CN101173277A - 一种获得转基因玉米的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得转基因玉米的方法。该获得转基因玉米的方法，是将含有外源目的DNA、并以木糖异构酶基因为筛选标记的重组真核细胞表达载体导入玉米中，在含有D－木糖的愈伤组织诱导培养基中筛选愈伤组织，得到转基因玉米。本发明获得转基因玉米的方法中的筛选体系摒弃了存在潜在安全隐患争议的抗生素和除草剂，利用植物自身代谢产物——木糖为选择剂，是一种较为安全的新型筛选体系，可以提高玉米遗传转化自交系改良的成功率，并降低潜在生物安全隐患。

Description

一种获得转基因玉米的方法

技术领域

本发明涉及一种获得转基因玉米的方法。

背景技术

自1983年第一株转基因植物诞生以来，全球抗虫、抗病、抗除草剂和品质改良的棉花、水稻、大豆、玉米等转基因植物已达120多种，种植面积9000万公顷。在基因工程中将外源目的基因导入植物体，并筛选出极少量的转化细胞，建立一套高效安全的选择方法极为重要。到目前为止广泛用于选择的标记基因主要有两大类：一类是抗生素类，包括新霉素磷酸转移酶基因(npt)、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、卡那霉素抗性基因(npt II)等；另一类是抗除草剂类，包括草丁膦抗性基因(bar)、草甘膦抗性基因(epsp)等。这些存在于转基因植物中的具有抗生素或除草剂抗性的标记基因是否会对环境及人类健康有不良影响和损害的争论自转基因植物诞生以来一直是人们关注的中心。

目前，最为有效的办法就是利用无争议的生物安全标记基因。近年来发现的生物安全标记基因主要有绿色荧光蛋白基因(gfp)、核糖醇操纵子(rtl)、甘露糖异构酶基因(pmi)等。

木糖是半纤维素的主要组成部分，是自然界中含量仅次于葡萄糖的第二丰富的糖类。自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径有两条，其一存在于可利用木糖的真菌中，由木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)共同作用下完成，NAD(P)H和NAD⁺分别作为XR和XDH的辅酶；其二主要存在于细菌中，通过木糖异构酶(XylA)一步转化木糖为木酮糖，并且不需要任何辅助因子。

在离体培养过程中，几乎所有高等植物都不能以木糖作为唯一碳源。在大肠杆菌中，D-木糖能被木糖异构酶催化，转变成木酮糖，再经过磷酸戊糖途径分解代谢，为细菌生长所利用。Vieille等成功地克隆并表达了木糖异构酶基因(xylA)，xylA编码一个444个氨基酸残基的多肽，该多肽的分子量为50892(Vieille等，Bivalent cations andamino-acid composition contribute to the thermostability of Bacillus licheniformis xyloseisomerase.European Journal of Biochemistry 268：6291-6301，2001)，该酶最适pH为7.1，但在较宽的pH范围内都具有相当高的活性(Sriprapundh等，Directed evolution ofThermotoga neapolitana xylose isomerase：high activity on glucose at low temperature andlow pH.Protein Engineering Design & Selection 16：683-690，2003)。

利用生物安全标记基因代替抗生素基因、抗除草剂基因进行外源目的基因的筛选，是今后基因工程研究的一个重要方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种获得转基因玉米的方法。

本发明所提供的获得转基因玉米的方法，是将含有外源目的DNA、并以木糖异构酶基因为筛选标记的重组真核细胞表达载体导入玉米中，在含有D-木糖的愈伤组织诱导培养基中筛选愈伤组织，得到转基因玉米。

其中，所述用于筛选的愈伤组织诱导培养基中D-木糖的浓度具体可为15-30g/L。

所述用于筛选的愈伤组织诱导培养基的基本培养基可为N6基本培养基；所述用于筛选的愈伤组织诱导培养基还含有7g/L硝酸银、0-15g/L的蔗糖，和4mg/L的2，4-D。

上述方法中，筛选得到的玉米愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养，分化出的苗转入生根培养基中培养得到转基因玉米植株。

所述分化培养基中可含有浓度为15-30g/L的D-木糖。

所述分化培养基的基本培养基具体可为N6基本培养基；所述分化培养基还含有1.5mg/L KT、0-15g/L蔗糖和4mg/L的2，4-D。

上述方法中，所述木糖异构酶的氨基酸序列如GenBank Accession No.X04691所示。

所述木糖异构酶的编码序列具体可为GenBank Accession No.X04691的自5′端第201位至1535位脱氧核糖核苷酸。

本发明克隆了大肠杆菌的木糖异构酶基因xylA，将其作为玉米遗传转化的筛选标记，并比较在不同木糖浓度的筛选培养基上的转化效率，旨在建立以D-木糖为选择剂的玉米愈伤组织的再生体系。结果表明，利用该筛选标记可以在含有不同浓度木糖的培养基上筛选出玉米再生植株，其中15-30g/L木糖的总体筛选效果较好，虽然在30g/L木糖的选择培养基上，愈伤组织体积小、褐化严重、抗性愈伤率低，但从此培养基上筛选的愈伤组织其再生频率和移栽成活率较高，故30g/L木糖筛选的综合效果较好，木糖在筛选体系中不仅为植物细胞的生长提供碳源还对愈伤组织的分化和再生起了一定的促进作用。通过DNA点杂交、PCR及PCR-Southern等不同检测方法对分子水平的木糖异构酶和目的基因进行检测，证明外源筛选标记基因已经整合到转基因玉米中，并可以在玉米中稳定表达，说明该筛选标记基因可用于玉米的遗传转化。

本发明获得转基因玉米的方法中的筛选体系摒弃了存在潜在安全隐患争议的抗生素和除草剂，利用植物自身代谢产物--木糖为选择剂，是一种较为安全的新型筛选体系，可以提高玉米遗传转化自交系改良的成功率，并降低潜在生物安全隐患。

附图说明

图1为大肠杆菌木糖异构酶基因(xylA)的克隆与表达载体的构建

A为大肠杆菌木糖异构酶基因(xylA)的克隆

B为重组载体pBAC405经BamHI和SacI酶切后的酶切鉴定结果

图2为重组载体pBAC405的结构示意图

图3为含有木糖异构酶基因(xylA)的玉米愈伤组织诱导、植株分化与移栽照片

A为含有木糖异构酶基因(xylA)的玉米愈伤组织诱导

B为转基因小苗在含有D-木糖的培养基上的分化情况

C为含有木糖异构酶基因(xylA)的转基因再生植株

D为含有木糖异构酶基因(xylA)的转基因植株的温室移栽情况

图4为含有木糖异构酶基因(xylA)的玉米转化植株的DNA点杂交结果

图5为转基因植株木糖异构酶基因(xylA)的PCR检测结果

图6为转基因植株木糖异构酶基因(xylA)的PCR-Southern检测结果

具体实施方式

玉米自交系178、478、501和ZP501K，为通用自交系材料，由北京市农林科学院生物技术研究中心提供。限制性内切酶购自NEB公司，pGEM-T easy Vector购自Promega公司，Tag酶购自TaKaRa公司，大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α购于天根公司。

实施例1、以木糖异构酶基因(xylA)为筛选标记的表达载体pBAC405的构建

1、木糖异构酶基因(xylA)的克隆与序列分析

提取大肠杆菌DH5α的基因组DNA，根据已发表E.coli的xylA基因序列(GenBankAccession No.X04691，201～1535，1335bp)设计上下游引物，上游引物P₁(5’-GGATCCATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3’)、下游引物P₂(5’-GAGCTCATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3’)。上下游引物分别引入酶切位点BamHI和SacI，并在下游引物上加入两个连续的终止密码子，以确保木糖异构酶正确表达并及时终止。以所设计的xylA基因特异引物进行PCR扩增，克隆出xylA基因片段，然后进行电泳检测，电泳结果如图1中A，表明得到了1.4kb的木糖异构酶基因(xylA)片段。图1中A，M：1kb ladder分子量标记；1、2、3：xylA基因PCR扩增结果。

凝胶回收并纯化1.4kb的木糖异构酶基因(xylA)片段，与pGEM-T easy Vector进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切鉴定。将酶切检测结果正确的质粒送到上海生工进行Sp6/T7双向测序。测序结果表明，所克隆序列与GenBank Accession No.X04691的自5′端第201位至1535位脱氧核糖核苷酸相同。将含有该xylA片段的重组载体命名为pTxylA。

2、以木糖异构酶基因(xylA)为筛选标记的表达载体pBAC405的构建

1)用SacI和EcoRI从p35SGFP(美国Clontech公司)切下260bp的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(Nos)的终止子(Nos3’)，插入到克隆载体pSP72(2462bp)(购自美国Promega公司的)的SacI和EcoRI位点，得到重组载体pBPC18。

2)以质粒p35SGFP为模板，用上游引物5’-CTG AAG CTT GCG GCC GCT TCG GCC GTCTAG；与下游引物5’-GGC CTG CAG GTC GTC CTC TCC AAA TGA AAT，进行PCR，扩增得到460bp大小的CaMV 35S启动子。将该扩增产物用HindIII和PstI双酶切后插入到pBPC18的HindIII和PstI酶切位点之间，得到重组载体pBPC25。

3)以玉米(品种：黄早四)基因组DNA为模板，用玉米脱氢酶基因第1个内含子的上游引物5’-CAG GTC GAC GGA TCA AGT GCA AAG G；与下游引物5’-GAT GGA TCC GTCCGC AGC TGC ACG GGT，进行PCR，扩增得到560bp大小的Adh1基因第1个内含子。将该PCR产物用SalI和BamHI双酶切后插入到pBPC25的SalI和BamHI酶切位点之间，得到重组载体pBPC28。

4)将质粒pBPC28用HindIII酶切，用DNA聚合酶Klenow大片段补平后，与含有EcoRI酶切位点的连接子(linker，5’-CCGGAATTCCGG)连接，得到重组载体pBPC29。

5)凝胶回收pTxylA经BamHI、SacI双酶切产生的约1.4kb目标片段xylA，插入到质粒pBPC29的BamHI和SacI识别位点之间，将两片段连接并转化E.coli DH5α，获得的阳性克隆命名为pBAC405。对pBAC405进行酶切检测，结果如图1中B，结果表明，得到了1.4kb大小的插入片段和4kb的载体片段。图1中B，M：1kb ladder分子量标记；4、5、6、7：pBAC405经BamHI和SacI酶切后的酶切鉴定结果。pBAC405的结构示意图如图2。

实施例2、玉米幼胚愈伤组织在不同木糖浓度的培养基上的筛选及再生

取玉米自交系178、478、501和ZP501K授粉后10～11d的玉米幼胚(大小为1～2mm)，放入幼胚愈伤诱导培养基(N6基本培养基，10mg/L硝酸银，7g/L琼脂，100mg/L肌醇，30g/L蔗糖，pH5.8)中，26℃下暗培养1～2周。按张晓东等人(2003)(张晓东，梁荣奇，陈绪清，杨风萍，张立全。优质HMW谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析，科学通报，48(5)：474-479，2003。)的方法进行基因枪微弹的制备。用PDS1000/He系统对以上4种材料的幼胚愈伤组织进行转化，基因枪转化后的愈伤组织，26℃下暗培养1周，转入含有不同D-木糖浓度梯度0％(0g/L)、33％(10g/L)、50％(15g/L)、80％(24g/L)和100％(30g/L)的筛选培养基(N6基本培养基+硝酸银7g/L+2，4-D 4mg/L，琼脂粉7g/L)上继续暗培养2～3周，筛选玉米幼胚愈伤组织。

表1中的数据是抗性愈伤率(％)(是经过筛选后正常状态的愈伤组织(质地松软、颗粒状、颜色淡黄)与总愈伤组织的百分比)。自交系178总共转化了4505个愈伤组织，每种浓度木糖筛选培养上筛选901个愈伤组织，在0％、33％、50％、80％和100％木糖筛选培养基上分别得到721、525、411、361、318个抗性愈伤组织；自交系478总共转化了8501个愈伤组织，每种浓度木糖筛选培养上筛选1700个愈伤组织，在0％、33％、50％、80％和100％木糖筛选培养基上分别得到1700、743、755、1061、661个抗性愈伤组织；自交系ZP501K总共转化了2122个愈伤组织，每种浓度木糖筛选培养上筛选424个愈伤组织，在0％、33％和50％木糖筛选培养基上分别得到424、115、162个抗性愈伤组织，80％和100％木糖筛选培养基上的愈伤由于污染未得到数据；自交系501总共转化了8550个愈伤组织，每种浓度木糖筛选培养上筛选1710个愈伤组织，在0％、33％、50％、80％和100％木糖筛选培养基上分别得到1539、1082、979、799、1079个抗性愈伤组织。具体结果如表1所示，表明同一基因型的玉米自交系在不同木糖浓度的筛选培养基上的抗性愈伤率(％)有差异，总体趋势是抗性愈伤率(％)随着木糖浓度的提高而降低。当木糖浓度达到33％以上，抗性愈伤率(％)几乎降低1倍，随着木糖浓度的提高，愈伤组织的质地变差，在100％木糖的选择培养基上，愈伤组织体积小、褐化严重。

表1不同浓度木糖筛选培养基上抗性愈伤率(％)

其中，含有0％D-木糖的筛选培养基的组成为N6基本培养基+硝酸银7g/L+2，4-D 4mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L，pH5.8)，含有33％D-木糖的筛选培养基的组成为N6基本培养基+硝酸银7g/L+2，4-D 4mg/L+蔗糖20g/L+D-木糖10g/L，琼脂粉7g/L，pH5.8)，含有50％D-木糖的筛选培养基的组成为N6基本培养基+硝酸银7g/L+2，4-D 4mg/L+蔗糖15g/L+D-木糖15g/L，琼脂粉7g/L，pH5.8)，含有80％D-木糖的筛选培养基的组成为N6基本培养基+硝酸银7g/L+2，4-D 4mg/L+蔗糖6g/L+D-木糖24g/L，琼脂粉7g/L，pH5.8)，含有100％D-木糖的筛选培养基的组成为N6基本培养基+硝酸银7g/L+2，4-D 4mg/L+D-木糖30g/L，琼脂粉7g/L，pH5.8)。

将上述自交系178、478、501、ZP501K的经过不同木糖浓度诱导培养基上选择形成的抗性愈伤组织(愈伤组织质地差和褐化的愈伤组织未计算在内)，转入到含有50％木糖浓度的分化培养基(N6基本培养基+KT 1.5mg/L+蔗糖15g/L+D-木糖15g/L，琼脂粉7g/L，pH5.8)进行分化培养，在26℃分化培养24-30天，分化结束后转入无选择压的培养基(MS基本培养基+蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L，pH5.8)上壮苗生根，炼苗3～5天后，带基质移栽至大田。具体结果如表2。生长在无选择剂培养基上的对照愈伤在转入含有50％木糖的分化培养基后，由于突然接触筛选剂其再生效率明显降低，其它木糖浓度筛选出的愈伤组织总数少但再生效率随着初始筛选浓度的增高而增大。玉米自交系幼胚愈伤的诱导、分化与移栽见图3。

37株移栽成活的转基因玉米株系：478的再生株系10株，其中，来自33％、50％、80％、100％木糖浓度筛选的分别为1株、5株、1株、3株；ZP501K的再生株系2株，都是来自50％木糖浓度的筛选结果；178的再生株系13株，其中，来自33％、50％、80％、100％木糖浓度筛选的分别为2株、7株、2株、2株；501的再生株系12株，其中，来自50％、80％、100％木糖浓度筛选的分别为5株、2株、5株；进行人工授粉自交结实。24株成活T₀代转基因植株正常结实：178的再生株系8株，其中，来自33％、50％、80％、100％木糖浓度筛选的分别为1株、4株、2株、1株；ZP501K的再生株系1株，都是来自50％木糖浓度的筛选结果；478的再生株系7株，其中，来自33％、50％、80％、100％木糖浓度筛选的分别为1株、4株、1株、1株；；501的再生株系8株，其中，来自50％、80％、100％木糖浓度筛选的分别为4株、1株、3株。

表2四个自交系在不同浓度的木糖选择压力获得愈伤组织的植株分化情况

筛选培养基的木糖浓度	抗性愈伤组织数(个)	再生植株数(株)	再生频率(％)	移植成活的植株数(株)	移植成活率(％)
						0％(ck)	821	9	1.10	1	11
33％	115	3	2.60	1	33
						50％	1198	25	2.09	20	80

80％	96	5	5.21	3	60
						100％	120	16	13.33	12	75

玉米幼胚的抗性愈伤率(％)、再生频率及移栽成活率(表1，表2)结果表明：50％～100％木糖筛选浓度的总体筛选效果较好。具体的木糖筛选效率还要考虑玉米基因型的影响。

实施例3、178、478、501、ZP501K的转基因再生玉米株系中木糖异构酶的检测

1、转基因玉米的DNA点杂交和PCR检测木糖异构酶筛选标记基因

按CTAB法提取实施例2中移栽成活的24株结实的T₀代转基因植株玉米叶片基因组DNA，将基因组DNA按Bio-Rad公司Bio-Dot点杂交的使用手册进行点膜。按Roche公司的DIG DNA Labling and Detection Kit的使用手册进行杂交和检测。用地高辛(DIG)标记按照实施例1中的方法得到的1.4kb xylA基因作为探针，对24株结实的T₀代转基因植株进行DNA点杂交检测，如图4所示，表明17株转化株有较强信号。图4中A1、C1：质粒pBAC405；A2、C2：阴性对照株(为178非转基因植株)；A3、C3：阴性对照株(为478非转基因植株)；A4、C4：空白对照(蒸馏水)；其他：假定转入重组质粒pBAC405的转化株。结果有17株信号较强，说明有17株再生玉米植株可能有外源xylA基因的转入。上述初步筛选的17株阳性植株再利用xylA基因的特异引物P₁和P₂进行PCR检测，结果如图5所示，图5中M：1kb ladder分子量标记；1：质粒pBAC405；2：阴性对照株(178的非转基因植株)；3～19：转入木糖异构酶基因的株系。其中有14株扩增出1.4kb目标条带，其中，玉米自交系178、478、501、ZP501K分别5株、2株、6株和1株。说明点杂交初筛的17株T₀代转基因植株有3株为假阳性植株，另外14株的木糖异构酶基因已经整合到玉米基因组中。

2、转基因玉米的PCR-Southern杂交检测

按照Roche公司PCR DIG Probe Synthesis Kit的使用手册提供的步骤，用地高辛(DIG)标记按照实施例1中的方法得到的1.4kb xylA基因作为探针，对17株点杂交检测为阳性的T₀代转基因幼苗再进行PCR-Southern杂交检测。对17株点杂交检测为阳性的T₀代转基因幼苗的基因组DNA利用xylA基因的特异引物P₁和P₂进行PCR扩增，将PCR产物按照785型真空吸印仪(Bio-Rad)使用手册进行DNA转膜，信号检测按照Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit的使用手册提供的方法进行。

结果如图6所示，图6中M：1kb ladder分子量标记；1：阳性对照质粒pBAC405；2：178非转基因植株；3：空白对照(蒸馏水)；4～20：转入木糖异构酶基因的植株。杂交结果表明，泳道1的阳性对照质粒在1.4kb处有特异条带，而泳道2的非转基因植株和泳道3的空白对照没有出现特异杂交信号。泳道4～20的转基因植株，14株经步骤1的PCR检测为阳性的转化植株在1.4kb处有特异条带。分子杂交进一步说明了14株转化植株的外源基因xylA已经整合到了玉米基因组中。

序列表

<160>6

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ggatccatgg agttcaatat gcaagccta        29

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gagctcatta tttgtcgaac agataatggt tt    32

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctgaagcttg cggccgcttc ggccgtctag       30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggcctgcagg tcgtcctctc caaatgaaat       30

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

caggtcgacg gatcaagtgc aaagg            25

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gatggatccg tccgcagctg cacgggt          27

Claims (10)

1.一种获得转基因玉米的方法，是将含有外源目的DNA、并以木糖异构酶基因为筛选标记的重组真核细胞表达载体导入玉米中，在含有D-木糖的愈伤组织诱导培养基中筛选愈伤组织，得到转基因玉米。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述用于筛选的愈伤组织诱导培养基中D-木糖的浓度为15-30g/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述D-木糖的浓度为30g/L。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述用于筛选的愈伤组织诱导培养基的基本培养基为N6基本培养基；所述用于筛选的愈伤组织诱导培养基还含有7g/L硝酸银、0-15g/L的蔗糖和4mg/L的2，4-D。

5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，筛选得到的玉米愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养，分化出的苗转入生根培养基中培养，得到转基因玉米植株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述分化培养基中含有浓度为15-30g/L的D-木糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述分化培养基中含有浓度为15g/L的D-木糖。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述分化培养基的基本培养基为N6基本培养基；所述分化培养基还含有1.5mg/L的KT、0-15g/L蔗糖和4mg/L的2，4-D。

9.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述木糖异构酶的氨基酸序列如GeneBank Accession No.X04691所示。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于：所述木糖异构酶的编码序列为GenBankAccession No.X04691的自5′端第201位至1535位脱氧核糖核苷酸。

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