CN104328198A - 检测高油酸花生fad2a和fad2b基因位点突变基因型的引物及其pcr检测方法 - Google Patents

检测高油酸花生fad2a和fad2b基因位点突变基因型的引物及其pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测高油酸花生 FAD2A 和 FAD2B 基因突变基因型的引物及其PCR检测方法。所述引物包括高油酸花生 FAD2A 和 FAD2B 突变基因型的四对引物，其中 ahFAD2A 基因448bp处的引物以及 ahFAD2B 基因442bp位点的引物各为两对。利用该引物PCR检测方法，包括PCR扩增，经电泳检测，电泳后在凝胶成像仪中检测PCR产物，组合分析四对引物的电泳结果，得到样本对应的基因型。本发明开发了针对 FAD2A 和 FAD2B 突变位点的引物和PCR检测方法，方法简单，成本低，结果稳定；为分子标记辅助选择高油酸花生品种提供了新的技术手段，可显著提高高油酸性状选择的准确性，降低育种成本，提高育种效率。

Description

检测高 油酸花生 FAD2A 和 FAD2B 基因位点突变基因型的引物及其 PCR 检测方法
技术领域
本发明属于农业生物工程领域，具体涉及一种检测高油酸花生FAD2A和FAD2B基因突变基因型的引物及其PCR检测方法。
背景技术
花生是人们日常生活中不可缺少的食材之一，花生油、花生酱等花生制品在生产和储存期间会由于脂质氧化而产生不良的气味、口味及货架期缩短等问题。高油酸花生能改善普通花生的这些缺点，因为油酸具有较好的氧化稳定性，从而减少脂质氧化。在猪饲料中添加高油酸花生能提高猪肉脂肪中的不饱和脂肪酸含量，而且不影响猪肉的其它品质。食用高油酸花生对人体健康有益，与低脂饮食相比，高单不饱和脂肪酸、低胆固醇的饮食（包括橄榄油、花生油、花生酱等）更有利于降低心脑血管疾病风险；而且无论胰岛素来自体内分泌还是体外注射，高油酸花生油都能反向抑制炎症细胞因子TNF-α。因此，高油酸花生倍受青睐，根据市场需要选育优质、高产、抗病（逆）的高油酸品种也成为花生育种的重要目标。
含80%油酸和2%亚油酸的高油酸花生自发突变体F435最早是在Florida育种项目中发现的。高油酸和普通油酸花生的杂交F2的分离比为3:1或15:1，表明高油酸这一性状受两对隐性基因(ahFAD2A和ahFAD2B)调控。与普通油酸花生的FAD2A和FAD2B基因相比，高油酸花生中这两个基因的存在与高油酸性状相关的SNP突变；一个是FAD2A基因起始密码子后448bp处G:C→A:T的突变（D150N氨基酸的变异），另一个是FAD2B基因起始密码子后442bp处A插入的突变，使终止密码子提前出现。后来又发现的Mycogen-Flavo（MF）和M2-225这两个高油酸突变体与F435不同，在它们的FAD2B基因中是微型反向重复转座元件（MITE）插入导致基因功能的改变。这些高油酸突变体常常被用作高油酸花生育种的高油酸性状供体亲本。为了提高高油酸花生的育种效率，开发用于辅助育种的检测方法非常必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题：针对现有技术存在的缺陷，提供一种检测FAD2A和FAD2B突变位点的引物及其PCR检测方法；该技术具有方法简单、成本低和结果稳定等优点；
本发明还提供了利用PCR产物带型区分FAD2A和FAD2B基因九种基因型的方法，该方法能显著提高高油酸性状选择的准确性，降低育种成本，提高育种效率，为分子标记辅助选择高油酸花生品种提供了新的技术手段。
本发明的技术方案：
一种检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的引物，所述引物如下：
（1）检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变的引物设计：
当检测ahFAD2A基因448bp处无突变时，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生野生型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-WT-R；
FAD2A-F：5’ …...GATTACTGATTATTGACTT…...3’，
FAD2A-WT-R： 5’ …...GTTTTGGGACAAACACTTCACC…...3’；
当检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变时，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生突变型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-Mu-R；
FAD2A-F：5’ …...GATTACTGATTATTGACTT…...3’，
FAD2A-Mu-R：5’ …...GTTTTGGGACAAACACTTAGAT…...3’；
（2）检测ahFAD2B基因442bp位点突变的引物设计：
当检测ahFAD2B基因442bp位点无碱基插入时，在花生野生型FAD2B基因序列-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生野生型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-WT-R；
FAD2B-F：5’ …...CAGAACCATTAGCTTTG…...3’，
FAD2B-WT-R：5’ …...GACAAACACTTCGTCGCGTTAG…...3’；
当检测ahFAD2B基因442bp位点有碱基插入时，在花生野生型FAD2B基因 -80 bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生突变型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-Ins-R；
FAD2B-F：5’ …...CAGAACCATTAGCTTTG…...3’，
FAD2B-Ins-R：5’ …...GACAAACACTTCGTCGCGTTAT…...3’。
一种利用高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的引物PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）PCR扩增： PCR反应体系总体积为10μL，包括1U的DNA聚合酶、1倍浓度的反应buffer，0.4 mM dNTPs，上下游引物各3μM，20ng的DNA样本；
所述上下游引物为FAD2A-F和FAD2A-WT-R、FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R四对中的一对；
PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，45.9℃退火30 s，72℃延伸45 s，30或35次循环；最后72℃延伸10 min；
（2）电泳检测：将四对引物的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳；
（3）电泳后在凝胶成像仪中检测PCR产物，组合分析四对引物的电泳结果，得到样本对应的基因型。
其中引物FAD2A-F和FAD2A-WT-R的PCR反应为30次循环，FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R的PCR反应为35次循环。
所述的PCR检测方法在回交育种和基因型鉴定中的应用。
本发明的积极有益效果：
1、本发明开发了针对FAD2A（448bp处G:C→A:T突变）和FAD2B（442bp处A插入突变）突变位点的引物和PCR检测方法，该方法简单，成本低，结果稳定。与定量PCR方法、酶切方法比较，该方法操作简单，不用荧光染料及限制性内切酶，检测成本低；用九种基因型的测序验证结果显示，普通PCR条件可重复试验结果，结果稳定。
2、本发明方法可用于检测杂交F1中的伪杂种和回交育种中的AaBb株系。杂交育种时及早剔除F1中的伪杂种，能减少后期选育的工作量；在回交育种（AABB×AaBb）中后代AaBb株系的理论比例为25%，若剔除75%的非目标株系，能极大提高目标性状选择的准确性，从而大幅度降低杂交育种的工作量。
3、本发明方法可用于高油酸常规育种工作的aabb基因型鉴定。在F2的9种基因型中，aabb基因型的油亚比最高，而且可以稳定遗传，是高油酸花生育种的首选。AaBb、Aabb、aaBb和aabb四种基因型的自交分离后代能够产生aabb基因型，而AABB、AABb、AAbb、AaBB和aaBB这5种基因型其自交分离后代中不会产生aabb基因型，但它们在F2占7/16，而且如果在育种过程中剔除后5种基因型，将显著减少田间工作量，降低育种成本，显著提高高油酸优良品种选育的效率。
4、本发明为分子标记辅助选择高油酸花生品种提供了新的技术手段，可显著提高高油酸性状选择的准确性，降低育种成本，提高育种效率。由于油酸含量的化学测定需要破坏籽粒，并且需要一定的样品量，所以传统高油酸育种需要等到杂交后代推进到高世代，当性状基本稳定并且种子量较多时，才进行高油酸性状的选择；而且油酸含量的化学测定成本较高，高世代检测样本量大（因为其中包含许多非目标基因型），也增加了育种成本，降低育种效率。本发明在早期的分离世代即可检测确定高油酸基因型，基因型选择准确性高，及时排除了非目标基因型，集中精力于目标基因型的改良，因而针对性强，效率高。
附图说明
图1 FAD2A的突变基因型测序结果图；
图2 FAD2B的突变基因型测序结果图；
图3四对引物的PCR结果区分ahFAD2A和ahFAD2B九种基因型的琼脂糖凝胶电泳结果图；
图4四对引物的PCR产物测序比对结果图。
具体实施方式
实施例一、PCR的引物序列及其带型，包括ahFAD2A 和 ahFAD2B位点的突变特异引物及其带型，具体引物如下：
1.1 检测ahFAD2A基因448bp位点G:C→A:T突变的特异引物设计
1.1.1检测ahFAD2A位点无突变
在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生野生型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-WT-R。
如果448bp处G碱基没有突变为A碱基，将扩增出557bp的预期条带；如果448bp处G碱基突变为A碱基，将扩增不出任何条带。
设计的正向引物FAD2A-F和反向引物FAD2A-WT-R如下：
FAD2A-F：5’….. GATTACTGATTATTGACTT…...3’；
FAD2A-WT-R：5’….. GTTTTGGGACAAACACTTCACC…...3’；
1.1.2检测ahFAD2A位点有突变
在花生野生型FAD2A基因-88bp设计正向引物FAD2A-F，在花生突变型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-Mu-R。如果448bp处G碱基突变为A碱基，将扩增出557bp的预期条带；如果448bp处G碱基没有突变为A碱基，将扩增不出任何条带。
设计的正向引物FAD2A-F、反向引物FAD2A-Mu-R如下：
FAD2A-F：5’….. GATTACTGATTATTGACTT…...3’；
FAD2A-Mu-R：5’….. GTTTTGGGACAAACACTTAGAT…...3’；
1.2检测ahFAD2B基因442bp位点A（腺嘌呤核苷）插入突变的特异引物设计
1.2.1 检测ahFAD2B位点无突变（检测野生型无A插入）
在花生野生型FAD2B基因序列-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生野生型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-WT-R。
如果442bp处没有A碱基插入，将扩增出542bp的预期条带；如果442bp处有A碱基插入，将扩增不出任何条带。
设计的正向引物FAD2B-F、反向引物FAD2B-WT-R如下：
FAD2B-F：5’…..CAGAACCATTAGCTTTG…...3’；
FAD2B-WT-R：5’….. GACAAACACTTCGTCGCGTTAG…...3’ ；
1.2.2 检测ahFAD2B基因442bp处有A碱基插入
在花生野生型FAD2B基因序列-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生突变型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-Ins-R。如果442bp处有A碱基插入，将扩增出543bp的预期条带；如果442bp处没有A碱基插入，将扩增不出任何条带。
设计的正向引物FAD2B-F、反向引物FAD2B-Ins-R如下：
FAD2B-F： 5’…… CAGAACCATTAGCTTTG…….3’；
FAD2B-Ins-R：: 5’….. GACAAACACTTCGTCGCGTTAT …...3’ ；
1.3 不同基因型的PCR带型如下（表1）
表1 基因型与带型对照表
FAD2A基因型 带型 FAD2A-F/FAD2A-WT-R FAD2A-F/ FAD2A-Mu-R
AA Ⅰ √ ×
Aa Ⅱ √ √
aa Ⅲ × √
FAD2B基因型 带型 FAD2B-F/FAD2B-WT-R FAD2B-F/ FAD2B-Ins-R
BB Ⅰ √ ×
Bb Ⅱ √ √
bb Ⅲ × √
备注：表中√表示PCR产物有检测到目的条带，×表示PCR产物没有检测到目的条带。
实施例 2 、利用 ahFAD2A 和 ahFAD2B 位点的突变特异引物进行 PCR 检测的方法
2.1 PCR方法
（1）PCR扩增：反应体系总体积为10 μL，包括1 U 的LA Taq® DNA聚合酶(TAKARA, Japan)，1倍浓度的反应buffer，0.4 mM dNTPs，上下游引物各3 μM，20 ng的DNA样本（CTAB法提取的待检测植株的叶片DNA）。
所述的上下游引物为FAD2A-F和FAD2A-WT-R、FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R中的一对；
PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，45.9℃退火30 s，72℃延伸45 s，30或者35次循环；最后72℃延伸10 min。
其中FAD2A-F/FAD2A-WT-R的PCR为30次循环，FAD2A-F/FAD2A-Mu-R，FAD2B-F/FAD2B-WT-R 和FAD2B-F/FAD2B-Ins-R的PCR为35次循环。
（2）电泳检测：将四对引物的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳；
（3）凝胶经染色后在凝胶扫描仪中检测扩增条带，根据电泳带型得到样本相应的基因型。
2.2利用测序峰值区分基因型
将aF19/R3和bF19/R3 (Patel,2004)的PCR产物（aF19/R3和bF19/R3来自于参考文献，这两对引物的PCR产物中包含突变位点，通过对PCR产物进行测序能知道突变位点的基因型）测序，根据测序峰值可以区分突变基因型。如图1，FAD2A的448bp处只有一个峰G或A，分别为纯合的AA或aa；若有G和A两个峰叠在一起，为杂合基因型Aa。
如图2，FAD2B的442bp处只有一个峰A为纯合bb，若有A和G两个峰叠在一起，为杂合基因型Bb，若没有多一个峰A，则为纯合BB。
实施例 3 、利用 PCR 结果进行基因分型
3.1四对引物PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果区分ahFAD2A和ahFAD2B九种基因型
参考表1中的PCR检测结果和基因型的对应关系，可以根据FAD2A-F/FAD2A-WT-R和FAD2A-F/FAD2A-Mu-R的PCR结果区分ahFAD2A的AA、Aa和aa三种基因型，根据FAD2B-F/FAD2B-WT-R和FAD2B-F/FAD2B-Ins-R的PCR结果区分ahFAD2B基因的BB、Bb和bb三种基因型。见图3。
图3中a. 说明A基因型利用FAD2A-F/FAD2A-WT-R引物都能扩增出特异条带；
b.说明a基因型利用FAD2A-F/FAD2A-Mu-R都能扩增出特异条带；
c.说明B基因型利用FAD2B-F/FAD2B-WT-R引物都能扩增出特异条带；
d.说明b基因型利用FAD2B-F/ FAD2B-Ins-R引物都能扩增出特异条带。
综合4对引物的扩增带型，即可区分AABB、AABb、AAbb、AaBB、AaBb、Aabb、aaBB、aaBb、aabb全部九种基因型。
四对引物的 PCR 产物测序结果
测序结果见图4，图中可看出，除了错配的碱基，FAD2A-F/FAD2A-WT-R的PCR结果与FAD2A野生型的序列一致，FAD2A-F/FAD2A-Mu-R的PCR结果与FAD2A突变型的序列一致，FAD2B-F/FAD2B-WT-R的PCR结果与FAD2B野生型的序列一致，而FAD2B-F/FAD2B-Ins-R的PCR结果与FAD2B突变型的序列一致。这一结果说明四对引物的特异性很好，这与上述琼脂糖凝胶检测结果一致。
不同基因型植株的ASPCR-MP和测序结果比较
用ASPCR-MP检测杂交组合（Yuhua15× kainong61）的27个后代的基因型，然后再用测序的方法获得其基因型，由表2可见，两种方法的结果完全一致，说明ASPCR-MP这一方法检测FAD2基因型的准确性很高，与测序的效果一样。但是测序的花费比ASPCR-MP高很多。所以用ASPCR-MP区分FAD2A和FAD2B的九种基因型，方法简单，效率高，成本低，且检测准确性高，应用于高油酸MAS育种，可显著提高育种效率，降低育种成本。表2中油酸和亚油酸的含量为所检测植株籽仁的近红外检测结果，数据显示油酸含量与突变基因个数密切相关。
表 2不同FAD2基因型植株的ASPCR-MP和测序结果比较
备注：表中C18:1是油酸（十八碳-顺-9-烯酸）；C18:2是亚油酸（十八碳-9，12-二烯酸）。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
<120> 检测高油酸花生FAD2A和FAD2B基因位点突变基因型的引物及其PCR检测方法
<130> PCR分子标记方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gattactgat tattgactt 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttttgggac aaacacttca cc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttttgggac aaacacttag at 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagaaccatt agctttg 17
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacaaacact tcgtcgcgtt ag 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gacaaacact tcgtcgcgtt at 22

Claims (4)

1.一种检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物，其特征在于：所述引物如下：
（1）检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变的引物设计：
当检测ahFAD2A基因448bp处无突变时，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生野生型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-WT-R；
FAD2A-F：5’ …...GATTACTGATTATTGACTT…...3’，
FAD2A-WT-R： 5’ …...GTTTTGGGACAAACACTTCACC…...3’；
当检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变时，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生突变型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-Mu-R；
FAD2A-F：5’ …...GATTACTGATTATTGACTT…...3’，
FAD2A-Mu-R：5’ …...GTTTTGGGACAAACACTTAGAT…...3’；
（2）检测ahFAD2B基因442bp位点突变的引物设计：
当检测ahFAD2B基因442bp位点无碱基插入时，在花生野生型FAD2B基因序列-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生野生型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-WT-R；
FAD2B-F：5’ …...CAGAACCATTAGCTTTG…...3’，
FAD2B-WT-R：5’ …...GACAAACACTTCGTCGCGTTAG…...3’；
当检测ahFAD2B基因442bp位点有碱基插入时，在花生野生型FAD2B基因-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生突变型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-Ins-R；
FAD2B-F：5’ …...CAGAACCATTAGCTTTG…...3’，
FAD2B-Ins-R：5’ …...GACAAACACTTCGTCGCGTTAT…...3’。
2.一种利用权利要求1所述的高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）PCR扩增： PCR反应体系总体积为10μL，包括1U的DNA聚合酶、1倍浓度的反应buffer，0.4 mM dNTPs，上下游引物各3μM，20ng的DNA样本；
所述上下游引物为FAD2A-F和FAD2A-WT-R、FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R四对中的一对；
PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，45.9℃退火30 s，72℃延伸45 s，30或35次循环；最后72℃延伸10 min；
（2）电泳检测：将四对引物的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳；
（3）电泳后在凝胶成像仪中检测PCR产物，组合分析四对引物的电泳结果，得到样本对应的基因型。
3.根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，其中引物FAD2A-F和FAD2A-WT-R的PCR反应为30次循环，FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R的PCR反应为35次循环。
4.权利要求2或3所述的PCR检测方法在回交育种和基因型鉴定中的应用。
CN201410642798.XA 2014-11-14 2014-11-14 检测高油酸花生fad2a和fad2b基因位点突变基因型的引物及其pcr检测方法 Pending CN104328198A (zh)

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