CN101803574B - 果蔗腋芽脱毒组培快繁方法 - Google Patents

果蔗腋芽脱毒组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及甘蔗脱毒组培技术领域。提出一种果蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于包括如下步骤：1)植体的选取与灭菌；2)腋芽诱导培养；3)分化培养；4)增殖培养；5)生根培养；6)移栽；7)病毒(菌)检测。其特征在于步骤3)中的分化培养基配方为：MS+TDZ(0.001～0.01)mg/L+IBA(0.02～0.05)mg/L+蔗糖(30～40)g/L+精氨酸(100～150)mg/L+肌醇(100～150)mg/L。本发明以果蔗腋芽为外植体，接种操作容易，成活率高达90％以上。所采用的分化培养基配方，在分化培养过程中能快速使诱导芽分化出丛芽，采用本发明繁殖果蔗脱毒苗速度快，月繁殖系数达5～10倍，适合于大规模工厂化生产。

Description

果蔗腋芽脱毒组培快繁方法
技术领域
本发明涉及甘蔗脱毒组培技术领域。
背景技术
甘蔗(含果蔗)宿根矮化病在中国主产蔗区及世界各地蔗区广泛发生已有多年，导致品种种性退化，严重影响甘蔗品质和产量。
获得甘蔗无病毒(菌)植株的方法有多种，例如热处理脱毒(菌)、茎尖培养脱毒(菌)和愈伤组织培养脱毒以及组合方法。其中普遍采用的较好方法为茎尖培养脱毒(菌)法，具体步骤是：通过蔗株顶端分生组织切取茎尖(0.2mm以下分生组织)、诱导产生幼芽、长成小植株获得脱毒苗。茎尖分生组织脱毒法存在的问题是：要切取很微小(0.2mm以下)的茎尖分生组织，需在显微镜下操作，具有一定难度；而且，切取茎尖组织越小，褐化率越高、成活率就越低，而切取茎尖组织偏大，又不能完全脱除病毒(菌)，同时容易造成污染；因此，生产上迫切需要一种更好的方法来满足甘蔗或果蔗脱毒(菌)组培快繁的需要。
发明内容
本发明目的是提出一种果蔗脱毒组培快繁方法，以切取较大的果蔗植株腋芽为外植体，先诱导腋芽萌动，再分化形成完整植株，其能够在短期内而且较为容易获得大量的无病毒(菌)果蔗组培苗，克服茎尖分生组织脱毒(菌)法存在的操作难度大、成活率低、生产成本偏高等问题。
本发明的目的通过以下技术方案来实现。
一种果蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)植体的选取与灭菌：取果蔗的腋芽，经灭菌处理后，作为所用外植体；
2)腋芽诱导培养：将步骤1)处理后的腋芽在无菌条件下，摘取腋芽组织，接种在腋芽诱导培养基上，诱导芽生成；
3)分化培养：将步骤2)形成的诱导芽移至分化培养基分化出丛芽；
4)增殖培养：将步骤3)分化形成的丛芽切成每2～3株为一组接在增殖培养基中，再分化出丛芽；
5)生根培养：将步骤4)增殖形成的丛芽切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，生根组培苗生成；
6)移栽：当步骤5)的生根组培苗生长至3～5cm时，将生根组培苗移栽于移栽基质培养至成苗；
7)病毒(菌)检测：利用PCR技术对步骤5)的成苗进行RSD菌检测。
其特征在于步骤3)中的分化培养基配方为：
MS+TDZ(0.001～0.01)mg/L+IBA(0.02～0.05)mg/L+蔗糖(30～40)g/L+精氨酸(100～150)mg/L+肌醇(100～150)mg/L。
本发明具有如下突出的实质性特点和显著进步：
1)本发明以果蔗腋芽为外植体，培养时，取材的体积较大(2～3mm)，接种操作容易，成活率高达90％以上。
2)本发明采用的分化培养基配方，在分化培养过程中能快速使诱导芽分化出丛芽，采用本发明繁殖果蔗脱毒苗速度快，月繁殖系数达5～10倍，适合于大规模工厂化生产。
附图说明
图1为本发明的实施例检测结果(琼脂糖凝胶电泳图)。
检测对照材料：以甘蔗宿根矮化病菌分离培养菌株、带病菌植株为材料。(目的片段约256bp)
图片说明：1、15为DL2000，2为RSD菌株，3为清水对照，4为带RSD菌果蔗植株，5-14为随机抽取的十株果蔗腋芽组培苗。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种果蔗脱毒组培快繁的方法，按如下步骤进行：
1)外植体的选取与灭菌：于7～11月，取果蔗的腋芽，经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％汞溶液处理3～4min后，无菌水冲洗3～5次。
2)腋芽诱导培养：将步骤1)处理后的腋芽在无菌条件下，摘取2～3mm的腋芽，小心去除叶鞘，接种在液态腋芽诱导培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.02mg/L+活性炭1g/L+蔗糖30g/L+精氨酸100mg/L+肌醇100mg/L+琼脂5g/L)的上，诱导芽生成。
3)分化培养：将步骤2)诱导形成的诱导芽移至分化培养基(MS+TDZ 0.003mg/L+IBA 0.02mg/L+蔗糖30g/L+精氨酸100mg/L+肌醇100mg/L+琼脂5g/L)上诱导出丛芽。
4)增殖培养：将步骤3)增殖形成的丛芽切成每2～3株为一组接在增殖培养基(MS+6-BA 0.8mg/L+IBA 0.02mg/L+琼脂5g/L+蔗糖30g/L+精氨酸100mg/L+肌醇100mg/L)中，再分化出丛芽。
5)生根培养：将步骤4)增殖形成的丛芽切成单株接种在生根培养基(MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂5g/L+蔗糖50g/L+多效唑0.5mg/L)中进行生根培养，诱导出根，生根组培苗生成。
6)移栽：当步骤5)的生根组培苗长至3～5cm时，将生根组培苗移栽于移栽基质(泥炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3.5∶1∶2.5)中，培养成苗。
7)病毒(菌)检测：利用PCR扩增技术对步骤6)的成苗进行RSD菌检测，检测结果见图1，从图中可以看出，本发明培殖的组培苗不含RSD菌。
各种培养基中的MS为基本培养基(含蔗糖30g/L，琼脂5g/L，PH值为6.2)。
实施例2
一种果蔗脱毒组培快繁的方法，按如下步骤进行：
1)植体的选取与灭菌：于7～11月，取果蔗的腋芽，经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％的汞溶液处理3～4min后，无菌水冲洗3～5次。
2)腋芽诱导培养：将步骤1)处理后的腋芽在无菌条件下，摘取2～3mm的腋芽，小心去除叶鞘，接种在腋芽诱导培养基(MS+6-BA 0.8mg/L+IBA 0.04mg/L+活性炭1.8g/L+精氨酸150mg/L+肌醇130mg/L)上，诱导芽生成。
3)分化培养：将步骤2)诱导形成的诱导芽移至分化培养基(MS+TDZ 0.008mg/L+IBA0.04mg/L+蔗糖35g/L+精氨酸120mg/L+肌醇130mg/L)的上，诱导出丛芽。
4)增殖培养：将步骤3)增殖形成的丛芽切每成2～3株为一组接在增殖培养基(MS+6-BA1.2mg/L+IBA0.05mg/L+精氨酸140mg/L+肌醇140mg/L+蔗糖25g/L)中，再分化出丛芽。
5)生根培养：将步骤4)增殖形成的丛芽切成单株接种在生根培养基(MS+IBA0.4mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖40g/L+多效唑0.8mg/L)中进行生根培养，诱导出根，生根组培苗生成。
6)移栽：当步骤5)的生根组培苗长至3～5cm时，将生根组培苗移栽于移栽基质(泥炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶2)中，培养成苗。
7)病毒(菌)检测：利用PCR扩增技术对步骤6)的成苗进行RSD菌检测，检测结果与实施例一相同。
各种培养基中的MS为基本培养基(含蔗糖35g/L，琼脂8g/L，PH值为5.8)。

Claims (3)

1.果蔗腋芽脱毒组培快繁的方法，包括如下步骤：
1)外植体的选取与灭菌：取果蔗的腋芽，经灭菌处理后，作为所用外植体；
2)腋芽诱导培养：将步骤1)处理后的腋芽在无菌条件下，摘取2～3mm的腋芽，接种在腋芽诱导培养基上，诱导芽生成；
3)分化培养：将步骤2)的诱导芽移至分化培养基分化出丛芽；
4)增殖培养：将步骤3)分化形成的丛芽切成每2～3株为一组接在增殖培养基中，再分化出丛芽；
5)生根培养：将步骤4)增殖形成的丛芽切成单株接在生根培养基中进行生根培养，长成生根组培苗；
6)移栽：当步骤5)的生根组培苗生长至3～5cm时，将生根组培苗移栽于移栽基质培养至成苗；
7)病菌检测：利用PCR技术对步骤6)的成苗进行RSD菌检测；
其特征在于步骤2)中采用的腋芽诱导培养基配方为：
MS+6-BA(0.5～1)mg/L+IBA(0.02～0.05)mg/L+活性炭(1～2)g/L+精氨酸(100150)mg/L+肌醇(100～150)mg/L；
步骤3)中的分化培养基配方为：
MS+TDZ(0.001～0.01)mg/L+IBA(0.02～0.05)mg/L+蔗糖(30～40)g/L+精氨酸(100～150)mg/L+肌醇(100～150)mg/L；
步骤4)中的增殖培养基配方为：
MS+6-BA(0.5～1.5)mg/L+IBA(0.02～0.05)mg/L+蔗糖(20～40)g/L+精氨酸(100～150)mg/L+肌醇(100～150)mg/L；
步骤5)中的生根培养基的配方为：
MS+IBA(0.2～0.5)mg/L+NAA(0.1～0.2)mg/L+蔗糖(30～50)g/L+多效唑(0.5～1)mg/L。
2.如权利要求1所述的果蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于步骤6)中的移栽基质为：泥炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3～4∶1∶2～3。
3.如权利要求1或2所述的果蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于：
步骤1)中所述的灭菌处理是将外植体经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％汞溶液灭菌3～4min，最后用无菌水冲洗3～5次。
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