CN102899350A - 一种无抗生素筛选标记在麻疯树基因转化中的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无抗生素筛选标记在麻疯树基因转化中的应用方法，该方法构建了甘露糖无抗生素筛选标记载体，通过农杆菌介导将磷酸甘露糖异构酶（PMI基因）和报告基因（GUS基因）转入麻疯树细胞中，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，并且通过PCR方法对转基因植株进行检测，说明被转化基因在细胞中得到了表达。采用本发明提供的技术方案，对麻疯树叶盘的转化能成功地获得了抗性不定芽，甘露糖无抗生素标筛选的遗传转化率达到10%以上，是抗生素标记的2倍，转化效率高，检测方便，提高了转基因植物的生物安全性，能有效消除抗生素对环境潜在的不利影响。
Description
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种无抗生素筛选标记在麻疯树基因转化中的应用方法。
背景技术
麻疯树是国际上研究最多的能生产生物柴油的能源植物之一，开展遗传转化能极大的促进麻疯树遗传育种的研究。鉴于麻疯树基因转化工作难度大，目前国内外关于这方面的报道还不是很多，而且已有研究用于麻疯树转化的选择标记系统都是采用潮霉素、卡拉霉素等抗生素或除草剂进行抗性筛选。这类药物对植株转化有较大影响，会影响转化细胞的生长及再生，尤其是像麻疯树这类的木本植物，采用传统的抗生素或除草剂等筛选方法获得转基因芽、再生根相当困难。另外，标记基因的安全性从一开始就受到了广泛争论。虽然也有不少手段可以去除转基因植物中的标记基因。但大多效率不高，或者需要进行子代杂交，这对木本植物来说不是十分现实。随着研究的不断深入，甘露糖筛选体系作为一种新型正向的筛选方法已受到了越来越多的人的关注。该体系是以大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因PMI为筛选标记基因，D-甘露糖为筛选剂进行筛选。1998年Joersbo小组报道了首例PMI转基因甜菜，随后对影响转化效率的因素作了大量的研究。虽然PMI/甘露糖筛选体系研究历史较短，仅有部分植物采用了该体系，但有由模式植物向经济作物发展的趋势。对一些难生根的作物，尤其是木本植物，相对抗生素筛选而言，甘露糖筛选对转基因芽生根能力的抑制要轻得多。2003年巴西的Boscariol等用带有PMI基因的农杆菌感染4种甜橙实生苗上胚轴，以甘露糖为碳源和筛选剂，其转化率在3%~23.8%之间，表明了该体系的有效性和安全性。
虽然PMI/甘露糖筛选体目前已成功用于甜菜、拟南芥、玉米、小麦、水稻、大麦等多种植物转化，在木本植物甜橙和葡萄等上也有研究。但在麻疯树遗传转化中还尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是在于克服现有技术的不足，提供一种利用PMI（磷酸甘露糖异构酶）/甘露糖筛选体系在麻疯树基因转化中的应用方法，以提高麻疯树基因转化的效率。
为达到以上目的，本发明的技术方案为：
一种无抗生素筛选标记在麻疯树基因转化中的应用方法，依次包括以下步骤：
1)克隆6磷酸-甘露糖异构酶基因（该基因序列在ncbi上面公开），构建甘露糖筛选标记的植物表达载体，并将载体导入农杆菌中；
2）将经过预培养的麻疯树的叶盘外植体与农杆菌在感染培养基中感染转化，然后在共培养培养基中共培养，再依次转入筛选培养基、芽伸长培养基和生根培养基中进行培养，获得转基因植株。
步骤1）所述的植物表达载体是双元载体pC1304PMI，（由6磷酸-甘露糖异构酶基因替换植物表达载体中的hpt基因）包含6磷酸-甘露糖异构酶基因和GUS报告基因。
步骤2）中麻疯树的叶盘外植体预培养的培养基：MS培养基中含1mg/LTDZ,0.5mg/LIBA,1.5mg/L6-BA,2mg/LSNP；SNP是Sodium Nitroprusside（硝普钠），TDZ是一种细胞分裂素，全称是Thidiazuron。
感染培养基：用MS液体培养基稀释农杆菌菌液30倍得到，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，
共培养培养基：SR预培养基。
步骤2）所述的筛选培养基：SR培养基中含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖为糖源，附加500mg/L头孢霉素。
步骤2）所述的芽伸长培养基：MS培养基中含0.1mg/L6-BA和0.005mg/LIBA，附加500mg/L头孢霉素；
生根培养基：MS培养基中含0.3mg/LIBA，附加500mg/L头孢霉素。
步骤2）中麻疯树的叶盘外植体的预培养过程如下：选取生长旺盛的麻疯树顶端幼嫩叶片，在无菌条件下用质量浓度20%的NaClO溶液（有效氯浓度为2%）消毒20分钟，无菌水洗涤三遍，切成大小为9mm2叶盘，近轴端朝上置于SR培养基中预培养14天，再进行感染转化。
所述的感染培养基的制备过程如下：通过电转化法将载体pC1304PMI导入根癌农杆菌GV3101中，将转化细菌的单个菌落接种到含50mg/L卡拉霉素和50mg/L利福平的液体LB培养基中；在28℃下培养细菌生长直到OD600值达到0.6，得到农杆菌菌液，然后用MS 液体培养基稀释30倍，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，作为感染培养基。
步骤2）中具体是将预培养后的叶盘浸泡于感染培养基中10分钟，取出外植体，用灭菌滤纸吸干外植体表面的菌液，将浸泡过的外植体接种到SR培养基中在25℃在黑暗条件下共培养2天，直至在培养基上看到菌斑。
本发明方法中将共培养后的外植体转入筛选培养基，在25℃黑暗条件下培养三周，将得到的抗性芽从愈伤组织上转移到芽伸长培养基进行抗性芽的拉长培育，当拉长的抗性芽高度达到2厘米时，转入生根培养基中培养20天，得到转化植株。
本发明的优势:
己报道的麻疯树农杆菌介导的转化中一般都利用抗生素进行筛选，抗生素的筛选加大了愈伤的死亡率，转化率仅5%左右。本发明克服了现有技术的不足，打破了麻疯树遗传转化基因型的限制，利用甘露糖为选择剂，研制了一种简便高效的农杆菌转化方法。本发明所采用农杆菌介导遗传转化的麻疯树转化率最高达到10%(见表1)，对得到的抗性苗通过PCR检测，验证转化成功。本发明的方法简单，操作简便，结果可靠，生物安全性高，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1：筛选培养基中的麻疯树抗性芽，
A为从外植体中移植的抗性芽；B为在芽伸长培养基中培养30天后的伸长芽；
图2：不同的选择性标记对麻疯树叶盘转化的影响，
A和B为甘露糖筛选的外植体，C和D为卡拉霉素筛选的外植体；
图3：PCR检测图谱分析从甘露糖抗性植株叶片上分离出的DNA进行引物特异性扩增的484-bp片断GUS基因，
泳道1为阳性对照，泳道2-3为水的空白对照，泳道4-5为阴性对照（未转化的植株），泳道6-17为甘露糖抗性植株；其中有条带的是阳性，无条带是假阳性。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。
实施例1
1.农杆菌介导的无抗生素转化麻疯树
从温室取幼嫩叶片消毒后，切成9mm2，将叶片的远轴面置于培养基中预培养14天，再进行转化。构建双元载体pC1304PMI，其中包括PMI基因（即6磷酸-甘露糖异构酶基因）作为筛选基因和GUS基因作为报告基因，（pC1304PMI载体是根据文献方法构建的，参考文献：PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及其在雪柑转基因中的应用农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(5):858-864。）。通过电转化法将载体导入根癌农杆菌GV3101（购于北京北纳创联生物技术研究院）中，将转化细菌的单个菌落接种到含50mg/L卡拉霉素和50mg/L利福平的液体LB培养基中。在28℃下培养细菌生长直到OD600值达到0.6，然后用MS液体培养基稀释30倍，用作为感染培养基。在感染培养基中添加诱导剂乙酰丁香酮0.02mmol/L，将预培养14天的叶盘培养物接种在感染培养基中培养10分钟，再转入SR培养基中在25℃黑暗条件下进行共培养。共培养2天后，将外植体转入筛选培养基（SR预培养基含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖为糖源，附加500mg/L头孢霉素控制细菌生长），三周后，将抗性芽从愈伤组织上转移到含500mg/L头孢霉素的芽伸长培养基中进行用于抗性芽的拉长培育，拉长的抗性芽达到2厘米高度时，转入含500mg/L头孢霉素的生根培养基中培养20天，结果见图1。使用甘露糖和卡拉霉素两种选择性标记方法比较其转化效率，见表1、图2，甘露糖无抗生素标筛选的遗传转化率达到10%以上，是抗生素标记的2倍。
以上出现的培养基配方如下：
麻疯树的叶盘外植体预培养的培养基（即SR培养基）：MS培养基中含1mg/LTDZ,0.5mg/LIBA,1.5mg/L6-BA,2mg/LSNP；
感染培养基：用MS液体培养基稀释农杆菌菌液30倍得到，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，
共培养培养基：SR培养基。
筛选培养基：SR培养基中含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖为糖源，附加500mg/L头孢霉素。
芽伸长培养基：MS培养基中含0.1mg/L6-BA和0.005mg/LIBA，附加500mg/L头孢霉素；
生根培养基：MS培养基中含0.3mg/LIBA，附加500mg/L头孢霉素。
2.PCR检测转基因植株
使用CTAB法从转基因植株中提取DNA基因组。为了验证引进的GUS基因在再生植株中的存在，PCR扩增GUS基因编码区484bp的片段，使用正向引物，GUSF (5’-AGCGTTGAACTGCGTGAT-3’)，和反向引物GUSR(5’-GTTCTTTCGGCTTGTTGC-3’)。根据下列条件，在DNA热循环仪中进行PCR反应：94℃间5分钟，后为94℃下30秒，55℃下30秒，重复30个循环，最后在72℃下延长7分钟。取PCR产物在电压为120V，1%琼脂糖凝胶中跑电泳15分钟，凝胶成像系统中紫外灯照射，可看到特异性条带大小为484bp，结果见图3，根据PCR产物带型可知被测得12株转化植株中有6株阳性植株，验证了GUS在再生植株基因中的存在。
3.影响农杆菌介导麻疯树转化因素的分析
选择性标记的甘露糖（PMI）和头孢霉素控制农杆菌生长。为了评估对愈伤组织的形成，将外植体（3毫米×3毫米叶盘）放置在含有5mg/L6-BA和1mg/l IBA的MS培养基中，再添加不同比例甘露糖/蔗糖(0g/30g、5g/25g、10g/20g·、15g/15g、20g/10g、25g/5g·和30g/0g·L-1)，或不同浓度的头孢霉素（0mg/L、300mg/L、500mg/L和800mg/L）。每个处理（甘露糖或头孢霉素）有3个重复，和每一个重复由30个叶盘外植体组成，在黑暗培养一个月后，形成愈伤组织，结果见表2，当甘露糖/蔗糖浓度为20g·L-1/10g·L-1，此时浓度为临界浓度，转化进去细胞的能够筛选出来，能为转化提供最佳的筛选压力，从愈伤组织的生长情况可以知道附加头孢霉素浓度为500mg/L时，是抑制农杆菌的最佳浓度，且不对愈伤组织的诱导产生影响。能有效减少细菌的增长。
为了优化转化效率，对多种参数进行了检测。在感染培养基中添加不同浓度的诱导剂乙酰丁香酮（0、0.02、0.1和0.5mmol/L），结果见表3，乙酰丁香酮对转化有显著性影响，乙酰丁香酮浓度为0.02mmol/L时抗性不定芽的诱导率最高。将预培养14天的叶盘培养物接种在感染培养基中培养10、30和60分钟，再转移到SR培养基中在25℃在黑暗条件下共培养2、3和4.5天，同时检测接种过程中超声（0、5、10、20和30s）时间对转化效率的影响。结果表明共培养时间、感染培养时间和超声时间对抗性不定芽的诱导率都没有显著性的影响，但是随着共培养的时间的延长，叶盘（愈伤组织）容易变黄死亡，故共培养时间选择为2天。
4.数据分析
诱导不定芽的实验中，每次处理包括3个重复，每个重复由30个叶盘外植体组成。不定芽诱导率，以百分比表示，以形成不定芽外植体数的比例计算。不定芽诱导率(%)=再生叶片数/接种叶片总数×100，平均诱导芽数=再生不定芽总数/接种叶片总数。所有数据均采用SPSS数据分析软件进行统计分析，包括一个方差分析（ANOVA）检测不同方法之间的显著性差异，和邓肯的多范围测试（DMRT），在5％的概率水平比较不同方法的显著性，数据变异性在标注误差的范围之内。
表1：不同的选择性标记对麻疯树叶盘转化的影响
注：**表示差异极显著p<0.01，同列中不同字母表示差异显著性p<0.05
表2：甘露糖和头孢霉素浓度对麻疯树愈伤组织诱导的影响
表3：乙酰丁香酮对麻疯树叶盘转化的影响
注：**表示差异极显著p<0.01，同列中不同字母表示差异显著性p<0.05。
Claims (9)
1.一种无抗生素筛选标记在麻疯树基因转化中的应用方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
1)克隆6磷酸-甘露糖异构酶基因，构建甘露糖筛选标记的植物表达载体，并将载体导入农杆菌中；
2）将经过预培养的麻疯树的叶盘外植体与农杆菌在感染培养基中感染转化，然后在共培养培养基中共培养，再依次转入筛选培养基、芽伸长培养基和生根培养基中进行培养，获得转基因植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的植物表达载体是双元载体pC1304PMI，包含6磷酸-甘露糖异构酶基因和GUS报告基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤2）中麻疯树的叶盘外植体预培养的培养基：MS培养基中含1mg/LTDZ,0.5mg/LIBA,1.5mg/L6-BA,2mg/LSNP；
感染培养基：用MS液体培养基稀释农杆菌菌液30倍得到，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，
共培养培养基：SR预培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤2）所述的筛选培养基：SR培养基中含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖为糖源，附加500mg/L头孢霉素。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤2）所述的芽伸长培养基：MS培养基中含0.1mg/L6-BA和0.005mg/LIBA，附加500mg/L头孢霉素；
生根培养基：MS培养基中含0.3mg/LIBA，附加500mg/L头孢霉素。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤2）中麻疯树的叶盘外植体的预培养过程如下：选取生长旺盛的麻疯树顶端幼嫩叶片，在无菌条件下用质量浓度20%的NaClO溶液消毒20分钟，无菌水洗涤三遍，切成大小为9mm2叶盘，近轴端朝上置于SR培养基中预培养14天，再进行感染转化。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述的感染培养基的制备过程如下：通过电转化法将载体pC1304PMI导入根癌农杆菌GV3101中，将转化细菌的单个菌落接种到含50mg/L卡拉霉素和50mg/L利福平的液体LB培养基中；在28℃下培养细菌生长直到OD600值达到0.6，得到农杆菌菌液，然后用MS液体培养基稀释30倍，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，作为感染培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中具体是将预培养后的叶盘浸泡于感染培养基中10分钟，取出外植体，用灭菌滤纸吸干外植体表面的菌液，将浸泡过的外植体接种到SR培养基中在25℃在黑暗条件下共培养2天，直至在培养基上看到菌斑。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，
将共培养后的外植体转入筛选培养基，在25℃黑暗条件下培养三周，将得到的抗性芽从愈伤组织上转移到芽伸长培养基进行抗性芽的拉长培育，当拉长的抗性芽高度达到2厘米时，转入生根培养基中培养20天，得到转化植株。
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