG-3’；

P3：SEQ ID NO.6：5’-GGTCTGCAAAACCTTAGAAA-3’；

P4：SEQ ID NO.7：5’-TACAAATTAGTTCTCAAAATC-3’；

P5：SEQ ID NO.8：5’-ATCCGAGGAGATACACTGGC-3’；

P6：SEQ ID NO.9：5’-CCATTGTTACCATTCCATTC-3’。

以上SNP分子标记，PB.34365.1-621中，具有所述多态性的位点的基因型为TT，对应高油酸低亚油酸含量，基因型为CC，对应低油酸高亚油酸含量，基因型为CT，对应候选高油酸低亚油酸含量。PB.8541.2-812中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，对应高油酸低亚油酸含量，基因型为TT，对应低油酸高亚油酸含量。PB.35271.1-555中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应高油酸低亚油酸含量，基因型为AA，对应低油酸高亚油酸含量。

SNP分子标记PB.34365.1-621、PB.8541.2-812、PB.35271.1-555可分别单独使用或任意两个或三个联合使用用于油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量表型的鉴定，联合使用时鉴定的准确率更高。

本发明还提供与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记组合，其包括PB.34365.1-621、PB.8541.2-812、PB.35271.1-555中的至少两个。

具体地，所述SNP分子标记组合包括PB.34365.1-621和PB.8541.2-812、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555、PB.34365.1-621和PB.35271.1-555，或者包括PB.34365.1-621、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555。

第二方面，本发明提供用于扩增所述SNP分子标记或SNP分子标记组合的引物。

作为本发明的一种实施方式，所述引物包括如SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7和SEQ ID NO.8-9所示引物中的一对或多对。

其中，SEQ ID NO.4-5所示分子标记用于扩增PB.34365.1-621，SEQ ID NO.6-7所示引物用于扩增PB.8541.2-812，SEQ ID NO.8-9所示引物用于扩增PB.35271.1-555。

本发明还提供含有所述引物的试剂或试剂盒。

所述试剂或试剂盒包括如SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7和SEQ ID NO.8-9所示引物中的一对或多对。

第三方面，本发明提供所述SNP分子标记或所述SNP分子标记组合或所述引物或所述试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)在鉴定油茶种子油脂中油酸和/或亚油酸含量表型中的应用；

(2)在油茶种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用，所述种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种的性状为种子油脂中的油酸和/或亚油酸含量；

(3)在油茶种子油脂中油酸和/或亚油酸含量早期预测中的应用；

(4)在筛选高油酸低亚油酸含量油茶中的应用。

(5)在筛选低油酸高亚油酸含量油茶中的应用。

在利用本发明提供的3个SNP分子标记PB.34365.1-621、PB.8541.2-812、PB.35271.1-555进行油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量表型鉴定或分子标记辅助育种时，本领域技术人员根据需要可以选择其中的任意1个分子标记、2个分子标记的组合或同时使用3个分子标记进行，2个或3个分子标记组合使用时，鉴定的准确率更高。

第四方面，本发明提供鉴定油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量表型的方法，包括：

(1)提取待鉴定油茶的总RNA，反转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7、SEQ ID NO.8-9所示引物中的一对或多对进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中所述SNP分子标记或所述SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量表型。

上述方法的步骤(1)中，所述待鉴定油茶可以为任何育种材料，包括自然群体个体和有性群体个体。

提取待鉴定油茶总RNA可采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)。反转录合成单链cDNA采用PrimeScript RT MasterMix试剂盒(TaKaRa,大连，中国)。

步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：94～95℃，3～5min；94～95℃，15～30s，65～69℃，40～60s，38～45个循环；67～70℃，3～6min。

步骤(3)中，分析SNP分子标记的基因型可采用本领域常规技术手段，例如测序等，可以SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7、SEQ ID NO.8-9为测序引物进行测序。

步骤(3)中，判断待鉴定油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量表型的方法如下：

若SNP分子标记PB.34365.1-621具有所述多态性的位点的基因型为TT，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量，基因型为CC，则待鉴定油茶为低油酸高亚油酸含量，基因型为CT，则待鉴定油茶为候选高油酸低亚油酸含量。若SNP分子标记PB.8541.2-812中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量，基因型为TT，则待鉴定油茶为低油酸高亚油酸含量，基因型为CT，待鉴定油茶的油酸亚油酸含量还需要进一步鉴定。若SNP分子标记PB.35271.1-555中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量，基因型为AA，则待鉴定油茶为低油酸高亚油酸含量，基因型为GA，待鉴定油茶的油酸亚油酸含量还需要进一步鉴定。

本发明提供鉴定油茶高油酸低亚油酸含量表型的方法，包括：

(1)提取待测油茶的种子总RNA，反转录合成cDNA；

(3)分析PCR扩增产物中所述SNP分子标记或所述SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量表型。

步骤(3)中，判断油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量表型的方法如下：

若SNP分子标记PB.34365.1-621具有所述多态性的位点的基因型为TT，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量。若SNP分子标记PB.8541.2-812中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量。若SNP分子标记PB.35271.1-555中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量。

本发明的有益效果在于：本发明开发了3个与油茶种子油脂中油酸、亚油酸含量高度关联的SNP位点，可以解释10.73％～14.80％的油酸、亚油酸含量表型方差。利用上述3个标记对有性油茶群体进行了辅助选择，结果表明，PB.34365.1-621位点基因型为T/T的单株中，85.19％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值；基因型为C/C的单株中，68.42％的个体其种子油脂中油酸含量低于群体平均值，亚油酸含量高于群体平均值；基因型为C/T的单株中，58.20％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值。PB.8541.2-812位点基因型为T/T的单株中，75.00％的个体其种子油脂中油酸含量低于群体平均值，亚油酸含量高于群体平均值；基因型为C/C的单株中，59.06％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值；基因型为C/T的单株中，高油酸低亚油酸个体和低油酸高亚油酸个体数量相当，相关评价还需进一步开展。PB.35271.1-555位点基因型为G/G的单株中，91.30％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值；基因型为A/A的单株中，57.63％的个体其种子油脂中油酸含量低于群体平均值，亚油酸含量高于群体平均值；基因型为G/A的单株中，54.21％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值，可见高油酸低亚油酸个体和低油酸高亚油酸个体数量相当，相关评价还需进一步开展。3个分子标记的SNP位点均为高油酸含量基因型的单株(3个SNP位点的基因型为TT/CC/GG)，100％的个体其油酸含量全部高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值。PB.34365.1-621和PB.8541.2-812位点均为高油酸含量基因型的单株(基因型为TT/CC)，81.25％的个体其油酸含量全部高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值。PB.34365.1-621和PB.35271.1-555位点均为高油酸含量基因型的单株(基因型为TT/GG)，100％的个体其油酸含量全部高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值。PB.8541.2-812和PB.35271.1-555位点均为高油酸含量基因型的单株(基因型为CC/GG)，100％的个体其油酸含量全部高于群体平均值，亚油酸含量低于群体平均值。这表明这3个分子标记用于辅助选择，不论是单独应用还是联合应用都是切实有效的。

在油茶常规选择育种中，油脂中油酸、亚油酸含量性状的鉴定需要幼苗造林5-6年才能测定，费时费力。本发明提供的SNP分子标记中的SNP位点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响，目的性更强，工作量小，效率更高，成本低。因此，通过检测本发明的SNP分子标记的基因型，可在苗期进行鉴定和辅助筛选，大大节约生产成本和提高选择效率。在油茶育种中，可选择本发明的分子标记及检测的方法鉴定出高油酸、低亚油酸含量油茶进行育种，可提高油茶育种的选择效率，加快育种进程。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中所用的自然群体材料500份单株，均由中国林业科学研究院亚热带林业研究所木本油料育种与培育研究组收集、评价，并保存于浙江金华婺城区东方红林场种质资源圃。

实施例1油茶种子油脂中油酸、亚油酸含量分离群体的构建及性状测定

本实施例中使用普通油茶资源收集圃内500份种质资源的自然群体，其起源地涵盖中国油茶主产区的大部分，包括浙江省、湖南省、江西省、广西区、福建省、广东省等。待500个个体的果实完全成熟后(5％果实开裂)，分别采集种子，提取油脂测定脂肪酸成分及含量，其操作步骤如下：

(1)适量油茶种子用烤箱80℃烘烤过夜至恒重，剥去硬种皮。

(2)种仁用粉碎机粉碎后，用中速滤纸包好，加入适量石油醚浸泡抽提过夜。

(3)待石油醚完全挥发后，利用Agilent6890N气相色谱仪按照GB/T17376-2008、GB/T17377-2008方法测定脂肪酸成分及含量。

脂肪酸成分含量测定结果表明：自然群体种子油中油酸、亚油酸含量均呈正态分布，说明该性状具有数量性状特点，且油酸和亚油酸含量呈极显著负相关，相关系数高达-0.9510。

实施例2油茶三代转录组测序及注释分析

1、三代测序样本RNA的提取：

采集油茶“长林4号”的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取RNA，具体步骤如下：

(1)首先在1.5ml离心管中加入500μl的裂解液SL(使用前检查是否已加入β-巯基乙醇)。取0.1g样本材料加入液氮充分研磨，迅速将研磨好的样本粉末加入到离心管中，立即旋涡剧烈震荡混匀。

(2)12000rpm离心2分钟。

(3)将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm离心2分钟，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

(4)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。注意，若果上清液体积有损失，请相应调整乙醇的加量。

(5)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(6)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free的离心管中，加入70μl RDD缓冲液，轻柔混匀。

(7)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15分钟。

(8)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(10)重复步骤9。

(11)12000rpm离心2分钟，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，得到RNA溶液。

2、三代转录组测序与注释分析：

将通过纯度和浓度检测的根、嫩叶、成熟叶片、花瓣和未成熟种子五个组织样品总RNA等比例混合，利用Clontech

PCR cDNA合成试剂盒进行反转录合成单链cDNA。利用KAPA HiFi PCR试剂盒以单链cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，生成双链cDNA。生成的双链cDNA利用Blue Pippin分成0.5-2kb，2-3kb，3-6kb三个长度片段库。然后进行第二轮PCR扩增产生充足的cDNA，构建PacBio SMRTbell文库，在PacBio Sequel平台进行三代转录组测序。利用SMRTlink 5.0软件处理测序数据。测序结果过滤掉低质量数据和冗余序列后，生成CCS。根据序列是否含有5’primer，3’primer和polyA尾巴，将所有的CCS分为全长和非全长序列两大类。全长的CCS采用ICE算法在缺省参数条件下进行聚类分析产生CS。利用Arrow和LoRDEC(http://www.atgc-montpellier.fr/lordec/)软件进一步过滤CS，利用CD-HIT v4.6(Fu L,Niu B,Zhu Z,Wu S,Li W,2012.CD-HIT:accelerated for clusteringthe next-generation sequencing data.Bioinformatics 28,3150-2.)软件去除冗余序列。

利用Coding Potential Calculator(CPC)(Kong L,Zhang Y,Ye Z-Q,et al.,2007.CPC:assess the protein-coding potential of transcripts using sequencefeatures and support vector machine.Nucleic Acids Research 35,W345.)和Coding-Non-Coding Index(CNCI)(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)软件在参数缺省条件下进行转录本的蛋白编码潜能预测。未通过蛋白编码潜能检测的转录本进一步在Swiss-Prot数据库中比对，若在Swiss-Prot数据库中仍无注释，则认为该转录本为长链非编码RNA。其它的转录本进一步在NR、Swiss-Prot、COG、KEGG和GO等数据库中比对，注释转录本。

实施例3油脂高速合成期种仁转录组测序及多态位点识别

1、500个油茶无性系油脂高速合成期种仁总RNA提取：

利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN试剂盒Code No.DP441)分别提取各无性系未成熟种仁的总RNA(见实施例2)。

2、二代转录组测序：

对通过纯度和浓度检测的各样品总RNA，去除其中的核糖体RNA，以最大限度地保留所有coding RNA和ncRNA。得到的RNA随机打断成短片段，再以片断化后的RNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链；接着加入缓冲液、dNTPs(dUTP代替dTTP)、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱，经末端修复、加碱基A，加测序接头，然后通过UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二条链。用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增。最后建好的测序文库用Illumina HiSeq^TM 4000平台进行二代转录组测序。

3、多态位点识别：

为了保证数据质量，对下机后经过初步过滤得到的clean reads进行进一步更严格的过滤，得到高质量的clean reads，用于后续的信息分析。过滤的步骤如下：

(1)去除含有接头的reads；

(2)去除全部都是A碱基的reads；

(3)去除含N比例大于10％的reads；

(4)去除低质量的reads(质量值Q≤20的碱基数占整条reads的50％以上)。

采用Tophat v2.1.1(Trapnell C,Roberts A,Goff L,et al.,2012.Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seqexperiments with TopHat and Cufflinks.Nature protocols 7,562-78.)软件将每个样本的高质量的reads比对到参考转录组序列上(见实施例2)。剔除没有比对上的序列，其余序列利用bcftools v1.9软件(http://www.htslib.org/doc/bcftools.html)识别SNP位点。识别的SNP位点经过严格过滤，获得高质量的SNPs数据。过滤标准如下：

(1)位点上只有2个等位基因；

(2)基因型缺失率≤20％；

(3)最小等位基因频率(MAF)≥5％；

(4)SNP质量值≥100；

(5)纯合子基因型的样本数大于10个；

(6)杂合基因型样本率≤70％。

实施例4与油茶种子油脂中油酸、亚油酸含量相关的SNP位点的筛选

(1)利用GCTA v1.25.2(Jian Y,S Hong L,Goddard ME,Visscher PM,2011.GCTA:a tool for genome-wide complex trait analysis.American Journal of HumanGenetics 88,76-82.)软件对油茶自然群体进行主成分分析(PCA)，利用前10个主成分(PC)作为固定效应用于后续的关联分析(表2)。

表2自然群体部分个体的前10个PC值

(2)将所有样本的SNPs位点数据、前10个PC值数据、油酸含量、亚油酸含量等表型数据(见实施例1)及Kinship矩阵数据分别导入TASSEL5.0软件中，采用MLM法分析SNPs与油酸、亚油酸含量性状的连锁不平衡性，筛选与油脂中油酸、亚油酸含量显著关联的分子标记，经多重检验校正，检测到了三个跟油酸、亚油酸含量存在极显著关联的位点PB.34365.1-621、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555(表1)。每个位点有三种基因型，分别为C/C、C/T或T/T；C/C、C/T或T/T；G/G、G/A或A/A。三个标记位点均引起非同义突变，PB.34365.1-621位点对油酸含量和亚油酸含量变异的贡献率分别为12.94％和12.69％；PB.8541.2-812位点对油酸含量和亚油酸含量变异的贡献率分别为12.56％和10.73％；PB.35271.1-555位点对油酸含量和亚油酸含量变异的贡献率分别为12.73％和14.80％(表1)。

实施例5分子标记PB.34365.1-621、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555在以油酸、亚油酸含量为育种目标的油茶育种中的应用

(1)选择一个油茶杂交F1代家系群体(母本为‘长林53号’，父本为‘长林40号’，均为国家审定良种，良种号分别为“国S-SC-CO-012-2008”和“国S-SC-CO-011-2008”)为材料，采集嫩叶提取总RNA(见实施例2)。以RNA为模板，采用Clontech cDNA合成试剂盒反转录生成单链cDNA，并稀释100倍，作为工作液。

(2)分别利用P1-P2、P3-P4、P5-P6引物对单链cDNA工作液进行PCR扩增，引物序列如下：

P1：SEQ ID NO.4：5’-GACATAGACACAAATCTAGA-3’；

P2：SEQ ID NO.5：5’-CCAAACGGGGCCTTACATCAG-3’；P3：SEQ ID NO.6：5’-GGTCTGCAAAACCTTAGAAA-3’；

P4：SEQ ID NO.7：5’-TACAAATTAGTTCTCAAAATC-3’；

P5：SEQ ID NO.8：5’-ATCCGAGGAGATACACTGGC-3’；

P6：SEQ ID NO.9：5’-CCATTGTTACCATTCCATTC-3’。

PCR扩增的反应体系如表3所示：

表3 PCR反应体系

PCR扩增程序为：

(3)PCR扩增产物进行凝胶检测和纯化回收并测序、基因分型。凝胶检测和纯化回收按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AxyGEN,Code No.AP-GX-50)说明书进行，其流程如下：

①配制1.2％的琼脂糖凝胶，将50μl扩增产物全部上样，电泳电压为5V/cm，电泳约20分钟至上样缓冲液中二甲苯青达到距离凝胶前端1cm处时停止电泳。

②在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(例如100mg＝100μl体积)。

③加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，每2～3分钟间断混合，直至凝胶块完全熔化。

④加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

⑤将上述溶液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑥加入500μl Buffer W1，12000rpm离心30秒，弃滤液。

⑦加入700μl Buffer W2，12000rpm离心30秒，弃滤液。以同样的方法再用700μlBuffer W2洗涤一次，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑧将制备管放回离心管中，12000rpm离心1分钟。

⑨将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25～30μl去离子水，室温静置1分钟。12000rpm离心1分钟洗脱DNA。

⑩凝胶回收DNA，以对应的扩增引物为测序引物，采用一代测序测定扩增产物核苷酸序列，用Chromas软件判读测序峰图上每个SNP位点的基因型。

(4)分别鉴定所有个体的PB.34365.1-621、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555位点的基因型。若PB.34365.1-621位点的基因型为T/T，则油茶个体为高油酸低亚油酸含量油茶；若基因型为C/C，则油茶个体为低油酸高亚油酸含量油茶；若基因型为C/T，待鉴定油茶的为候选高油酸低亚油酸含量。若PB.8541.2-812标记的基因型为C/C，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量，若基因型为T/T，待鉴定油茶为低油酸高亚油酸含量，若基因型为C/T，待鉴定油茶的油酸亚油酸含量还需要进一步鉴定。若PB.35271.1-555标记的基因型为G/G，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量，若基因型为A/A，待鉴定油茶为低油酸高亚油酸含量，若基因型为G/A，待鉴定油茶的油酸亚油酸含量还需要进一步鉴定。若PB.34365.1-621和PB.35271.1-555位点均为高油酸含量基因型，或PB.8541.2-812和PB.35271.1-555位点均为高油酸含量基因型，或上述3个分子标记的SNP位点均为高油酸含量基因型(3个SNP位点的基因型为TT/CC/GG)，则待鉴定油茶确认为高油酸低亚油酸含量。

(5)采集所有F1代个体完全成熟种子，测定其种子油脂中油酸、亚油酸含量(见实施例1)。结果表明(表4)，PB.34365.1-621的SNP位点基因型为T/T的单株中，85.19％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量低于群体平均值(8.8228％)；基因型为C/C的单株中，68.42％的个体其种子油脂中油酸含量低于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量高于群体平均值(8.8228％)；基因型为C/T的单株中，58.20％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量低于群体平均值(8.8228％)。PB.8541.2-812的SNP位点基因型为T/T的单株中，75.00％的个体其种子油脂中油酸含量低于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量高于群体平均值(8.8228％)；基因型为C/C的单株中，59.06％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量低于群体平均值(8.8228％)；基因型为C/T的单株中，高油酸低亚油酸个体和低油酸高亚油酸个体数量相当，相关评价还需进一步开展。PB.35271.1-555的SNP位点基因型为G/G的单株中，91.30％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量低于群体平均值(8.8228％)；基因型为A/A的单株中，57.63％的个体其种子油脂中油酸含量低于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量高于群体平均值(8.8228％)；基因型为G/A的单株中，

54.21％的个体其种子油脂中油酸含量高于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量低于群体平均值(8.8228％)，可见高油酸低亚油酸个体和低油酸高亚油酸个体数量相当，相关评价还需进一步开展。PB.34365.1-621、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555三个分子标记的SNP位点均为高油酸含量基因型的单株(三个位点的基因型为TT/CC/GG)，100％的个体其油酸含量全部高于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量低于群体平均值(8.8228％)。当PB.34365.1-621和PB.35271.1-555位点均为高油酸含量基因型时(基因型为TT/GG)，或PB.8541.2-812和PB.35271.1-555位点均为高油酸含量基因型时(基因型为CC/GG)，100％的个体其油酸含量高于群体平均值(79.9627％)，亚油酸含量低于群体平均值(8.8228％)。这表明PB.34365.1-621、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555这三个分子标记用于辅助选择，不论是单独运用，两个标记联合运用还是三个分子标记联合运用，都是切实有效的，特别是对于筛选高油酸、低亚油酸含量的油茶个体，可用于早期鉴别或辅助鉴别，可大大节约生产成本，提高选择效率，加快油茶高油育种进程。

表4 F1单株的种子油脂中油酸、亚油酸含量及三个SNP位点基因型数据

注：表中“NA”表示基因型缺失。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120> 与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP201112316.7

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1989

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacatagaca caaatctaga gtgagaaatg caaaatccaa aacagcagaa gaggagggca 60

ggcattagat tagagagaga gagagagaga gaatggggaa ggggccattc tgttttggcc 120

ggaagatgag ccgtcgccgc cctaagaagt ctagacagac ggcggcgacg gcgcctccgt 180

cgccgaataa taagtcgatg tcggcgatgg tggctgggtc gtcgagcaag acgaagaaga 240

aggcaggagg ggcgaggctg tggatgaggt tggataagtt tgggcaatcg gagctcatcg 300

agtgcgacag gagcacaatc atcaagcgcg tctctattcc tgttagggat ttgaggatcc 360

ttggcccttt cttctctcac tcctccaata tccttgctag ggagaaagct atggttgtca 420

acttagagtt tataaaggct atagttactg ctgaagaagt gctgttgctt gatcctctct 480

gccaggaggt tcttccgttt gtggatcagc tgcggcaaca acttcctcat aaaagcgtgt 540

ccaaaagtca aggagggggt caaatggatg tacaagataa tgaaatgcaa ttatcatctg 600

ggggacaatg gttacccgtt cctgaagccg ttgaaggttt gcagtgtgac ctcccatttg 660

agtttcaagt tctcgagatt gcattgaagg ttgtctgtac atatttggac tctagtgtag 720

cagaccttga gagagatgct taccctgtat tggatgaact ggcaaggaat gttagcacca 780

agaatcttga gcacgtgagg agtttgaaaa gcaatctgac ccgtttgctt gcacgggtac 840

aaaaggtgcg tgatgaaatt gaacatcttt tagatgacaa tgaagacatg gcacatttat 900

acttaacaag gaaatggatt cagagtcagc aatttgaggc ttatttagca ggtacagctt 960

ctaacagcat tgtcagtgct ggacatcaac ttcgccgtct tagttctaac aggagtggaa 1020

gtttattgtt gagcaaccat ttgaatgacc atgatgtgga agatctagaa atgttgctcg 1080

aggcttattt catgcagctg gatggtaccc gtgacaagat actatctgta agtgttatta 1140

ttattgacaa tagcatgagc ataatccaaa ataaactaat tacattaaac catcttatga 1200

cattgttcct acattgaatt ttcactgtac attgtatata ttgaaggatg gcaagctaat 1260

ttcatagaat taaggttaag cattttgtga agttggatta ttcaacccaa ccaaccacct 1320

atgtgactct aggaaacaca actttggttg attgcagaaa tattgcagct gctgtacgat 1380

cttctgagtc aatttctata gagacaaaag tcaatagctc ctcacaaatt tgtcctttct 1440

atctgtagag cactttccat ggaacggttc ttgatgctct gtggattgta gaaacaaatg 1500

ttcccacccc accaccatcc caccatcact aatacaacca cttgtacaat tgtttcaagg 1560

acgcaaccaa acataggaaa atgctatttg tgaaaaacat tttccgaaaa aaattctgcg 1620

ggaattattt tttatcaaaa caaacgtaat gctagtttca tgcaaatgag aagtttgaag 1680

ttcagtatta atctttcaag tttttgctag gcaagacaac gtggacactt gagcctctaa 1740

tattgaggtc atgaaattaa ttggatccac ctgccttcaa gaccattggt aagatagatc 1800

ttaattgggc aatgacagtt ggtagaaaga aatcaattga gtcccactta gcaacgttat 1860

gaaggctact tcattgagat tttcattctg cctctccatt cttgccccat ccagacatag 1920

tctgtgtatt tagtttcata ttttgagatg gaagaatgtc gtttaaagct gatgtaaggc 1980

cccgtttgg 1989

<210> 2

<211> 1370

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtctgcaaa accttagaaa acagaaagag agagatacaa aacaacacag agagagacag 60

gagcaatcgc agacgataat ggccgacgaa gccaaggcca aaggcaacgc cgccttctcc 120

gccggaaact acgccgacgc gatccgccac ttcacggtgg ctatcaatct cgctccggac 180

aaccacgtcc tatattccaa ccgatccgcc gcctacgcct ccctccacca gtactccgac 240

gccttgtccg acgccgaaaa gactgtccag ctcaagcctg actggtccaa aggctactct 300

cgactcggcg cggctcacct tggtctccac cactacgacg acgccgtttc atcctacaga 360

aaaggtctcg aaatcgaccc taacaacgag gctctcaagt ccggcctcgc cgacgctcag 420

tccgccgccg caagatcgcg cgctccgccg ccgtcttcct cctccgccgc cgccgccgcg 480

tctccgtttg gggatacgtt tactgggcct gagatgtggg ccaagctcac cgccgatccg 540

agcacgagag tgtttctgca acagcctgat ttcgtgaaaa tgatgcagga cattcagaga 600

aaccctaaca atttgaatat gtatttgaag gatcagagag ttatgcaagc tcttggtgtt 660

ttgttgactg tgaagattat gactccgaat tcggctgaag atatggactt tccagatgcg 720

ccgccgccgc cgtcggagag gaagagacct gctgaggcgg agccgccgaa ggagaaggag 780

ccggaaccgg agcctgagcc tatggaggta gtggaggaga gggaatctag agagaggaag 840

gctcaggcgc tgaaggagaa ggaagctggg aatgctgctt acaagaagaa ggatttcgag 900

aatgcaattc agcattacac gaaggcgatt gaattgtatg atgaagatat ttcttttctc 960

acgaaccgag cagccgtgta tttggagatg ggaaaggccg atagcatttt ttttggatgt 1020

attttacact ttagtgtgaa ttagattaac cattttgcaa aaagtcgatg tttttataaa 1080

tgggcaggcc tatagcattt aacttgtttg atttttaggg tttggtgaat gaggaagaca 1140

tgtatagttc tgaatttagt atatagtctc gtagatttat atagtatgaa gctgatgttc 1200

tattttaagc atttactacg ttacatggac tcaaaagtac aagtatcggg tgcacctaaa 1260

cttagtatat tagatctgta tcctaaagtt ggatatggat agggagatgc atactgatca 1320

cttatatatg gtatagatta tataaaactg attttgagaa ctaatttgta 1370

<210> 3

<211> 2192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atccgaggag atacactggc cttaactgat catatatcaa tagaaatgaa tgagctcaat 60

ctcattcgat gccaaagaat acctagacgt ccaggtgctg attggcgtga ccttcctgat 120

gaaaagcatt ctaggtgtgc aacccagatg tgcatcccgt ctcattaccg tgtgcaaccc 180

aggtgtgcat cccgttgaag cattccatcc acgaagctgc atcccgttga agcattccat 240

cagattttca atcctcatta gaccatgaac ggggacgagg gtgtgggcga ggacgaggtc 300

aaggtcgtgg tcgaggtcgt gatccaattt cggtagaata tgatattccc agtgccagtc 360

aaagtcgggg ccgaagccaa agacgagttg aaggttatga tatgcctgac attactgtgg 420

aggatacctc cttacctgat tctcctcctg tccagaaaga gtaccttact catgcttttc 480

caggtggact gactgatccg tcaatactgc ggagtttcaa tagtcatgtg gctgcagcta 540

tttggcacgg ggaggaatga gggcccctaa agtgtcataa tcactcttcc aagatccttg 600

catggccatg gtggttagta gagaacaaca ccagattcaa agccattatt gagcagtctg 660

ggctgtcaca gttagctcgt tgcacttatc agttcgtcaa caagcttcta atctccagtt 720

ttgttgagag atggcaacct gagacgaaca catttcacat gacagttggt gagatgaccg 780

tgaccctaga tgatgttggc actattcttg gccttcccat tgtaggcaaa tcagtcagca 840

taccagatgt gacagatcat catggagtta cattactcgt ttatggcttg gggattactg 900

aacgtgcagc acatgaagag gtttcttctg ctggtggcaa ttcagtcagg cttgaatggt 960

tgtgaagtca gtttgctggt gtgacagatt cagaccccga ggaggctata cagtgcgctg 1020

ctagagctta tttgttgttt ctgttgggat gtacactctt cagtgacaag agtggcggca 1080

gggttcccgt tgtttacctt ggcttattga tggatttggg atccatacat acttacgcct 1140

gaggtgctgc tgcattagca tttttataca gacagttggg gtatgctagc cggtctgggg 1200

ttaggcagat gggtggttat atgacacttt tggacgcgtg gatttatgag cacttccaag 1260

cattccgacc tcatcagaac atgggctaca atgaaaacat gccacacgtg taccattggg 1320

catctaggag agaggcgggt tcctccattg agcatttgaa atcttttcga gccgagcttg 1380

acagtttggt agctactgat ctgcagagac cggcatccat gtaacccggt tacgttctac 1440

catggatgct taaagtgctt agacgttgtt gaaccctatc atccagatag agttttgagg 1500

cagtttggca ggattcaaac catcccagat gcaccgctag ctcccagtcg tggtgcgtga 1560

ggcaacatat ctgcacgata tacagtcatg tatagatact tggataggat ctgggaggct 1620

tgggataacc acgtgttatc tgagcaacgg aggagcacac tagttcgtca gccttggcaa 1680

tgtgtactgg gttacatgga ttggtataag aatatcatgc acctatatgt cgagcacact 1740

gatgaaccgc gtgtccatga ccatcaagat ttcagcgaac atgcagatcg tattgcacat 1800

gcactgcaga tttcacatct tattattgac gctggttatc aggaggggat ttgacatcct 1860

tatcgacttt accaggctat cgagagtatg acgcatgttc ttgaaggtca gcacattgac 1920

gaagctggac ctagttctgc tggaggtcgc tttccatctt cgacattgac atacagtcgt 1980

aggcctaggc gtaggcatac agctgattcg tgacatttat tttgttacat gttattttgt 2040

tagttcatga attttttggt cagtttttgt aagatgacat tgttgtaatg gtaacaatgg 2100

ttaatatttt cttattacaa tggaatggca acaatggtat tgtaatgaca ttgtaatgac 2160

attttattat tagaatggaa tggtaacaat gg 2192

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacatagaca caaatctaga 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaaacgggg ccttacatca g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtctgcaaa accttagaaa 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacaaattag ttctcaaaat c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atccgaggag atacactggc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccattgttac cattccattc 20

Claims

1.与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为PB.8541.2-812；

SNP分子标记PB.8541.2-812的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中第812位的多态性为T/C。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记PB.8541.2-812中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，对应高油酸低亚油酸含量，基因型为TT，对应低油酸高亚油酸含量。

3.与油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记组合，其特征在于，所述SNP分子标记组合为PB.34365.1-621、PB.8541.2-812和PB.35271.1-555中的至少两个；

其中，SNP分子标记PB.34365.1-621的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第621位的多态性为C/T；SNP分子标记PB.8541.2-812的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中第812位的多态性为T/C；SNP分子标记PB.35271.1-555的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中第555位的多态性为G/A。

4.用于扩增权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合的引物。

5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于，包括SEQ ID NO.6-7所示引物，或者选自SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7和SEQ ID NO.8-9所示引物中的至少两对。

6.含有权利要求4或5所述的引物的试剂或试剂盒。

7.权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合或权利要求4或5所述的引物或权利要求6所述的试剂或试剂盒的以下任一应用：

（1）在鉴定油茶种子油脂中油酸和/或亚油酸含量表型中的应用；

（2）在油茶种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用，所述种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种的性状为种子油脂中的油酸和/或亚油酸含量；

（3）在油茶种子油脂中油酸和/或亚油酸含量早期预测中的应用；

（4）在筛选高油酸低亚油酸含量油茶中的应用；

（5）在筛选低油酸高亚油酸含量油茶中的应用。

8.鉴定油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量表型的方法，其特征在于，包括：

（1）提取待鉴定油茶的总RNA，反转录合成cDNA；

（2）以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7、SEQ ID NO.8-9所示引物中的一对或多对进行PCR扩增；

（3）分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定油茶种子油脂中的油酸和亚油酸含量表型。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94~95℃，3~5min；94~95℃，15~30s，65~69℃，40~60s， 38~45个循环；67~70℃，3~6 min。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述判断待鉴定油茶种子油脂中的油酸和亚油酸含量表型的方法如下：

若SNP分子标记PB.34365.1-621具有所述多态性的位点的基因型为TT，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量，基因型为CC，则待鉴定油茶为低油酸高亚油酸含量，基因型为CT，则待鉴定油茶为候选高油酸低亚油酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.8541.2-812中，具有所述多态性的位点的基因型为CC，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量，基因型为TT，则待鉴定油茶为低油酸高亚油酸含量；和/或，

若SNP分子标记PB.35271.1-555中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定油茶为高油酸低亚油酸含量，基因型为AA，则待鉴定油茶为低油酸高亚油酸含量。