CN108893551A - 一种检测花生高油酸含量的分子标记方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种检测花生高油酸含量的分子标记方法及应用，属于作物分子育种的技术领域，针对花生种子高油酸含量的AhFAD2B基因核苷酸序列突变位点，采用引物对，扩增编码AhFAD2B基因核苷酸序列片段，并选择相应的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，可以标记花生种子高油酸含量的AhFAD2B基因核苷酸序列突变位点。本发明成功地对高油酸花生新型突变基因设计开发CAPS标记，并开发了检测突变位点用试剂盒，能够清晰分辨出高油酸纯合带型和杂合带型，可在育种后代分离群体中进行基因型分型，从而筛选出携带突变基因高油酸等位变异的单株或株系；可避免费时费力的表型鉴定，提高高油酸花生品种选育效率、缩短育种年限。

Description

一种检测花生高油酸含量的分子标记方法及应用

技术领域

本发明属于作物分子育种领域，涉及一种检测花生高油酸含量的分子标记方法及应用，具体涉及一种能够用于鉴别花生高油酸基因AhFAD2B野生型或突变型的特异性CAPS标记、引物对及该引物对在高油酸花生株系选择中的应用。

背景技术

花生是世界上重要的油料作物之一，也是我国重要的食用植物油来源。我国是世界上最大的花生生产、消费和贸易出口国。花生的脂肪酸组成是衡量其品质的关键指标，其中花生种子的油酸含量对花生制品理化稳定性和营养价值具有决定作用，由于高油酸(一般指油酸含量＞75％)花生在延长花生产品货架期以及对人体健康方面的积极意义，花生产品油酸含量已成为花生国际贸易中的重要品质指标。因此，高油酸品种选育已经成为花生品种育种的主要方向。

目前研究结果表明，花生AhFAD2(花生油酸脱氢酶)基因控制花生油酸含量及油亚比(油酸与亚油酸含量的比值)，该基因的突变导致花生种子中大量积累油酸，而使亚油酸含量显著降低，因此花生高油酸育种中大规模应用的高油酸基因为AhFAD2。在栽培种花生中AhFAD2有2个位于不同基因组上的非等位基因AhFAD2A和AhFAD2B，二者同时突变才出现高油酸表型，即高油酸含量性状受2对隐性基因(ol1ol1ol2ol2)控制。在2个隐性基因中，AhFAD2A在花生种质中普遍存在，即Ol1Ol1ol2ol2型，而AhFAD2A和AhFAD2B隐性纯合形式(ol1ol1ol2ol2)的种质很少，所以发掘和创造更多AhFAD2B突变基因型是花生高油酸种质创制的关键。

目前研究者发现的AhFAD2B突变同源基因主要有：高油酸花生自然突变体F435为编码第147位和第148位氨基酸的核苷酸序列(CTC与GAC)中间插入A，导致移码突变，并使编码区在495bp处提前终止；C458和M2-225基因在编码区内插入MITE元件，导致翻译提前终止；高油酸花生自然突变体PI342664和PI342666，编码第101位氨基酸的CAT变为GAT，导致H变为D；高油酸突变体GM6-1和GM4-3，编码第372位氨基酸的GGT变为AGT，导致G变为S；化学诱变高油酸突变体E2-4-83-12，编码第105位氨基酸的CAC变为TAC，导致H变为Y。上述高油酸花生突变体AhFAD2B基因突变位点情况见图1所示。上述突变位点均为AhFAD2B酶活性的关键氨基酸残基，其突变导致酶活性降低或失活，与AhFAD2A同时突变导致突变体产生高油酸表型。这些突变体是高油酸花生育种的重要的亲本材料，但是由于目前其遗传标记还未开发，限制了新突变体在育种上的有效利用。

为了提高花生高油酸育种效率，建立高通量、低成本、快速高效、准确稳定、适于早期选择的高油酸花生鉴定技术显得尤为重要。与常规的高油酸表型鉴定技术不同，分子标记辅助选择技术(MAS)为基因型鉴定，该技术针对AhFAD2特定基因型设计，能够选择出当代为普通油酸表型而其后代可能出现高油酸性状的分离子个体。针对化学诱变或自然突变的高油酸花生突变体及其衍生系AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP差异，开发了多种用于检测高油酸的分子标记和检测方法，如等位基因特异PCR(AS-PCR)技术、TaqMan探针法、直接测序法、荧光定量PCR法等，实现了对高油酸花生育种的辅助选择和精准鉴定，为利用高油酸突变体作为杂交亲本进行分子标记辅助选择育种奠定了技术基础。但是，大多由于技术繁琐、成本高，限制了其在花生高油酸育种中的应用。

酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAPS)标记，又称PCR-RFLP，是一种将特异引物PCR与限制性内切酶消化结合，通过酶切检测引起酶切位点发生改变的SNP。该技术具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低等特点，广泛运用于植物基因分型、定位、图位克隆和分子鉴定等方面。虽然国内外已有将CAPS标记技术应用于高油酸花生种质鉴定和品种选育，但是，所用标记方法都是基于美国高油酸花生自然突变体F435的AhFAD2A G448A突变和AhFAD2B 441_442insA突变或MITE型突变开发的，限制了高油酸花生新型突变体在花生育种中的广泛、高效应用。

发明内容

本发明的目的是针对已发现的可导致花生种子产生高油酸含量表型的基因突变位点，开发实用的CAPS分子标记，为花生高油酸品种选育提供一种准确、快速、有效的检测方法。

本发明为实现其目的采用的技术方案是：

一种检测花生高油酸含量的分子标记方法，针对以下至少一个花生种子高油酸含量的AhFAD2B基因核苷酸序列突变位点：

(1)所述SNP位点在花生基因组中对应于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第301位，所述SNP位点处的核苷酸序列由C置换为G，即C301G，突变基因命名为AhFAD2B-301；

(2)所述SNP位点在花生基因组中对应于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第313位，所述SNP位点处的核苷酸序列由C置换为T，即C313T，突变基因命名为AhFAD2B-313；

(3)所述SNP位点在花生基因组中对应于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第814位，所述SNP位点处的核苷酸序列由C置换为T，即C814T，突变基因命名为AhFAD2B-814；

(4)所述SNP位点在花生基因组中对应于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1111位，所述SNP位点处的核苷酸序列由G置换为A，即G1111A，突变基因命名为AhFAD2B-1111；

采用以下至少一对引物：

①针对AhFAD--2B-301中301位点的上、下游引物对，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

②针对AhFAD2B-313中313位点的上、下游引物对，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示；

③针对AhFAD2B-814中814位点的上、下游引物对，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQID NO：4所示；

④针对AhFAD2B-1111中1111位点的上、下游引物对，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

扩增编码AhFAD2B基因核苷酸序列片段(用AhFAD2B基因片段特异引物扩增相应的含有所述突变位点的片段)，针对AhFAD2B-301的突变位点选择BspHI酶，针对AhFAD2B-313的突变位点选择BalI酶，针对AhFAD2B-814的突变位点选择NdeI酶，针对AhFAD2B-1111的突变位点选择MboII酶；分别对相应扩增产物进行酶切，可以标记花生种子高油酸含量的AhFAD2B基因核苷酸序列突变位点。

所述检测花生高油酸含量的分子标记方法在鉴定或者辅助鉴定花生高油酸含量中的应用，包括以下步骤：

(1)提取供试花生样品基因组DNA；

(2)通过权利要求1所述针对特定同源基因AhFAD2B突变位点设计的特异引物，利用PCR扩增出仅含有特定AhFAD2B同源基因中突变位点的核苷酸片段；

(3)根据权利要求1所述选择相应的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切；

(4)对酶切产物进行凝胶电泳，根据DNA带型确定相应株系的基因型；

(5)根据基因型在不同分离世代育种群体选择得到高油酸单株或株系，或在种质资源中鉴定其基因型。

所述检测花生高油酸含量的分子标记方法在鉴定或者辅助鉴定花生高油酸含量中的应用，采用针对AhFAD2B-814中C814T和AhFAD2B-1111中G1111A的引物对HOCAPS-F1/HOCAPS-R1，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；采用针对AhFAD2B-301中C301G和AhFAD2B-313中C313T的引物对HOCAPS-F2/HOCAPS-R2，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示，分别扩增花生材料DNA；

针对AhFAD2B-301的突变位点选择BspHI酶，针对AhFAD2B-313的突变位点选择BalI酶，针对AhFAD2B-814的突变位点选择NdeI酶，针对AhFAD2B-1111的突变位点选择MboII酶；

(1)如在HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物对扩增的片段长度为841bp中有一个针对于NdeI酶的识别位点，扩增产物能完全酶切成213bp和628bp的特征带型，则扩增的片段含有同源基因AhFAD2B-814中的突变位点T814位点，样品为AhFAD2B突变纯合体，基因型为bb；

如扩增产物不能被酶切，只含有841bp的带型，则扩增片段不含有同源基因AhFAD2B-814中的突变位点T814位点，样品基因型为BB；

如果所述酶切产物同时存在213bp、628bp、841bp的带型，则样品为基因突变杂合体，基因型为Bb；

(2)如在HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物对扩增的片段长度为841bp中有两个针对于MboII酶的识别位点，扩增产物能够完全酶切成519bp、237bp和85bp的特征带型，则扩增的片段含有同源基因AhFAD2B-1111中的突变位点A1111位点，样品为AhFAD2B突变纯合体，基因型为bb；

如扩增产物被完全酶切成756bp和85bp的带型，则扩增片段不含有同源基因AhFAD2B-1111中的突变位点A1111位点，样品基因型为BB；

如果所述酶切产物同时存在519bp、237bp、756bp、85bp的带型，则样品为基因突变杂合体，基因型为Bb；

(3)如在HOCAPS-F2/HOCAPS-R2引物对扩增的片段长度为822bp中有一个针对于BspHI酶的识别位点，扩增产物能够完全酶切成381bp和441bp的特征带型，则扩增的片段含有同源基因AhFAD2B-301中的野生型位点C301位点，样品为AhFAD2B野生纯合体，基因型为BB；

如扩增产物不能被酶切，只含有822bp的带型，则扩增片段含有同源基因AhFAD2B-301中的突变位点G301位点，样品基因型为bb；

如果所述酶切产物同时存在381bp、441bp、822bp的带型，则样品为基因突变杂合体，基因型为Bb；

(4)如在HOCAPS-F2/HOCAPS-R2引物对扩增的片段长度为822bp中有3个针对于BalI酶的识别位点，扩增产物能完全酶切成170bp、157bp、65bp和430bp的特征带型，则扩增的片段含有同源基因AhFAD2B-313中的野生型位点C313位点,样品为AhFAD2B野生纯合体，基因型为BB；

如扩增产物中有2个BalI酶识别位点，扩增产物能被完全酶切成170bp、157bp、495bp的带型，则扩增片段含有同源基因AhFAD2B-313中的突变位点T313位点，样品基因型为bb；

如果所述酶切产物同时存在170bp、157bp、65bp、430bp和495bp的带型，则样品为基因突变杂合体，基因型为Bb。

如上述所述检测花生高油酸含量的分子标记方法检测突变位点的试剂盒，包括权利要求1所述引物、任选的PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和权利要求1所述的限制性内切酶。

权利要求2或3所述应用的方法在高油酸花生育种中的应用。

权利要求4所述试剂盒在高油酸花生育种中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供了新发掘高油酸突变体C814T，编码第272位氨基酸的CAT变为TAT，导致H变为Y，本发明成功地对新发现的高油酸花生新型突变基因设计开发CAPS标记，并开发了检测突变位点用试剂盒(包括特异引物、专一性限制性内切酶及任选试剂)，能够清晰分辨出高油酸纯合带型和杂合带型，可在育种后代分离群体中进行基因型分型，从而筛选出携带突变基因高油酸等位变异的单株或株系。可避免费时费力的表型鉴定，提高高油酸花生品种选育效率、缩短育种年限。

附图说明

图1为高油酸花生AhFAD2A和AhFAD2B基因及其突变位点示意图。

图2为引物对HOCAPS-F1/HOCAPS-R1、HOCAPS-F2/HOCAPS-R2和HOCAPS-F3/HOCAPS-R3在不同油酸含量花生品种(系)中的扩增情况。

图3为特异性扩增AhFAD2A和AhFAD2B-814基因突变位点的引物对HOCAPS-F3/HOCAPS-R3和HOCAPS-F1/HOCAPS-R1对亲本和F1基因组扩增产物的测序峰图。

图4为CAPS1标记在F2分离群体部分单株基因型鉴定中的应用图。

图5为CAPS1标记检测12个花生品种(系)的琼脂糖电泳图。

其中，图1中5’UTR和3’UTR为基因非翻译区，Intron为基因5’UTR内的内含子区段，CDS为编码区，ATG为AhFAD2A和AhFAD2B基因相同的起始密码子，TGA为两基因相同的终止密码子；AhFAD2A和AhFAD2B基因核苷酸序列在多个位点存在差异，其中空白虚线方框#和*分别为AhFAD2B基因在起始密码子上游69bp处有一段19bp的缺失碱基序列和在终止密码子下游286bp处有一段15bp的缺失碱基序列；AhFAD2B基因CDS区域内所示碱基位置为目前已经发现的该基因的突变位点，其下方所示为三联体密码子突变导致的氨基酸残基改变和突变体名称；HOCAPS-F1/HOCAPS-R1、HOCAPS-F2/HOCAPS-R2和HOCAPS-F3/HOCAPS-R3分别为特异扩增含有突变位点在内的引物对。

图2中M为DNA分子量marker，片段大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；图示1-4依次为KX01-6、C814T、冀花6号、―冀花6号×C814T”后代F1。HOCAPS-F1/HOCAPS-R1、HOCAPS-F2/HOCAPS-R2和HOCAPS-F3/HOCAPS-R3引物对在4个花生材料中分别扩增出841bp、822bp和1250bp的单一条带。

图3中上方是普通油酸含量品种冀花6号峰图，中间是杂种F1的峰图，下方是亲本高油酸突变体C814T的峰图；峰图上方的数字指示突变碱基位点在基因核苷酸序列中的位置(从起始密码子ATG开始计算)，F1在突变位点上出现套峰表示两个碱基同时存在，即为杂合位点。

图4中M为DNA分子量marker，片段大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；图示为24个单株包含9种不同AhFAD2A-448位点和AhFAD2B-814位点的基因型；每个单株采用AhFAD2A和AhFAD2B特异引物进行扩增，I采用的是Hpy99I限制性内切酶对HOCAPS-F3/HOCAPS-R3引物扩对增的PCR产物进行酶切结果，II是NdeI对HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物对扩增的OCR产物进行酶切的结果。右侧为酶切各种产物片段的大小，图下方为根据特征带型判断的AhFAD2A-448位点和AhFAD2B-814位点的基因型；A和a分别代表AhFAD2A-448位点是野生型和突变型，B和b分别代表AhFAD2B-814位点是野生型和突变型。

图5中M为DNA分子量marker，片段大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；图示1-12依次为KX01-6、C814T突变体、201508-412、201508-957、201521-602、201511-023、远杂9102、花育20号、冀11-17-7-3、冀3-1-3、冀花20号、冀花6号；每个品种(系)采用AhFAD2A和AhFAD2B特异引物进行扩增，I采用的是Hpy99I限制性内切酶对HOCAPS-F3/HOCAPS-R3引物扩对增的PCR产物进行酶切结果，II是NdeI对HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物对扩增的OCR产物进行酶切的结果；右侧为酶切各种产物片段的大小，图下方为根据特征带型判断的AhFAD2A-448位点和AhFAD2B-814位点的基因型；A和a分别代表AhFAD2A-448位点是野生型和突变型，B和b分别代表AhFAD2B-814位点是野生型和突变型。

具体实施方式

本发明通过对大批花生种质资源进行脂肪酸鉴定，采用表型测试与基因型检测相结合的方法，获得1个油酸含量达85％以上的AhFAD2B基因功能缺失纯合突变体C814T；为提高C814T突变体在高油酸花生育种中的利用效率，开发了一种用于区分AhFAD2B突变基因(AhFAD2B-814)与野生型的分子标记，以实现高油酸基因AhFAD2B-814突变体基因型的高效精准鉴定，在后续利用C814T突变体进行高油酸育种中具有重要价值。本发明是基于申请人新发掘的和相关研究新发现的AhFAD2B同源基因中的新突变位点，开发能够检测各种突变基因型的CAPS标记并将其用于高油酸花生品种的分子标记辅助选择育种中。

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，下列实施例仅用于说明本发明，但不用来限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购得。

PCR特异性扩增AhFAD2A基因的引物对(HOCAPS-F3/HOCAPS-R3)记载于―Wang ML，et al.Newly identified natural high-oleate mutant from Arachis hypogaeaL.subsp.hypogaea.Molecular Breeding，2015，35:186”，可以由生物公司人工合成；所使用的G448A突变位点特异限制性内切酶Hpy99I记载于―Chu Y，et al.Frequency of aloss-of-function mutation in oleoyl-PC desaturase(ahFAD2A)in the mini-core ofthe U.S.peanut germplasm collection.Crop Science,2007,47:2372–2378”，可以从生物试剂公司购得。

实施例1、花生高油酸相关CAPS标记引物设计及PCR扩增获得同源基因片段

1.1花生种子油酸含量相关同源基因AhFAD2A和FAD2B序列分析与特异引物设计

从NCBI数据库(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索花生AhFAD2基因的序列信息，将所获得的序列采用GeneiousPro R11软件进行比对分析发现，这些序列明显地分为2类，即AhFAD2A和AhFAD2B。该2类基因核苷酸序列高度相似，但在编码区有多个SNP差异位点，在5’端和3’端也存在明显序列差异，如图1所示，AhFAD2B基因在起始密码子上游69bp处有一段19bp的缺失碱基序列和在终止密码子下游286bp处有一段15bp的缺失碱基序列。为了保证引物序列的特异性，需在AhFAD2A和AhFAD2B基因序列差异位点处设计引物，以获得单一基因片段的扩增产物。此外，针对本申请人已公布的新型高油酸花生AhFAD2B-814突变基因，即C814T位点，以及相关文献报道的高油酸花生AhFAD2B同源基因突变，即G1111A、C301G以及C313T在序列中的位置，设计的特异性引物还应包含上述突变位点。

本发明所选取的标记位点信息如表1所示。

表1

为了更加准确地获得单一PCR产物，根据AhFAD2A和AhFAD2B基因序列的差异区段，分别在AhFAD2B的5’端和3’端缺失序列处设计跨缺失部分的特异引物，可确保特异扩增出AhFAD2B基因的目的片段。设计并合成的引物如下：(1)针对C814T和G1111A位点，正向引物HOCAPS-F1：5’—AGATTTGCAAGCCACTATGA—3’，反向引物HOCAPS-R1：5’—GTAGTTAATGTTAAATGCTTCT—3’；(2)针对C301G和C313T位点，正向引物HOCAPS-F2：5’—TCAGAACCATTAGCTTTGTAGT—3’，反向引物HOCAPS-R2：5’—CACCCAACCCAAACCTTTCAAA—3’。

针对AhFAD2B同源基因不同的突变位点，高油酸突变体或品种(系)的AhFAD2B核苷酸序列在起始密码子后第814位、第1111位、第301位和第313位碱基分别为T、A、G和T(基因型定义为bb)，普通油酸含量品种(系)的AhFAD2B核苷酸序列在起始密码子后第814位、第1111位、第301位和第313位碱基分别为C、G、C和C(基因型定义为BB)，而用突变体作为杂交亲本获得真杂种F1中的AhFAD2B核苷酸序列在起始密码子后第814位、第1111位、第301位和第313位的碱基分别为C/T、G/A、C/G和C/T(基因型定义为Bb)。

鉴定高油酸花生AhFAD2A同源基因的引物来源于文献(Wang ML et al，2015)，即针对AhFAD2A基因突变位点G448A，在本发明中定义为正向引物HOCAPS-F3：5’—GATTATTGACTTGCTTTGTAGTAGTGC—3’，反向引物HOCAPS-R3：5’—ACACAAACGTTTTCAACTCTGAC—3’。

1.2PCR扩增获得目的片段及扩增产物检测

为了验证所设计的引物对在花生基因组中的扩增效果，本实施例选择F435型高油酸花生品系KX01-6、高油酸突变体C814T、普通油酸含量品种冀花6号及―冀花6号×C814T”后代F1的基因组DNA作为模板进行PCR扩增。具体步骤如下：

(1)提取花生基因组DNA

将上述花生种子在培养箱内培养10d，剪取每个品种(系)的幼苗的嫩叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，根据Murray和Thompson(1980)的操作并作简化：

(a)在2mL离心管中，加入800μL的2％CTAB缓冲液和30μL的β-巯基乙醇，65℃预热。

(b)取幼嫩叶片1-2g，用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中。

(c)加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL，在涡旋振荡器上充分混匀后，放置于65℃水浴中保温30-60min，不时轻轻转动离心管数次。

(d)在4℃条件下13000rpm离心15min，吸取上清液至另一个新的离心管中。

(e)加入3μL RNase(10mg/mL)，37℃保温30-60min。

(f)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀10min，4℃下13000rpm离心10min，移上清至另一新的离心管中。

(g)再次在上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻地颠倒混匀10min，4℃下13000rpm离心10min，移上清至另一新离心管中。

(h)加入1/10体积的3M NaAc(4℃预冷)，轻轻混匀后，加入2倍体积的100％乙醇或0.7倍体积异丙醇(–20℃预冷)，会出现絮状沉淀，–20℃放置30-60min或–80℃放置10min，12000rpm离心10-15min，回收DNA沉淀。

(i)用70％乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于适量灭菌ddH2O或TE中，37℃放置20-30min，使DNA沉淀完全溶解。

(j)用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性。利用EpochTM MicroplateSpectrophotometer检测基因组DNA浓度和质量。

(k)取出5μL原液，统一稀释到20ng/μL作为工作液。

(2)PCR扩增反应与产物检测

以待测花生基因组DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。

上述PCR反应体系为20μL，包括2×PCR Mix 10μL，正反向引物各1μL，DNA模板1μL，用ddH2O补足到20μL。

采用HOCAPS-F3/HOCAPS-R3引物对特异扩增AhFAD2A基因片段的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min20s，35个循环；72℃延伸10min；于4℃保存备用。采用HOCAPS-F1/HOCAPS-R1扩增AhFAD2B基因含突变位点的目的片段的退火温度为54℃，延伸时间1min，其他同扩增AhFAD2A基因PCR程序。采用HOCAPS-F2/HOCAPS-R2扩增AhFAD2B基因目的片段的退火温度为57℃，延伸时间1min，其他同扩增AhFAD2A基因PCR程序。上述PCR反应在ABI(Applied Bisosystems，美国)公司的PCR扩增热循环仪上进行扩增。

上述3对引物对对应的PCR产物采用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，上述4个已知基因型的花生品种(系)的DNA进行PCR扩增，所有材料均获得了预期的目标片段：HOCAPS-F1/HOCAPS-R1目标产物片段大小841bp，HOCAPS-F2/HOCAPS-R2目标产物片段大小822bp，HOCAPS-F3/HOCAPS-R3目标产物片段大小1250bp。结果如图2所示。

(3)引物特异性扩增检测

为了验证所使用引物对对基因组扩增的特异性，将获得的PCR产物条带用天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行扩增DNA片段的回收与纯化，操作步骤根据试剂盒操作手册进行。将纯化产物直接送华大基因科技服务有限公司测序。测序结果显示，所选的3对引物对成功扩增出了单一的目的基因核苷酸序列区段的片段。在本发明的一个实施例中，HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物扩增产物测序峰图如图3所示，该产物具有清晰、单一的碱基峰图，并显示出了清晰的高油酸突变体突变位点AhFAD2B-814，在突变位点处具有明显的峰图差异，并在杂交后代F1基因组中出现明显的套峰。

实施例2、突变位点酶切分析

寻找野生基因型或突变基因型在突变位点处的合适内切酶。结果发现，不同的突变位点可以采取2种不同的酶切策略，即C814T和G1111A突变可在突变基因型突变位点处找到合适的限制性内切酶，预期结果将为野生型单株的扩增产物不可被酶切，突变型单株的扩增产物可被酶切，而杂合基因型呈现2种带型；C301G和C313T突变可在野生基因型突变位点处找到合适的内切酶，预期结果将为野生型单株的扩增产物可以被酶切，突变型单株的扩增产物不可被酶切，而杂合基因型呈现2种带型。

针对4个不同的AhFAD2B基因突变位点，dCaps Finder 2.0获取以下限制性内切酶：(1)针对AhFAD2B基因C814T位点选择NdeI(酶切位点为)；(2)针对AhFAD2B基因G1111A位点选择MboII(酶切位点为GAAGGGTGTTTAT^)；(3)针对AhFAD2B基因C301G位点选择BspHI(酶切位点为T^CATGA)；(4)针对AhFAD2B基因C313T位点选择BalI(酶切位点为TGG^CCA)。另外，针对高油酸花生AhFAD2A基因突变位点采用Hpy99I酶(酶切位点为CGACG^)(Chu Y et al，2007)。

通过研究PCR扩增核苷酸片段内除了突变位点外是否在其他位置具有相同的酶切位点，从而进一步确认酶切的片段数量及酶切产物片段大小。经分析，获得如下结果：(1)HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物对扩增片段(长841bp)中有一个针对于NdeI酶的识别位点，在高油酸突变体中的扩增产物能完全酶切成213bp和628bp的特征带型(基因型为bb)；在普通油酸野生型花生品种(系)中扩增产物不能被酶切，只含有841bp的带型(基因型为BB)；在F1单株中扩增产物酶切同时存在213bp、628bp、841bp的带型(基因型为Bb)。(2)HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物对扩增片段(长841bp)中有2个针对于MboII酶的识别位点，在高油酸突变体中扩增产物能完全酶切成519bp、237bp和85bp带型(基因型为bb)；在野生型品种(系)中扩增产物被完全酶切成756bp和85bp的带型(基因型为BB)；在F1单株中扩增产物酶切后存在519bp、237bp、756bp、85bp带型(基因型为Bb)。(3)HOCAPS-F2/HOCAPS-R2引物对扩增的片段(长822bp)中有一个针对于BspHI酶的识别位点，在野生型花生品种(系)中扩增产物能完全酶切成381bp和441bp带型(基因型为BB)；在高油酸突变体花生中的扩增产物不能被酶切，只含有822bp带型(基因型为bb)；在F1杂交单株中扩增产物酶切后存在381bp、441bp、822bp的带型(基因型为Bb)。(4)HOCAPS-F2/HOCAPS-R2引物对扩增的片段(长822bp)中有3个针对于BalI酶的识别位点，在野生型花生品种(系)中扩增产物能完全酶切成170bp、157bp、65bp和430bp的带型(基因型为BB)；在高油酸突变体中扩增产物有2个BalI酶识别位点，扩增产物能被完全酶切成170bp、157bp、495bp的带型(基因型为bb)；在F1杂交单株中扩增产物被酶切后产物同时存在170bp、157bp、65bp、430bp和495bp的带型(基因型为Bb)。

作为示范性的例子，本发明的一个实施例中，针对AhFAD2B-814突变使用引物对HOCAPS-F1/HOCAPS-R1得到的PCR产物经NdeI内切酶完全酶切，针对AhFAD2A突变位点G448A使用引物对HOCAPS-F3/HOCAPS-R3得到的PCR产物经Hpy99I内切酶完全酶切。

上述酶切反应体系，内切酶NdeI的酶切体系10μL：AhFAD2B的PCR产物4μL，CutSmart 1μL，NdeI 1μL，ddH2O 4μL。内切酶Hpy99I的酶切体系20μL：AhFAD2A的PCR产物15μL，CutSmart 2μL，Hpy99I 3μL。酶切反应体系放入水浴锅中，酶切过夜。获得的酶切产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测(200V，20min)，经凝胶成像和带型分析后表明，获得的带型与上述酶切分析的结果高度一致，针对AhFAD2B-814突变位点的NdeI酶和针对AhFAD2A基因突变位点的Hpy99I酶均能够有效酶切PCR产物，并且普通油酸花生材料与高油酸突变体带型明显不同，而F1的带型为双亲的组合。因此，所选择的内切酶可以实现对扩增产物的有效酶切。

本发明的上述引物序列和限制性内切酶可配制在试剂盒中，用于进行PCR及产物酶切反应。试剂盒中还可含有实施PCR时常用的其他试剂，包括但不限于DNA聚合酶、缓冲液、dNTP等，可根据需要确定。

实施例3：CAPS标记在高油酸花生育种后代群体单株基因型鉴定中的应用

研究材料为随机选择的―冀花6号×C814T”杂交后代F2单株200株，作为本发明实施例中的一个示范性例子，采用基因突变位点特异引物对HOCAPS-F1/HOCAPS-R1与NdeI内切酶，以及引物对HOCAPS-F3/HOCAPS-R3与Hpy99I内切酶分别组成CPAS标记体系，以上述F2代单株基因组DNA为模板进行特异PCR扩增，之后进行酶切反应，获得带型后进行单株基因型分析判定。所使用的技术参数和方法均按照上述操作进行。

结果如表2显示，单一看AhFAD2A或AhFAD2B基因突变位点在F2群体遗传规律均呈现1:2:1的分离比例，均符合孟德尔单基因遗传规律，因此本发明CAPS方法可以有效区分后代单株高油酸基因突变位点的基因型。将AhFAD2A和AhFAD2B两个基因组合到一起综合分析单株的基因型，发现共存在9种基因型单株，群体中的每个单株均获得了基因型的特征带型。部分F2群体单株带型如图4所示，结合单株脂肪酸测试结果发现，同时具有AhFAD2A的1250bp带型和AhFAD2B的213bp和628bp特征带型的单株，即与高油酸突变体亲本C814T基因型相同的单株(aabb基因型)，其油酸含量均在80％以上，与突变体亲本油酸含量相当；而同时具有AhFAD2A的532bp、718bp带型和AhFAD2B的841bp带型的单株，即与普通油酸含量亲本冀花6号基因型相同的单株(AABB基因型)，其油酸含量均在50％以下，与普通油酸亲本相当。

表2 CAPS标记方法鉴定AhFAD2A或AhFAD2B的突变位点在F2群体中的遗传分离

实施例4：CAPS标记在高油酸花生种质资源鉴定中的应用

对收集的12个不同油酸含量的花生品种(系)采用气相色谱分析仪分别测定籽仁油酸含量，利用CAPS标记对这些材料进行基因型分析，酶切PCR扩增产物后获得的品种(系)间带型差异如图5所示，表型结果和基因型结果如表3所示。在6个高油酸含量的花生品种(系)中5个材料的目标扩增产物酶切后，同时具有AhFAD2A的1250bp带型和AhFAD2B的213bp和628bp特征带型，基因型为aabb，它们的油酸含量均在79％以上；在6个普通油酸含量的花生品种(系)中有6个同时具有AhFAD2A的532bp、718bp带型和AhFAD2B的841bp带型，基因型为AABB，其油酸含量均在50％以下。结果表明，CAPS标记的高油酸筛选效率接近100％，上述方法可以用于鉴定花生品种的基因型，能准确筛选高油酸花生品种(系)。

表3 CAPS标记检测花生品种(系)SNP位点基因型

SEQUENCE　LISTING

<110> 河北省农林科学院粮油作物研究所

<120> 一种检测花生高油酸含量的分子标记方法及应用

<160> 5

<170> PstentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1947

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea

<220>

<221> Coding Region

<222> (137)..(1276)

<220>

<221> Misc Feature

<222> (437)..(437)

<223> s为c或g

<220>

<221> Misc Feature

<222> (449)..(449)

<223> y为c或t

<220>

<221> Misc Feature

<222> (950)..(950)

<223> y为c或t

<220>

<221> Misc Feature

<222> (1247)..(1247)

<223> r为g或a

<400> 1

atggtttaag tcactctcat ctgcaatgac tatcattcat tcattttctt agatatcaga 60

accattagct ttgtagtagt gcaaagtgct aactctttct ttctacattg gtaacaggag 120

ctttaacaac acaacaatgg gagctggagg gcgtgtcact aagattgaag ctcaaaagaa 180

gcctctttca agggttccac attcaaaccc tccattcagt gttggccaac tcaagaaagc 240

aattccacca cattgctttg aacgttctct tttcatatca ttctcatatg ttgtctatga 300

tctcttaatg gcctacttac tcttctacat tgccaccact tatttccaca agcttccata 360

cccattttcc ttccttgctt ggccaatcta ttgggccatc caaggctgca ttctcaccgg 420

tgtttgggtg attgctsatg agtgtggcya ccatgccttc agcaagtacc aacttgttga 480

tgacatggtt ggtttgaccc ttcactcttg tctattagtt ccttatttct catggaaaat 540

cagccaccgc cgccaccact ccaacacagg ttccctcgac cgcgacgaag tgtttgtccc 600

gaaaccaaaa tcaaaggtat catggtataa caagtacatg aacaatccac cagggagggc 660

tatttccctt ttcatcacac tcacactagg atggcccttg tacttggcct tcaatgtttc 720

tggcagaccc tatgatagat ttgcaagcca ctatgaccct tatgctccca tatactctaa 780

cagggaaagg cttctaattt atgtctcaga ttcatctgtc tttgctgtaa catatctgct 840

atatcacata gcaactttga aaggtttggg ttgggtggta tgtgtttatg gggtgccatt 900

gctcattgtg aatgggtttc tagttaccat aacctatttg cagcacacay atgcatcatt 960

gcctcactat gattcatccg aatgggactg gttaagagga gcattggcaa cagtggacag 1020

agattatggg atactgaata aggcatttca tcatataact gatacgcatg tggctcatca 1080

tttgttctca acaatgcctc attaccatgc aatggaagca accaatgcaa taaagccaat 1140

attgggtgat tactaccaat ttgatggcac cccagtttac aaagcattgt ggagagaagc 1200

caaagagtgc ctctatgtgg agccagatga tggagcttct cagaagrgtg tttattggta 1260

caagaacaag ttctgatgca tagtcagagt tggaaacgtt tgtgttaaat tagaaactta 1320

agtactttag taacttgtaa tggtcatcaa caaaaataaa gaatgtgtgt gtggatttgc 1380

catgtaatgt actactacta ctagtactac tagtttttgt gaaatactag cttggtgtga 1440

cttgtgatca tagatttatt taatgcaata ttactattgt gctaagcatt ttgaaaattt 1500

cttccttctt tctttttctt ttgtttcttt ccccaaagat gcagatctat ctaaaagaag 1560

catttaacat taactactaa gaaatctcat taatattttt tacactccat taagttattt 1620

ctttccaaaa tggtaaaaga tctaatgcat acacacattt tattagtgct gatttgggtt 1680

ggtagatgag atcaacttta aggctcctat gtcttgctta atgatagttg tatctagctg 1740

tttaaatttt aagtagtatt taattttagt ttataaattt aattttaata cactaataaa 1800

ttatttttaa cattataaaa ttaaataatt ttgtaaaata ttttattcga tagatgcatc 1860

aaaattaaat tcttaattta taactaacac tctctcttta tcttttattt tcaatttttt 1920

caaaaattca ttttaaataa tgataat 1947

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列HOCAPS-F1

<400> 2

agatttgcaa gccactatga 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列HOCAPS-R1

<400> 3

gtagttaatg ttaaatgctt ct 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列HOCAPS-F2

<400> 4

tcagaaccat tagctttgta gt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列HOCAPS-R2

<400> 5

cacccaaccc aaacctttca aa 22

Claims (6)

1.一种检测花生高油酸含量的分子标记方法，其特征在于，针对以下至少一个花生种子高油酸含量的AhFAD2B基因核苷酸序列突变位点：

(1)所述SNP位点在花生基因组中对应于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第301位，所述SNP位点处的核苷酸序列由C置换为G，即C301G，突变基因命名为AhFAD2B-301；

(2)所述SNP位点在花生基因组中对应于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第313位，所述SNP位点处的核苷酸序列由C置换为T，即C313T，突变基因命名为AhFAD2B-313；

(3)所述SNP位点在花生基因组中对应于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第814位，所述SNP位点处的核苷酸序列由C置换为T，即C814T，突变基因命名为AhFAD2B-814；

(4)所述SNP位点在花生基因组中对应于序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1111位，所述SNP位点处的核苷酸序列由G置换为A，即G1111A，突变基因命名为AhFAD2B-1111；

采用以下至少一对引物：

①针对AhFAD--2B-301中301位点的上、下游引物对，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示；

②针对AhFAD2B-313中313位点的上、下游引物对，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示；

③针对AhFAD2B-814中814位点的上、下游引物对，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示；

④针对AhFAD2B-1111中1111位点的上、下游引物对，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示；

扩增编码AhFAD2B基因核苷酸序列片段，并选择相应的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，针对AhFAD2B-301的突变位点选择BspHI酶，针对AhFAD2B-313的突变位点选择BalI酶，针对AhFAD2B-814的突变位点选择NdeI酶，针对AhFAD2B-1111的突变位点选择MboII酶；分别对相应扩增产物进行酶切，可以标记花生种子高油酸含量的AhFAD2B基因核苷酸序列突变位点。

2.权利要求1所述检测花生高油酸含量的分子标记方法在鉴定或者辅助鉴定花生高油酸含量中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取供试花生样品基因组DNA；

(2)通过权利要求1所述针对特定同源基因AhFAD2B突变位点设计的特异引物，利用PCR扩增出仅含有特定AhFAD2B同源基因中突变位点的核苷酸片段；

(3)根据权利要求1所述选择相应的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切；

(4)对酶切产物进行凝胶电泳，根据DNA带型确定相应株系的基因型；

(5)根据基因型在不同分离世代育种群体选择得到高油酸单株或株系，或在种质资源中鉴定其基因型。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用针对AhFAD2B-814中C814T和AhFAD2B-1111中G1111A的引物对HOCAPS-F1/HOCAPS-R1，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；采用针对AhFAD2B-301中C301G和AhFAD2B-313中C313T的引物对HOCAPS-F2/HOCAPS-R2，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，分别扩增花生材料DNA；

针对AhFAD2B-301的突变位点选择BspHI酶，针对AhFAD2B-313的突变位点选择BalI酶，针对AhFAD2B-814的突变位点选择NdeI酶，针对AhFAD2B-1111的突变位点选择MboII酶；

(1)如在HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物对扩增的片段长度为841bp中有一个针对于NdeI酶的识别位点，扩增产物能完全酶切成213bp和628bp的特征带型，则扩增的片段含有同源基因AhFAD2B-814中的突变位点T814位点，样品为AhFAD2B突变纯合体，基因型为bb；

如扩增产物不能被酶切，只含有841bp的带型，则扩增片段不含有同源基因AhFAD2B-814中的突变位点T814位点，样品基因型为BB；

如果所述酶切产物同时存在213bp、628bp、841bp的带型，则样品为基因突变杂合体，基因型为Bb；

(2)如在HOCAPS-F1/HOCAPS-R1引物对扩增的片段长度为841bp中有两个针对于MboII酶的识别位点，扩增产物能够完全酶切成519bp、237bp和85bp的特征带型，则扩增的片段含有同源基因AhFAD2B-1111中的突变位点A1111位点，样品为AhFAD2B突变纯合体，基因型为bb；

如扩增产物被完全酶切成756bp和85bp的带型，则扩增片段不含有同源基因AhFAD2B-1111中的突变位点A1111位点，样品基因型为BB；

如果所述酶切产物同时存在519bp、237bp、756bp、85bp的带型，则样品为基因突变杂合体，基因型为Bb；

(3)如在HOCAPS-F2/HOCAPS-R2引物对扩增的片段长度为822bp中有一个针对于BspHI酶的识别位点，扩增产物能够完全酶切成381bp和441bp的特征带型，则扩增的片段含有同源基因AhFAD2B-301中的野生型位点C301位点，样品为AhFAD2B野生纯合体，基因型为BB；

如扩增产物不能被酶切，只含有822bp的带型，则扩增片段含有同源基因AhFAD2B-301中的突变位点G301位点，样品基因型为bb；

如果所述酶切产物同时存在381bp、441bp、822bp的带型，则样品为基因突变杂合体，基因型为Bb；

(4)如在HOCAPS-F2/HOCAPS-R2引物对扩增的片段长度为822bp中有3个针对于BalI酶的识别位点，扩增产物能完全酶切成170bp、157bp、65bp和430bp的特征带型，则扩增的片段含有同源基因AhFAD2B-313中的野生型位点C313位点,样品为AhFAD2B野生纯合体，基因型为BB；

如扩增产物中有2个BalI酶识别位点，扩增产物能被完全酶切成170bp、157bp、495bp的带型，则扩增片段含有同源基因AhFAD2B-313中的突变位点T313位点，样品基因型为bb；

如果所述酶切产物同时存在170bp、157bp、65bp、430bp和495bp的带型，则样品为基因突变杂合体，基因型为Bb。

4.如权利要求1所述检测花生高油酸含量的分子标记方法检测突变位点的试剂盒，包括权利要求1所述引物、任选的PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和权利要求1所述的限制性内切酶。

5.权利要求2或3所述应用的方法在高油酸花生育种中的应用。

6.权利要求4所述试剂盒在高油酸花生育种中的应用。