CN112063746A

CN112063746A - 位于花生fad2a基因启动子区与花生油酸和亚油酸含量相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112063746A
Application number: CN202011034365.8A
Authority: CN
Inventors: 周小静; 姜慧芳; 黄莉; 罗怀勇; 刘念; 陈伟刚
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2040-09-27
Also published as: CN112063746B

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及位于花生FAD2A基因启动子区与花生油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记及其应用。本发明的分子标记SNP_C‑E位于花生FAD2A基因启动子区，含有如SEQ ID NO.1所示序列第13位的多态性为G/A的核苷酸序列。当该处碱基为G时，其所处位置为顺式调控元件CAAT(‑)，当该处碱基为A时，其处于类似增强子元件YACT(+)中。SNP_C‑E从G变为A时，FAD2A的基因表达量会显著提高。且当该处碱基为G时，对应花生油酸含量低，亚油酸含量高；为A时，对应花生油酸含量高，亚油酸含量低。利用这个SNP分子标记可进行花生油酸、亚油酸含量高低鉴定，提高选择效率。

Description

位于花生FAD2A基因启动子区与花生油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及位于花生FAD2A基因启动子区与花生油酸和亚油酸含量相关的一个新的SNP分子标记及其应用。

背景技术

花生是重要的油料和经济作物。油脂的稳定性是花生油的重要品质指标之一，其决定因素是油脂中的油酸和亚油酸比值(油亚比)。油酸、亚油酸是大多数植物油脂中的主要脂肪酸，花生及花生油中两者之和高达80％以上，并且呈现显著的负相关。油酸可以降低对人体健康有害的低密度胆固醇，同时不破坏对人体有益的高密度胆固醇,而且油酸的抗氧化性强，油酸含量升高可显著提升花生产品的货架寿命。亦油酸含量升高可增强花生制品的耐贮性，延长货架寿命。提高油脂中的油酸含量、降低亚油酸含量，培育高油酸的花生新品种是目前花生脂肪酸改良的最重要目标之一。

目前主要认为花生油酸性状是受两对主效基因控制，适合通过回交改良油酸性状。目前常用的花生高油酸性状的分子标记是根据突变体材料AhFAD2A、AhFAD2B的ORF区的SNP突变位点开发的功能标记。花生中这两个与高油酸性状相关的SNP突变，一个是FAD2A基因起始密码子后448bp处G:C—A:T的突变(D150N氨基酸的变异)，另一个是FAD2B基因起始密码子后442bp处A插入的突变，使终止密码子提前出现。后来又发现Mycogen-Flavo(MF)和M2-225这两个高油酸突变体，其在FAD2B基因中是微型反向重复转座元件(MITE)插入导致基因功能改变。美国高油酸品种M2—225是利用化学试剂硫酸二乙酯诱变而选育出的新品种，其AhFAD2B基因的起始密码子后997bp位由MITE插入。

利用高油酸分子标记进行辅助选择是提高花生育种效率，选育高油酸花生品种行之有效的方法，因此提供多种选择的分子标记用于辅助选择高油酸花生品种非常有意义。

发明内容

本发明通过多环境关联分析，旨在鉴定获得与品质性状相关位点及有效分子标记，用于花生品质性状的标记辅助选择。

具体地，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种位于花生FAD2A基因启动子区与花生油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SNP_C-E，位于花生FAD2A基因启动子区，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第13位的多态性为G/A的核苷酸序列。

该SNP分子标记SNP_C-E位于FAD2A基因启动子区,当该处碱基为G时，其所处位置为一个顺式调控元件CAAT(-)，当该处碱基为A时，其处于类似增强子元件YACT(+)中。即碱基从G变为A时，其所处位置由顺式调控元件CAAT(-)，变为类似增强子元件YACT(+)。

本发明的分子标记SNP_C-E位于花生FAD2A基因转录起始位置ATG上游713bp处，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应于花生油酸含量数值低，亚油酸含量数值高，基因型为AA，对应于花生油酸含量数值高，亚油酸含量数值低。

当分子标记SNP_C-E具有所述多态性的位点的基因型为GG时，FAD2A基因表达量低，当基因型为AA时，FAD2A基因表达量高。

本发明与花生油酸、亚油酸相关位点是通过以下方法获得的：

(1)两年两点考察250份花生资源油酸、亚油酸性状，获得多环境下表型数据；

(2)采用CTAB法提取250份花生资源DNA，并对DNA样品进行检测。利用TruSeqLibrary Construction Kit构建GBS文库，并进行文库库检。文库库检合格后通过IlluminaHiSeq 2500PE150进行测序；

(3)对下机得到的Raw data进行质控得到Clean data，将Clean data通过BWA软件比对到参考基因组上(以二倍体A.duranensis(AA)和A.ipaensis(BB)为参考基因组，PeanutBase:http://peanutbase.org)，根据比对结果，采用GATK软件进行群体SNP检测。对检测到的SNPs进行过滤和推断，获得高质量SNP标记，获得基因型数据；

(4)利用获得的高质量SNP标记，运用STRUCTURE软件进行群体结构分析，利用TASSEL软件进行LD分析；

(5)把基因型数据和四个环境的性状考察数据，利用GEMMA软件，采用混合线性模型进行关联分析，在多个环境下检测到同时控制油酸和亚油酸的三个主效显著关联位点A09-113515424，A09-114106219和A09-115528661；

(6)在三个关联位点两侧1.3Mb区域内鉴定候选基因，并调查序列变异与表型变异的相关性，发现已知调控油酸、亚油酸基因FAD2A位于关联区域内，在A09-114690064FAD2A启动子区存在SNP，命名为SNP_C-E。通过PCR测序确定SNP_C-E在FAD2A的转录起始位置上游713bp处，且该SNP_C-E从G变为A时，所处位置由顺式调控元件CAAT(-)变为类似增强子元件YACT(+)。

(7)在本自然群体中不同环境下，该变异与油酸、亚油酸含量高低具有显著相关性。

(8)qRT-PCR表明该变异使FAD2A基因的表达量呈几十倍的差异变化。

利用上述技术措施，最终获得了位于上述FAD2A启动子区的一个新的分子标记。

第二方面，本发明提供用于扩增上述SNP分子标记的引物。

本发明的引物包括如SEQ ID NO.2-3所示的序列。

第三方面，本发明提供上述SNP分子标记或引物的以下任一应用：

(1)在鉴定花生油酸、亚油酸含量性状表型中的应用；

(2)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；

(3)在花生油酸、亚油酸含量性状早期预测中的应用；

(4)在筛选或创制花生油酸、亚油酸含量性状不同的花生中的应用；

(5)在花生油酸、亚油酸含量基因分型中的应用；

(6)在鉴定花生FAD2A基因表达量中的应用。

本发明包括利用本发明提供的位点、SNP标记和引物应用于花生的品质育种，或是用于分子标记辅助选择。

本发明的分子标记可在花生油酸、亚油酸含量高低筛选中、选育花生不同油酸、亚油酸含量相关资源和在创制花生不同油酸、亚油酸含量相关材料中、花生油酸、亚油酸含量高低选择和育种中应用。

第四方面，本发明提供鉴定花生油酸、亚油酸含量高低的方法，其包括：

(1)提取待鉴定花生的DNA；

(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.2(上游引物)、SEQ ID NO.3(下游引物)所示引物进行PCR扩增；测序引物与SEQ ID NO.3相同；

(3)分析PCR扩增产物中上述SNP分子标记的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生油酸、亚油酸含量高低。

本发明中，步骤(3)中所述判断待鉴定花生油酸、亚油酸含量高低的方法如下：

若分子标记SNP_C-E具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定花生的油酸含量数值低，亚油酸含量数值高，若基因型为AA，则待鉴定花生的油酸含量数值高，亚油酸含量数值低。

本发明检测SNP标记时，设计SSR引物，使扩增的片段包含该碱基变化位点，然后测序。针对该位点设计引物为AhFAD2A-F:CATTGCACAAGGCAACCGAA(SEQ ID NO.2)，AhFAD2A-R:CGAACGGCTATGAAACCAGC(SEQ ID NO.3)。进行PCR扩增，扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行测序检测变异位点。测序引物为AhFAD2A-R:CGAACGGCTATGAAACCAGC(SEQ IDNO.3)。根据测序结果判定待测花生材料花生油酸、亚油酸含量的高低。利用该位点以及基于该位点的分子标记对花生材料进行检测，可准确快速筛选高油酸单株，加快花生育种进程。

具体判断时，若该位点为碱基G，则判定待测花生材料的油酸含量数值低，亚油酸含量数值高，为低油酸材料。若该位点为碱基A，则判定待测花生材料的油酸含量数值高，亚油酸含量数值低，为高油酸材料。

第五方面，本发明提供鉴定花生FAD2A基因表达量高低的方法，其包括：

(1)提取待鉴定花生的DNA；

(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示引物进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中上述SNP分子标记的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生FAD2A基因表达量高低。

本发明中，步骤(3)中所述判断待鉴定花生FAD2A基因表达量高低的方法如下：

若SNP分子标记SNP_C-E具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定花生的FAD2A基因表达量低；若基因型为AA，则待鉴定花生的FAD2A基因表达量高。

本发明的有益效果在于：

之前运用较广泛的是FAD2A基因起始密码子后448bp处G:C—A:T的变异，该变异对基因表达量变化不明显，但是酶活有显著变化；本发明的位于启动子区调控元件上的变异对基因的表达呈几十倍的差异。另外，油酸含量的化学测定成本较高，高世代检测样本量大。本发明开发了针对FAD2A(ATG前713bp处)变异位点的引物和PCR检测方法，该方法简单，成本低，结果稳定。本发明可应用于早期的分离世代高油酸基因型鉴定，为分子标记辅助选择高油酸花生品种提供了新的技术手段，可显著显著降低育种成本，减少工作量，提高高油酸选育的效率。

附图说明

图1为250个花生材料自然群体中油酸、亚油酸在四个环境下均值的频率分布图；其中，纵坐标代表频率，横坐标中C18：1代表油酸、C18：2代表亚油酸；

图2为2015NC环境下油酸、亚油酸关联分析的曼哈顿图和QQ图；其中，上图为2015NC环境下油酸关联分析的曼哈顿图(左上)和QQ图(右上)；下图为2015NC环境下亚油酸关联分析的曼哈顿图(左下)和QQ图(右下)；曼哈顿图中横坐标A01-B10分别表示花生的20条染色体，纵坐标表示标记与性状关联的P值；QQ图中横坐标表示P值的期望值，纵坐标表示P值的观测值；

图3为四个环境下该自然群体中，FAD2A启动子区SNP_C-E等位位点对油酸、亚油酸的效应比较图；上图C18：1代表油酸；下图C18：2代表亚油酸；图中，从左到右四个环境依次为2015NC、2015WH、2016NC、2016WH。

图4为包含SNP_C-E变异位点的扩增片段测序峰图；其中，上图表示当该处碱基为G时，其所处位置为一个顺式调控元件CAAT(-)，下图表示当该处碱基为A时，其处于类似增强子元件YACT(+)中；

图5为35个株系中FAD2A基因中SNP_C-E为GG的株系和AA的株系的油酸、亚油酸含量表型数值比较图；其中，C18：1代表油酸、C18：2代表亚油酸。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法和实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:aLaboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1自然群体(250份花生材料)的性状考察

本实施例中，250份花生材料2015年和2016年连续两年种植在四川南充和湖北武汉的实验基地。利用安捷伦7890B气相色谱仪分析样品的脂肪酸含量(表1)。在四个环境下(四个环境分别为：2015年武汉基地(2015WH)、2015年南充基地(2015NC)、2016年武汉基地(2016WH)、2016年南充基地(2016NC))的表型调察均值的分布频率参见图1。

表1四个环境下油酸、亚油酸含量考察

实施例2文库构建及测序

用CTAB法提取250份材料的叶片DNA。利用琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性，Nanodrop检测DNA的纯度(OD260/280比值)，Qubit对DNA浓度进行精确定量。检验合格的DNA样品采用TruSeq Library Construction Kit，利用MseI、HaeIII和NlaIII限制性内切酶进行GBS建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nM)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina Hiseq PE150测序。

实施例3 SNP标记的开发

对下机得到的Raw data进行质控得到Clean data。将Clean data比对到参考基因组上，有效的高质量测序数据通过BWA软件比对到参考基因组(以二倍体A.duranensis(AA)和A.ipaensis(BB)为参考基因组，PeanutBase:http://peanutbase.org)。采用GATK软件进行群体SNP的检测。利用贝叶斯模型检测群体中的多态性位点，对检测到的3,070,141个SNPs通过保留双等位基因、miss≤0.83、maf>0.05条件进行过滤，再经beagle推断后，再经GP值>0.6以及miss<0.2的过滤后，获得高质量的105,814个SNPs。

实施例4群体结构和连锁不平衡(LD)分析

利用高质量的105,814个SNPs，通过STRUCTURE软件进行群体结构分析，该群体分为G1、G2群以及一个混合群(Mixed)。通过群体结构分析，在后期的关联分析中可降低假阳性。通过TASSEL软件计算R²，分析本群体LD衰减距离为1.3Mb。

实施例5关联分析

把所有样本的基因型数据和两年两点的性状考察数据，利用GEMMA软件，采用混合线性模型进行关联分析。阈值设置为-log₁₀(0.05/105814)＝6.33，P<4.73×10^-7的SNP为显著关联SNP。以2015NC环境下油酸、亚油酸关联分析为例，其曼哈顿图和QQ图结果参见图2。在多个环境下检测到控制油酸和亚油酸的三个主效显著关联位点A09-113515424、A09-114106219和A09-115528661(见表2)。

表2主效位点在多环境下与油酸、亚油酸性状的关联性

根据本群体LD衰减距离,在三个同时控制油酸和亚油酸的显著关联位点A09-113515424、A09-114106219和A09-115528661关联区间内，鉴定到已知调控油酸、亚油酸含量基因Aradu.G1YNF，该基因编码脂肪酸去饱和酶2。发现SNP A09-114690064在Aradu.G1YNF启动子区。通过PCR产物测序确定该SNP在Aradu.G1YNF的同源四倍体Arahy.42CZAS(FAD2A)的转录起始位置ATG前713bp处，其碱基由G变为A。根据基因型数据分析发现在不同环境下该SNP位点GG基因型比AA基因型株系的油酸含量低、亚油酸含量高(图3)，表明该变异与油酸、亚油酸含量相关。

实施例6 SNP变异对基因表达量的影响

选取基因型为GG和AA的花生材料各三个(见表3)，取这些材料花授粉后40天的种子，利用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，经反转录，进行qRT–PCR[SsoFast EvaGreensupermix(Bio-Rad)]，qRT–PCR的引物见SEQ ID NO.4(上游引物)和SEQ ID NO.5(下游引物)。ACTIN的上游引物序列为TAAGAACAATGTTGCCATACAGA(SEQ ID NO.6),下游引物序列为GTTGCCTTGGATTATGAGC(SEQ ID NO.7)。FAD2A在AA基因型中比GG基因型的相对表达水平显著提高，参见表3。

表3 SNP变异对基因表达量的影响比较

实施例7 SNP标记在花生高油酸育种中的应用

供试材料：22个油酸含量低、亚油酸含量高的株系和13个油酸含量高、亚油酸含量低的株系(表4)。提取各材料的DNA。

基因型鉴定：以位于花生FAD2A转录起始位置前713bp为靶标，检测该SNP标记SNP_C-E。利用合成的SSR引物，扩增各材料。分子标记SNP_C-E能够准确区分花生中油酸高低材料，对高油酸材料进行片段扩增、测序后在该处碱基为A,对低油酸材料进行片段扩增、测序后在该处碱基为G。包含该变异位点的扩增片段测序峰图见图4。在该位点为GG等位基因的株系和AA等位基因的株系的油酸、亚油酸的表型值数据见表4，表型数值比较图见图5。

表4供试材料油酸、亚油酸含量表型值数据

PCR反应体系为10μL，包括Trans 2×EcoTaq PCR SuperMix(+dye)5μl、基因组DNA模板10～20ng，0.4μM上游引物(SEQ ID NO.2),0.4μM下游引物(SEQ ID NO.3)。

PCR反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s、57℃复性10s、68℃延伸2min，共40个循环；最后68℃延伸5min，4℃保温。

上述PCR扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 位于花生FAD2A基因启动子区与花生油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP201115978.4

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctagcataa ttgcttaagt taaactggaa ctatttattt tacattatgc atagtatgta 60

aaattttttt tcagttactt ttctatgtta ttttcttctc tcaatttcac tagtaaatat 120

ttaaaaattt tatttttcta ttttgtttat cttaactttt ggatattgta tttatttatc 180

tatgaataaa atacaactat tatgttaaaa aaaaaaaaaa aacttattag ggttgatgct 240

aaattggtgg gttagatcgt cattgatcat tgatcacacc aactaaaata ccttaacttg 300

ttgtaactcg aaatatagca cactgttttc cctataaaaa cccaatgtga gtgagacaac 360

aacttaacgc attacataaa accttaaacg tggctgcgag attcatcata ggagaagcac 420

tcacttctct tctctctgtt ggaattgctt tcacggtttg cactatgttc ctttaattat 480

aaaacattct gcttctgctc attgtattct tctatataat tcatgcaaat tgctctaaaa 540

aattgaactc gtgttgctgg tttcttcttg tgtccatttc tataacatca acatgcatgc 600

ttggataact ttttattttg atcttttata ataaccttga atttttctga attttgaagc 660

aaaggggtga ggttttcttc catgttattt ctactggatt tcagattctg cattaaacaa 720

tatcaatgag aatgctgaca aatt 744

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattgcacaa ggcaaccgaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaacggcta tgaaaccagc 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgttgtctat gatctcttag tggc 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggtatggaa gcttgtggaa a 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taagaacaat gttgccatac aga 23

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttgccttgg attatgagc 19

Claims

1.与花生油酸和亚油酸含量相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为SNP_C-E，位于花生FAD2A基因启动子区，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第13位的多态性为G/A的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，SNP分子标记SNP_C-E位于花生FAD2A基因转录起始位置ATG上游713bp处，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应于花生油酸含量数值低，亚油酸含量数值高，基因型为AA，对应于花生油酸含量数值高，亚油酸含量数值低。

3.用于扩增权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物。

4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.2-3所示的引物。

5.权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3或4所述的引物的以下任一应用：

(1)在鉴定花生油酸、亚油酸含量性状表型中的应用；

(3)在花生油酸、亚油酸含量性状早期预测中的应用；

(5)在花生油酸、亚油酸含量基因分型中的应用；

(6)在鉴定花生FAD2A基因表达量中的应用。

6.鉴定花生油酸、亚油酸含量高低的方法，其特征在于，包括：

(1)提取待鉴定花生的DNA；

(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示引物进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生油酸、亚油酸含量高低。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述判断待鉴定花生油酸、亚油酸含量高低的方法如下：

若SNP分子标记SNP_C-E具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定花生的油酸含量数值低，亚油酸含量数值高，若基因型为AA，则待鉴定花生的油酸含量数值高，亚油酸含量数值低。

8.鉴定花生FAD2A基因表达量高低的方法，其特征在于，包括：

(1)提取待鉴定花生的DNA；

(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示引物进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生FAD2A基因表达量高低。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述判断待鉴定花生FAD2A基因表达量高低的方法如下：