CN108148859A - 一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法 - Google Patents

一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用构建含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，属于基因工程领域。本发明以低油酸花生的△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B为标记基因，构建了一种含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体，实现了花生内源基因在遗传转化后代的快速筛选中的应用，该方法通过花生种子单粒近红外检测，可以在不损伤种子的条件下，快速、高效的筛选出转化体。本发明避免了利用抗生素筛选存在的假阳性、步骤繁琐和安全隐患等问题，而且转化效率高，操作简单，是一种安全、高效的筛选方法。

Description

一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选 转基因花生的方法
技术领域
本发明涉及一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，属于基因工程领域。
背景技术
花生是重要的油料作物，油酸和亚油酸是其油脂中的主要成分。研究发现，花生高油酸特性由2个主效基因控制，Jung等从普通花生及高油酸花生突变体(以SunOleic95R为父本杂交获得)中分离了这两个基因：AhFAD2A和AhFAD2B(Jung S,Swift D,Sengoku E,Patel M,Teule F,Powell G,Moore K,Abbott A.The high oleate trait in thecultivated peanut Arachis hypogaea L.I.Isolation and characterization of twogenes encoding microsomal oleoyl-PC desaturases.Mol Gen Genet,2000,263:796-805.)。这两个基因均编码△12-脂肪酸脱氢酶，主要作用是催化油酸在碳12位去饱和产生亚油酸，是控制油酸和亚油酸含量的关键酶。在高油酸花生突变体F435中AhFAD2B 442bp处有一单核苷酸“A”插入，其插入导致移码突变，从而产生无活性蛋白质；在AhFAD2A 448bp处有单个核苷酸G到A的替换，结果是AhFAD2A编码的△12-脱氢酶活性降低。AhFAD2A和AhFAD2B同时突变可以产生高油酸表型，即油酸含量在70％以上，而单个基因的表达导致油酸含量降低到70％以下。
在花生遗传转化过程中，利用抗生素类基因和抗除草剂类基因作为筛选标记基因进行筛选时，可能会对环境及人类健康产生不良影响和损害。因此，利用无争议的生物安全标记基因来构建表达载体，便逐渐成为新的研究热点。中国专利文献CN102433354A(申请号201110361128.7)公开了一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，该方法从大肠杆菌中扩增获得木糖异构酶基因，构建重组表达载体，在以木糖为主要碳源的培养基上，转化体因能利用木糖而呈现优势生长，非转化体则因碳源供应不足而使生长受到抑制不能成苗。该方法是使用异源基因表达异源蛋白作为筛选标记。
AhFAD2B基因为花生内源基因，其蛋白产物为△12-脂肪酸脱氢酶，催化油酸转化成亚油酸。亚油酸是一种ω-6必需脂肪酸，有抗血栓，保肝等功能。以高油酸花生为转化受体，将AhFAD2B基因作为筛选标记基因进行转化，转化后代可通过单粒近红外检测油酸含量的方法确定转化阳性株系。该方法不损伤种子，不影响样本的后续使用，操作非常简单，方便。因此，用AhFAD2B基因作为筛选标记基因是行之有效的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法。本发明构建了含有AhFAD2B基因的植物表达载体pCAMBIA2300-AhFAD2B，并通过农杆菌介导的花萼管注射法转化花生，转基因阳性率达到13.5％。本发明避免了利用抗生素筛选存在的假阳性、步骤繁琐和安全隐患等问题，而且转化效率高，操作简单，是一种安全、高效的筛选方法。
本发明的技术方案如下：
△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B作为标签在筛选转基因花生中的应用，所述△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，包括以下步骤：
(1)构建获得含有△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的植物表达载体，其中△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将步骤(1)中含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体转入高油酸花生，通过单粒近红外技术检测转化后代种子的油酸含量；
(3)当利用单粒近红外技术检测时，转化后代种子的油酸含量值≤65％，转化后代种子为转化成功的转基因花生。
根据本发明优选的，上述步骤(1)中含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体的构建方法包括以下步骤：
a、以AhFAD2A和AhFAD2B均未发生突变的普通油酸花生基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B，其中上游引物FAD2B-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，下游引物FAD2B-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
b、将步骤a中扩增的AhFAD2B基因连接到pMD18-T载体上，得到AhFAD2B-pMD18-T重组质粒；
c、设计同源臂引物，扩增步骤b中AhFAD2B-pMD18-T重组质粒，获得含有同源臂的AhFAD2B基因，其中上游同源臂引物FAD2B-CZ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游同源臂引物FAD2B-CZ-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
d、内切酶XhoI单酶切植物表达载体pCAMBIA2300-35s-ocs，将新霉素磷酸转移酶II基因NeoR切掉；
e、利用同源重组的方法，将步骤c中含有同源臂的AhFAD2B基因与步骤d中酶切后的植物表达载体进行重组，获得含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体。
根据本发明优选的，上述步骤a中普通油酸花生为丰花1号花生品种。
根据本发明优选的，上述步骤a中PCR扩增的反应体系为：I-5 Mix 25μl，上游引物FAD2B-F和下游引物FAD2B-R各1μl，DNA模板1μl，H2O 22μl；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。
根据本发明优选的，上述步骤b中得连接反应体系为：Topo Mix 1μl，007 bluntVector 1μl，步骤(1)PCR产物1μl，H2O 7μl；室温下反应5min。
根据本发明优选的，上述步骤c中扩增的反应体系为：I-5 Mix 25μl，上游同源臂引物FAD2B-CZ-F和下游同源臂引物FAD2B-CZ-R各1μl，AhFAD2B-pMD18-T模板1μl，H2O 22μl；扩增反应程序为98℃预变性2min；98℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。
根据本发明优选的，上述步骤e中同源重组按照Trelief SoSoo Cloning Kit试剂盒的说明书进行。
一种重组菌株，其特征在于，含有上述重组的△12-脂肪酸脱氢酶基因植物表达载体的菌株。
根据本发明优选的，所述菌株为农杆菌。
有益效果：
1.本发明以低油酸花生的△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B为标记基因，构建了一种含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体，实现了花生内源基因在遗传转化后代的快速筛选中的应用，该方法通过花生种子单粒近红外检测，可以在不损伤种子的条件下，快速、高效的筛选出转化体。
2、本发明转化的受体花生品种为高油酸花生，其油酸含量高于70％，高油酸花生中AhFAD2A和AhFAD2B基因均突变，无法将油酸转化成亚油酸，而该载体中导入具有功能的AhFAD2B基因可以恢复△12-脂肪酸脱氢酶的功能，催化油酸到亚油酸的转化，降低转化后代的油酸含量至70％以下，所以当利用单粒近红外技术检测到转化后代的油酸含量在65％以下时，说明转化成功。
3、本发明构建的植物表达载体中AhFAD2B基因作为新的标记基因，避免了使用抗生素或除草剂进行筛选可能造成的安全隐患，是一种安全、高效的筛选方法。
附图说明
图1为改造之前的pCAMBIA2300-35s-ocs图谱；
图2为改造之后的pCAMBIA2300-FAD2B图谱；
图3为PCR扩增筛选基因FAD2B插入验证结果图；
其中，M为DNA maker，条带大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道1-4为编号1-1，1-2，1-3，8-38的转基因花生样品，5为pCAMBIA2300-AhFAD2B质粒，6为非转基因对照K17-15，7为H2O对照。
图4为PCR扩增目的基因AhPIF3启动子35s验证结果图；
其中，M为DNA maker，条带大小从上到下依次为5000bp,3000bp,2000bp、1000bp,750bp、500bp、250bp，泳道1-14为油酸含量在65％以下的转基因花生样品，编号分别为9-13，1-91，1-68，8-38，8-4，7-134，3-20，7-114，8-13，1-35，4-17，3-33，3-91，7-31；15为pCAMBIA2300-AhFAD2B-AhPIF3质粒，16为非转基因对照K17-15，17为H2O对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
本发明所涉及的试剂和药品均为市售产品。其中pMD18-T载体购自宝生物大连工程有限公司；Pcambia2300-35s-ocs载体购自丰辉生物；Trelief SoSoo Cloning Kit同源重组试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司；农杆菌菌株LBA4404购自北京天恩泽基因科技有限公司；引物合成于青岛擎科梓熙生物技术有限公司；内切酶XhoI购自宝生物大连工程有限公司，内切酶KpnⅠ购自赛默飞世尔科技中国有限公司，内切酶XbaⅠ购自赛默飞世尔科技中国有限公司。
实施例1一种含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体的构建
(1)根据AhFAD2B基因序列(SEQ ID NO.1)设计引物，并以丰花1号花生品种基因组DNA为模板进行PCR扩增，其中引物序列如下：
上游引物FAD2B-F：5’-ATGGGAGCTGGAGGGCGTGT-3’(SEQ ID NO.2)，
下游引物FAD2B-R：5’-TCAGAACTTGTTCTTGTACCAATAA-3’(SEQ ID NO.3)；
PCR扩增的反应体系为：I-5Mix 25μl，上游引物FAD2B-F和下游引物FAD2B-R各1μl，DNA模板1μl，H2O 22μl；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。
(2)将步骤(1)扩增的AhFAD2B基因连接到pMD18-T载体上，得到AhFAD2B-pMD18-T重组质粒；
其中，连接载体的反应体系为：Topo Mix 1μl，007 blunt Vector(购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司)1μl，步骤(1)PCR产物1μl，H2O 7μL；室温下反应5min。
(3)设计同源臂引物，以正确连入AhFAD2B的pMD18-T载体为模板重新扩增获得含同源臂的AhFAD2B基因，其中同源臂引物序列如下：
上游同源臂引物FAD2B-CZ-F：(SEQ ID NO.4)
5'-GTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCATGGGAGCTGGAGGGCGT-3'
下游同源臂引物FAD2B-CZ-R：(SEQ ID NO.5)
5'-CTCACACATTATTATGGAGAAACTCAGAACTTGTTCTTGTACCAAT-3'
其中，扩增的反应体系为：I-5Mix 25μl，上游同源臂引物FAD2B-CZ-F和下游同源臂引物FAD2B-CZ-R各1μl，AhFAD2B-pMD18-T模板1μl，H2O 22μl；扩增反应程序为98℃预变性2min；98℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。
(4)用内切酶XhoI单酶切如图1所示的pCAMBIA2300-35s-ocs载体，将新霉素磷酸转移酶II基因NeoR切掉；
其中，单酶切的反应体系为50μl，包括内切酶XhoI 1μl，10×green buffer 5μl，质粒10μl(800ng)，水34μl；37℃酶切3h，经2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(5)利用Trelief SoSoo Cloning Kit同源重组试剂盒，将步骤(3)中含有同源臂AhFAD2B基因与步骤(4)中酶切后的pCAMBIA2300-35s-ocs载体进行重组，获得如图2所示的含有△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B植物表达载体；
实施例2含有目的基因AhPIF3的△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体的构建
(1)中国专利文献CN107056905A公开了花生光敏色素相互作用因子AhPIF3及其编码基因，本实施例以鲁花14号花生品种基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得花生光敏色素相互作用因子编码基因AhPIF3，AhPIF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中引物序列如下：
AhPIF3-F：5’-CCCGGTACCATGCCTTTTTATGAGTTATACCG-3’(SEQ ID NO.7，下划线为KpnⅠ酶切位点)，
AhPIF3-R：5’-CCCTCTAGATCAATCATCATAACCAGTCACA-3’(SEQ ID NO.8，下划线为XbaⅠ酶切位点)；
PCR扩增的反应体系为：I-5Mix 25μl，上游引物AhPIF3-F和下游引物AhPIF3-R各1μl，模板cDNA 1μl，H2O 22μl；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。
(2)将步骤(1)扩增获得的AhPIF3基因连接到pMD18-T载体上，得到AhPIF3-pMD18-T重组质粒；连接体系同实施例1(2)。
(3)AhPIF3-pMD18-T用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切，将双酶切后的目的基因片段连接到用相同酶切过的pCAMBIA2300-35s-ocs-AhFAD2B植物表达载体，经双酶切鉴定植物表达载体pCAMBIA2300-35s-ocs-AhFAD2B-AhPIF3构建成功。KpnⅠ和XbaⅠ的双酶切体系为质粒(AhPIF3-pMD18-T或pCAMBIA2300-35s-ocs-AhFAD2B)10μl，KpnⅠ1μl，XbaⅠ1μl，10×FastDigest Green Buffer 2μl,H2O 6μl；37℃酶切3min。连接体系为双酶切后的AhPIF3片段6.5μl，双酶切后的pCAMBIA2300-35s-ocs-AhFAD2B 2μl，T4ligase 1μl，10×T4 buffer1.5μl，H2O 4μl，16℃连接过夜。
(4)将步骤(3)中含有目的基因AhPIF3的重组植物表达载体利用液氮冻融法转化农杆菌菌株LBA4404感受态细胞，筛选出含有目的基因的重组农杆菌备用。
实施例3含有目的基因AhPIF3的△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体的转化
将实施2中制备的重组农杆菌转化花生，包括以下步骤：
(1)选取饱满的高油酸花生品种K17-15成熟种子单粒播种，株距20cm，选取20穴长势较优的作为受体植株；
(2)临近开花时期，每日上午进行观察，人工去花，防止其下针坐果，去花工作持续到盛花期来临；
(3)到达盛花期后，每天清晨6时至8时期间进行农杆菌注射，具体方法：用1ml一次性注射器吸入适量的农杆菌悬浮液，选取当天开放的花苞，将注射器扎进花萼管上部，针尖向下注射，可以看到菌液沿着花萼管直达子房基部，注意不要将花萼管折断；
(4)由于花生花期较长，有效的结实主要发生在基部的低节位，连续注射约14天后，每日人工去花，直到荚果成熟。
实施例4含有筛选基因△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体的表达检测
1、植物表达载体转化后代的单粒近红外检测
将实施例3收获的花生种子晒干后，用单粒近红外检测仪测定种子的油酸、亚油酸含量，部分结果如表1所示，非转基因对照K17-15的单粒近红外检测结果如表2所示。
2、转基因植株的PCR验证
提取实施例3中转基因种子的基因组DNA，以AhFAD2B基因为模板进行PCR扩增，扩增引物序列如下：
上游引物35sF2：5'-AGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC-3'(35s序列)
下游引物35sR2：5'-CCTGGTGGATTGTTCATGTAC-3'(FAD2B序列)；
PCR反应体系为1μl DNA模板，10μl ExTaq premix(2×)，1μl正向引物35sF2(10μM)，1μl反向引物35sR2(10μM)，H2O 7μl。PCR反应程序为：94℃5min；94℃40s，59℃40s，72℃1min，35个循环；72℃，10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证结果如图3所示。
3、转基因植株的进一步PCR验证
提取步骤2中阳性转基因种子的基因组DNA，以插入的目的基因AhPIF3的35s启动子为模板进行PCR扩增，扩增引物序列如下：
上游引物35sF4：5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAAA-3'
下游引物35sR4：5'-CTCCAAATGAAATGAACTTCCTTAT-3'；
PCR反应体系为2μl DNA模板，10μl Bioteke Taqmix(2×)，1μl正向引物35sF4(10μM)，1μl反向引物35sR4(10μM)，H2O 6μl。PCR反应程序为：94℃5min；94℃40s，61℃30s，72℃5min，35个循环；72℃，10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证结果如图4所示，经计算，油酸含量低于70％的转基因种子，其PCR结果约80％为阳性；油酸含量低于65％的转基因种子，其PCR结果约95％为阳性。
表1部分转基因种子的单粒近红外检测结果
表2非转基因对照K17-15的单粒近红外检测结果
结论：低油酸花生的△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B作为标记基因，可用于花生在遗传转化后代中的快速筛选，利用单粒近红外检测仪测定转基因种子的油酸含量≤65％时，说明转化成功，在不损伤种子的条件下，快速、高效的筛选出转化体。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心
<120> 一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> Arachis hypogaea Linn.
<400> 1
atgggagctg gagggcgtgt cactaagatt gaagctcaaa agaagcctct ttcaagggtt 60
ccacattcaa accctccatt cagtgttggc caactcaaga aagcaattcc accacattgc 120
tttgaacgtt ctcttttcat atcattctca tatgttgtct atgatctctt aatggcctac 180
ttactcttct acattgccac cacttatttc cacaagcttc catacccatt ttccttcctt 240
gcttggccaa tctattgggc catccaaggc tgcattctca ccggtgtttg ggtgattgct 300
catgagtgtg gccaccatgc cttcagcaag taccaacttg ttgatgacat ggttggtttg 360
acccttcact cttgtctatt agttccttat ttctcatgga aaatcagcca ccgccgccac 420
cactccaaca caggttccct cgaccgcgac gaagtgtttg tcccgaaacc aaaatcaaag 480
gtatcatggt ataacaagta catgaacaat ccaccaggga gggctatttc ccttttcatc 540
acactcacac taggatggcc cttgtacttg gccttcaatg tttctggcag accctatgat 600
agatttgcaa gccactatga cccttatgct cccatatact ctaacaggga aaggcttcta 660
atttatgtct cagattcatc tgtctttgct gtaacatatc tgctatatca catagcaact 720
ttgaaaggtt tgggttgggt ggtatgtgtt tatggggtgc cattgctcat tgtgaatggg 780
tttctagtta ccataaccta tttgcagcac acacatgcat cattgcctca ctatgattca 840
tccgaatggg actggttaag aggagcattg gcaacagtgg acagagatta tgggatactg 900
aataaggcat ttcatcatat aactgatacg catgtggctc atcatttgtt ctcaacaatg 960
cctcattacc atgcaatgga agcaaccaat gcaataaagc caatattggg tgattactac 1020
caatttgatg gcaccccagt ttacaaagca ttgtggagag aagccaaaga gtgcctctat 1080
gtggagccag atgatggagc ttctcagaag ggtgtttatt ggtacaagaa caagttctga 1140
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgggagctg gagggcgtgt 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcagaacttg ttcttgtacc aataa 25
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtctctctct acaaatctat ctctcatggg agctggaggg cgt 43
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctcacacatt attatggaga aactcagaac ttgttcttgt accaat 46
<210> 6
<211> 2196
<212> DNA
<213> Arachis hypogaea Linn.
<400> 6
atgccttttt atgagttata ccggctttct agagagaagc ttgatgaaga gattaatggc 60
acacgtgcaa ctgatcagtc tcaatcttcc tcgcctgaga aggatttttt cgagctaatt 120
tgggaaaacg gcaacatttt gacgacgcag ggtcagtcta gtagagctaa gaagagtcca 180
cctcgccgga gcttaccgtc tcactgcttg ccatctcaca gtcccaaggg tagagacaga 240
gatgcagggt atgttaacaa ttcaagggta gggaagtctg gtgatttaga caccggattg 300
aatgaaattt cgatgtcagt gccgtcgact gaagtggatt tgggtcatga tgatgatgtc 360
ataccttggt tggattatac aatggatggc tctttgcaga atgagtatgg ttctaatttc 420
ttacatgaac tatccggggt cacggatcaa gacttgccct caaatcattt ttcgcttgtg 480
gataaaagta gtggtaatca ggtatttagg gactctcata aaaattctgc agagcaaagc 540
aacttttcca gtgtttcttc gaccggcgta gatgagacaa ctagacctaa agctagcacg 600
gttgaatcat acctgccatc atcattcatt tcagttagac caagagtatc gggtgttact 660
gcgaacgata ccagtaatgc aatgcttcat ccaccagtta ccgagattcc ttcttcatcg 720
agtgattttt cgagcttaaa gatgcagaag caagatcaag ttattcctag caatggttca 780
tctgttatga atttctccca ttttgcaagg cctgccgcca tcgtgagagc taatcttcag 840
aacattggat tgaagtctgt ttcgtcttca acaagatctg aaaatgtgga aagtatgaat 900
aaaggtgctg ttgtacctag cagtaatctt ccagaatcaa ctcttgccga ttcatgtagt 960
gaatgtccaa aggttctaat ggggaacaat gagaaggctg tggaacaatc cagggatgat 1020
ttgaaactgt tggagtcaaa atctctcgaa cagaacattg ccggttctaa acaattagac 1080
cctacttgca aagagaaagc cattaaaatt gatcaaactt ccaaccgagc tcttggtgaa 1140
actgccacta acacacagat agctgttgaa agaagtacgg agctggtggt agcctcttcc 1200
tctgttggct ctggcaactg tgcagacaga ggttcagacg atccaattca aaatttgaag 1260
cggaaaaatc gagacactga ggactctgaa tggcatagtg atgatgttga ggaagaatca 1320
gtgggtgtta aaaaagcagc tgctgggcgt ggagcttcgg gttccaagag aagtcgtgct 1380
gctgaagtgc ataatctttc tgaaaggagg cgaagagata ggatcaacga gaagatgcgt 1440
gcattacaag aactcatacc caattgcaat aaggtggata aagcttcaat gctggatgag 1500
gctattgagt atcttaaaac acttcagctc caagttcaaa tgatgtcaat gggagccggt 1560
ttatatatgc atccgatgat gttgccacat ggaatgcagc acatgcatgc accacacttg 1620
gctccttttt cgcctatggc ctatggaatg caaatgggat tgggtatggg atatggcatg 1680
gctatgcctg atatgaatgg tgtatcatct cgattcccaa tggttcaggt tccccaaatg 1740
caaggaactc atgtccctgt tgcacaaatg tctggagcta ctgcaatggt tagatcaaat 1800
actcaagggt tcggggttcc aggtcaggga tttcccttgc cactccctcg tgcaccctta 1860
tttcctttct cgggagggcc ggttatgaac tcatcgtcgg ctttgggatt acgtccttgt 1920
ggagcaacag ggcttagtca aactgcggat ctggcgtcaa catctggctt aaaggaccct 1980
tcgccaaata cggattcact agttaagcaa agtactggtg gtggcggctg cgactcaact 2040
agtcagatgc ctacccagtg tgaagcagca ccaactgttg gatttgaaca gtcaccaatg 2100
gtacataata gcagccatac ctctgaggct aatgacagtg gaactcttaa tcctgacaaa 2160
gaagataata accttgtgac tggttatgat gattga 2196
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cccggtacca tgccttttta tgagttatac cg 32
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ccctctagat caatcatcat aaccagtcac a 31

Claims (9)

1.△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B作为标签在筛选转基因花生中的应用，所述△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，包括以下步骤：
(1)构建获得含有△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的植物表达载体，其中△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将步骤(1)中含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体转入高油酸花生，通过单粒近红外技术检测转化后代种子的油酸含量；
(3)当转化后代种子的油酸含量值≤65％时，转化后代种子为转化成功的转基因花生。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体的构建方法包括以下步骤：
a、以AhFAD2A和AhFAD2B均未发生突变的普通油酸花生基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B，其中上游引物FAD2B-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物FAD2B-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
b、将步骤a中扩增的AhFAD2B基因连接到pMD18-T载体上，得到AhFAD2B-pMD18-T重组质粒；
c、设计同源臂引物，扩增步骤b中AhFAD2B-pMD18-T重组质粒，获得含有同源臂的AhFAD2B基因，其中上游同源臂引物FAD2B-CZ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游同源臂引物FAD2B-CZ-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
d、内切酶XhoI单酶切植物表达载体pCAMBIA2300-35s-ocs，将新霉素磷酸转移酶II基因NeoR切掉；
e、利用同源重组的方法，将步骤c中含有同源臂的AhFAD2B基因与步骤d中酶切后的植物表达载体进行重组，获得含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体。
4.如权利要求3所示的植物表达载体的构建方法，其特征在于，步骤a中普通油酸花生为丰花1号花生品种。
5.如权利要求3所示的植物表达载体的构建方法，其特征在于，步骤a中PCR扩增的反应体系为：I-5Mix 25μl，上游引物FAD2B-F和下游引物FAD2B-R各1μl，DNA模板1μl，H2O 22μl；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。
6.如权利要求3所示的植物表达载体的构建方法，其特征在于，步骤b中得连接反应体系为：Topo Mix 1μl，007blunt Vector 1μl，步骤(1)PCR产物1μl，H2O 7μl；室温下反应5min。
7.如权利要求3所示的植物表达载体的构建方法，其特征在于，步骤c中扩增的反应体系为：I-5Mix 25μl，上游同源臂引物FAD2B-CZ-F和下游同源臂引物FAD2B-CZ-R各1μl，AhFAD2B-pMD18-T模板1μl，H2O 22μl；扩增反应程序为98℃预变性2min；98℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。
8.一种重组菌株，其特征在于，含有上述重组的△12-脂肪酸脱氢酶基因植物表达载体的菌株。
9.如权利要求8所示的重组菌株，其特征在于，所述菌株为农杆菌。
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